CC BY
78
УДК 539.21
ВЛИЯНИЕ ХИМИЧЕСКОМ ОБРАБОТКИ НА ТОПОГРАФИЮ ПОВЕРХНОСТИ СТЕКЛА ПРИ ЕГО ПОДГОТОВКЕ К ИММОБИЛИЗАЦИИ
БИОМОЛЕКУЛ
© А. Х. Аюпова1*, Р. Р. Гарафутдинов1, А. В. Чемерис1, Р. Ф. Талипов2
1 Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
2Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Е-таіІ: tuktamyshevaa@mail.ru
Эффективность биосенсоров как аналитических устройств определяется во многом свойствами поверхности подложки, такими как химическая однородность и шероховатость. В данной работе представлены результаты исследования топографии поверхности стекла — материала, наиболее применимого при изготовлении биосенсоров. Методами атомно-силовой микроскопии на воздухе и в реальном времени визуализирована поверхность стекол, соответствующих различным этапам химической предобработки. Показано, что в ходе обработки топография поверхности изменяется вследствие вовлечения поверхностных слоев в процессы растворения, конденсации и сорбции. Установлено, что обработка стекла минеральными реагентами увеличивает шероховатость поверхности на микроуровне и уменьшает на наноуровне. Сформулированы рекомендации по подготовке стеклянных подложек для иммобилизации на них биомолекул.
Ключевые слова: стекло, химическая модификация поверхности, шероховатость поверхности, атомно-силовая микроскопия
Введение
Важной составляющей современных биочипо-вых технологий является подготовка подложки для иммобилизации биомолекул, заключающаяся в химической обработке и модификации поверхности. В настоящее время для изготовления биочипов общепринято использовать стекло, относительная химическая инертность и возможность функциона-лизации которого делают его удобным материалом, позволяющим осуществлять закрепление молекул на поверхности. Иммобилизация биомолекул на стекле возможна после химической модификации поверхности, включающей генерацию свободных силанольных групп и обработку органическими соединениями с образованием на поверхности активных функциональных групп [1].
Химическая обработка изменяет топографию поверхности, нередко в сторону ухудшения ее свойств. На сегодняшний день изучение химической природы поверхности осуществляют классическими физико-химическими методами анализа. Однако они не дают информации о топографии поверхности, и в этом плане сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) является незаменимым методом [2]. Наиболее активно для изучения модифицированных поверхностей применяется атомно-силовая микроскопия (АСМ), позволяющая проводить измерения в том числе в жидкой среде, что открывает принципиально новые возможности для исследования физикохимических процессов на границе жидкость-твердое тело. Путем последовательного получения in situ АСМ-изображений одного и того же участка поверхности можно в реальном времени наблюдать за трансформацией поверхности твердого тела при его травлении или растворении [3].
Для изготовления биочипов используют обычные силикатные стекла, для которых достаточно подробно исследованы структурные особенности поверхности. Так, было показано, что топография поверхности изменяется в зависимости от условий обработки стекла силанами [4]. Шероховатость плавленых стекол определяется их поверхностным натяжением в жидкой фазе, а минимальная наблюдаемая шероховатость прессованной поверхности - размером гомологичных фрагментов в структуре стекла [5]. Обработка органическими соединениями может улучшать механические, химические, калориметрические, биохимические и другие свойства стекол [6]. Целью настоящей работы стало исследование методами атомно-силовой микроскопии топографии поверхности стеклянных подложек, применяемых при изготовлении биосенсоров, на всех этапах их химической обработки.
Экспериментальная часть
В качестве стеклянных подложек использовали нарезки предметного стекла для микроскопии размером 1x1 см фирмы Меше1 (Германия). Стекла обрабатывали поэтапно:
1) очищали бытовыми моющими средствами, высушивали на воздухе при комнатной температуре (тип I);
2) очищали бытовыми моющими средствами, высушивали 3 ч при 130 °С (тип II);
3) стекла типа I выдерживали в 10%-ном водном растворе КОН в течение 1 ч, промывали водой (3x50 мл), высушивали 3 ч при 130 °С (тип III);
4) стекла типа II выдерживали в 10%-ном водном растворе КОН в течение 20 мин с одновременной обработкой ультразвуком частотой 44 кГц, промывали водой (3x50 мл), высушивали 3 ч при 130 °С (тип IV);
* автор, ответственный за переписку
5) стекла типа III выдерживали 1 ч в «пиранье» (H7.SO4<*ohto:H7.O7(*oh,0 1:1), промывали водой (3x50 мл), высушивали 3 ч при 130 “С (тип V);
6) стекла типа I выдерживали 1 ч в «пиранье», промывали водой (3x50 мл), высушивали 3 ч при 130 “С (тип VI);
7) стекла типа V выдерживали в 5%-ном растворе 3-аминопропилтриэтоксисилана (APTES) в ацетоне в течение 18 ч, промывали ацетоном (1x50 мл), водой (3x50 мл), высушивали 5 ч при 120 “С (тип VII).
АСМ-изображения получены на сканирующем зондовом микроскопе Solver PRO-M с помощью ПО «Nova» версии 857 (NT-MDT, Россия) в контактном режиме с использованием пьезокерамических сканеров на 3 и 50 мкм и кантилеверов CSG01 (жесткость 0.03 Н/м, радиус кривизны зонда 10 нм). АСМ-изображения в режиме реального времени получены с использованием жидкостной ячейки и модуля «Смена». В жидкостную ячейку заливали: 1) при щелочной обработке - 5%-ный водный раствор KOH; 2) при кислотной обработке - 5%-ный водный раствор H2SO4; 3) при силанизации - 5%-ный раствор APTES в ацетоне. Обработку изображений проводили с помощью встроенного пакета программ «Image Analysis».
Результаты и обсуждение
Однозначность результатов, получаемых с помощью биочипов, во многом зависит от прочности иммобилизации биомолекул, т.е. от гидролитических характеристик привитого молекулярного слоя, определяющихся, в свою очередь, свойствами подложки, среди которых немаловажную роль играет морфология (рельеф) поверхности. Очевидно, что при учете взаимосвязи «рельеф - гидролитическая стойкость» следует рассматривать морфологию поверхности на уровне, близком к молекулярному, т.е. в нано- и субнаномасштабах. К сожалению, в настоящее время полномасштабные исследования морфологии стеклянных подложек при их предпод-готовке к иммобилизации биомолекул отсутствуют.
Стеклянные подложки для иммобилизации бимолекул могут быть изготовлены из стекла различных сортов, поскольку в ходе химической модификации на их поверхности образуются структуры, аналогичные таковым для кремнезема. В данной работе были взяты предметные стекла для микроскопии, близкие по составу оконному (на-трий-кальциевое силикатное), химическую обработку которых осуществляли согласно традиционной схеме I, включающей три ключевых стадии: действие щелочи, кислоты и органического модификатора (силана).
Варьирование условий обработки позволило получить семь типов стекол (I-VII). Стекла типа I очищены обычными моющими средствами и высушены на воздухе при комнатной температуре. Стекла II обработаны таким образом, чтобы была удалена физически сорбированная вода, но не затронуты поверхностные силанольные группы. Стекла III выдержаны в водном растворе щелочи
для удаления с поверхности возможных жировых загрязнений и раскрытия силоксановых мостиков. Стекла IV также выдержаны в растворе щелочи с одновременной обработкой ультразвуком для оценки его влияния на характер получающейся поверхности. Стекла V подвергали последовательному действию щелочи, а затем «пираньи», приводящему к удалению возможных органических загрязнений и генерации свободных силанольных групп. Для стекол VI, в отличие от V, был пропущен этап обработки водным раствором щелочи с целью оценки его влияния на характер поверхности. Стекла VII представляют собой образцы, прошедшие стандартный при производстве подложек для биочипов цикл химической предобработки и функцио-нализации. Их поверхность очищена, на ней создается в идеальном случае монослой органических молекул, несущих первичные аминогруппы, по которым возможна дальнейшая ковалентная иммобилизация биомолекул.
Стекла каждого типа визуализировали в контактном режиме атомно-силовой микроскопии на воздухе. В этом случае зонд сканирует подложку, повторяя изгибы рельефа. На рис. 1 приведены наиболее типичные АСМ-изображения поверхностей.
Для необработанных стекол (тип I) характерно наличие таких особенностей рельефа, как борозды (микроцарапины), небольшие возвышенные участки, гладкие образования. Общая поверхность стекол II визуализируется как более ровная с появлением возвышающихся объектов относительно равной величины и хаотичным распределением. Данное обстоятельство можно объяснить удалением в ходе сушки физически сорбированной воды, которая, вероятно, в случае стекол I образует слой, препятствующий достоверной визуализации их поверхности. На стеклах, обработанных щелочью (III), наблюдаются объекты, которые, возможно, представляют собой кристаллические включения мела, внедренные в аморфную матрицу стекла при его варке. При увеличении времени действия щелочи данные частицы утрачивают угловатость. Одновременная обработка щелочью и ультразвуком приводит к характерному изменению рельефа (IV), заключающемуся в исчезновении мелких шероховатостей при увеличении абсолютного разброса высот (сглаживание на наноуровне и увеличение шероховатости на микроуровне). При действии кислотных реагентов на поверхности генерируются объекты средних и мелких размеров, преимущественно заостренной формы (V, VI). Скорее всего, они являются кристаллическими включениями кварца, который, в отличие от соды и мела, слабо подвержен действию кислот. Топография поверхности стекол V и VI практически не отличается, что свидетельствует о нивелировании последствий щелочной обработки при действии кислоты. Обработка поверхности АРТЕ8 приводит к существенному выравниванию поверхности, что можно объяснить образованием полимолекулярных слоев модификатора (VII).
Схема 1
тіш IV типы V и VI тіш VII
Рис. 1. АСМ-изображения поверхности стекол.
Таблица 1
Морфологические характеристики поверхности обработанных стекол, определенные с использованием встроенного пакета
программ «Image Analysis».
Тип стекла Средняя высо- Средняя арифметическая Средняя квадратическая средний разброс
та, нм шероховатость шероховатость высот, нм
I 17.57 2.79 3.56 15.40
II 22.49 2.67 4.27 10.28
III 25.18 4.26 5.30 9.59
IV 57.53 8.01 10.31 171.89
V 36.71 3.80 5.39 15.55
VI 51.46 7.62 10.01 12.92
VII 25.04 1.81 2.26 7.45
Следует отметить, что топография поверхности заметно варьирует в пределах образцов одного типа и зависит даже от области сканирования на одной и той же подложке. В связи с этим возникают затруднения при однозначном определении количественных характеристик поверхности и есть возможность оценить лишь некоторые морфологические параметры (табл. 1).
Так, чистое стекло (I) имеет более ровную поверхность по сравнению с обработанными минеральными агентами. По-видимому, это обусловлено тем, что относительно гладкая вследствие аморфной природы стекла изначальная поверхность подвергается размыванию и деградации после обра-
ботки. Выдерживание в кислоте не оказывает такого разрушающего действия, как в щелочи. Силани-зация приводит к относительному выравниванию вследствие заполнения углублений на поверхности за счет образования полимолекулярных органических слоев.
Более адекватным при анализе изменений поверхности стекла представляется подход, заключающийся в визуализации одной и той же области в реальном времени. Для отслеживания действия реагентов на стекло было осуществлено сканирование в жидкостной ячейке непосредственно в ходе обработки. Получены серии сканов для трех основных типов воздействия: растворами щелочи, кисло-
ты и ЛРТЕ8. В случае щелочного раствора наблюдается постепенное изменение поверхности, при этом мелкие неровности уменьшаются, на их фоне крупные вырисовываются более четко. В приведенном на рис. 2 примере видно, что изначально имевшийся достаточно крупный объект неправильной формы приобретает все более четкие очертания, как будто происходит растворение поверхностного слоя стекла, не затрагивающее данное образование. Возможно, оно представляет собой кристалл мела, практически не растворяющегося в щелочи.
Анализ морфологических характеристик:
арифметической и квадратической шероховатости, размаха высот, среднего значения высоты и асимметрии для данного типа обработки показывает, что
в начальный период (до 10-15 мин) происходит более значительное изменение указанных величин, что объясняется установлением равновесия термодинамических параметров поверхности (количественные параметры не приведены). Наиболее заметным является сглаживание (растворение) выступающих участков поверхности небольшого размера, о чем свидетельствует быстрое снижение величины размаха высот, в то время как среднее значение высоты уменьшается медленнее. Растворение углублений происходит с наименьшей скоростью, о чем свидетельствует постоянство асимметрии высот.
Для кислотной обработки значительное изменение рельефа менее характерно, хотя, как и для раствора щелочи, происходит постепенное сглаживание мелких шероховатостей (рис. 3).
Рис. 2. Изменение топографии поверхности стекла при выдерживании в растворе щелочи (15x15 мкм).
54.00 мин. 67.50 мин. 81.00 мин. 94.50 мин.
Рис. 3. Изменение топографии поверхности стекла при выдерживании в растворе кислоты (15x15 мкм).
0.00 мин. 8.10 мин. 16.20 мин. 24.30 мин
32.40 мин. 40.50 мин. 48.60 мин. 56.70 мин.
Рис. 4. Изменение топографии поверхности стекла при выдерживании в растворе ЛРТЕ8 (10x10 мкм).
В целом, кислота медленно размывает поверхность, при этом преимущественно размываются вершины холмов, что обусловливает рост асимметрии. Характер спада шероховатостей первого и второго порядков усреднения одинаков, что также свидетельствует о сглаживании вершин (количественные параметры не приведены).
Принципиально иная картина наблюдается при обработке поверхности АРТЕ8 (рис. 4). Данный реагент, в отличие от щелочи и кислоты, не вызывает растворения поверхностных слоев стекла. Напротив, за счет взаимодействия с силанольными группами он образует на поверхности привитые слои полимо-лекулярной природы. Очевидно, что за счет модифицирования АРТЕ8 топография поверхности изменяется. Анализ изменения морфологии показывает, что под действием АРТЕ8 величина размаха высот растет очень быстро при незначительном росте среднего значения высоты (количественные параметры не приведены). Это свидетельствует об образовании на поверхности холмистых структур, разрастающихся по всем трем осям практически с равной скоростью, что подтверждается постоянством асимметрии. Данное наблюдение неудовлетворительно согласуется с результатами АСМ-экспериментов «в конечной точке», согласно которым обработка АРТЕ8 приводит к существенному выравниванию поверхности. Возможно, это несоответствие объясняется отсутствием этапа высушивания при сканировании в реальном времени, которое, вероятно, способствует значительному уменьшению шероховатости за счет различного типа перестроек приповерхностных молекулярных слоев. Несмотря на результаты реал-тайм эксперимента, считаем, что при обработке стекла силанами следует придерживаться традиционной схемы, поскольку только относительно длительное (в нашем случае 18 ч) выдерживание обеспечивает образование стабильного
слоя модификатора, способствующего прочному закреплению биомолекул.
Таким образом, с помощью атомно-силовой микроскопии показано, что в ходе химической обработки топография поверхности стекла существенно изменяется вследствие вовлечения поверхностных слоев в процессы растворения, конденсации и сорбции. При этом на шероховатость поверхности в наибольшей степени влияет воздействие водной щелочи, увеличивая ее на микроуровне, в то время как в случае кислотной обработки шероховатость меняется не столь значительно. Модификация ЛРТЕ8 с последующей термической обработкой приводит к выравниванию поверхности. Вероятно, другие органические модификаторы группы сила-нов обладают схожим эффектом.
Исходя из полученных результатов, представляется логичным откорректировать стандартную методику обработки стеклянных подложек с целью повышения однородности шероховатости на наноуровне после конечного этапа (силанизации). Во-первых, обработка щелочью необязательна, поскольку действие кислоты нивелирует ее последствия. Кроме того, считаем, что кислота генерирует количество силанольных групп, достаточное для создания эффективных биочипов. Во-вторых, кислотная обработка должна длиться не более 1 ч с целью предотвращения нежелательного изменения рельефа поверхности. В связи с этим примерная последовательность подготовки неорганических стекол к иммобилизации биомолекул может выглядеть следующим образом: 1) бережная очистка бытовыми моющими средствами, 2) выдерживание в «пиранье» до 1 ч, затем трехкратная отмывка от кислоты достаточным объемом воды высшей категории качества, 3) высушивание при 130 °С в течение 3 ч, 4) выдерживание в 5%-ном растворе ЛРТЕ8 в ацетоне в течение 18 ч, затем последова-
тельная отмывка достаточным объемом ацетона и воды, 5) высушивание в течение 5 ч при 120 °С.
Работа поддержана Министерством образования и науки РФ (контракт №16.518.11.7047).
ЛИТЕРАТУРА
1. Гарафутдинов Р. Р., Шепелевич И. С., Чемерис А. В., Талипов Р. Ф. Химические аспекты создания ДНК-чипов // Вестн Башкирск. ун-та. 2005. №1. С. 49-54.
2. Миронов В. Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии. / Учеб. пособие. Нижний Новгород: Изд-во РАН ИФМ, 2004. 110 с.
3. Drake B., Prater C. B., Weisenhorn A. L., Gould S. A. C., Albrecht T. R., Quate C. F., Cannell D. S., Hansma H. G.,
Hansma P. K. Imaging crystals, polymers, and processes in water with the atomic force microscope // Science. 1989. V. 243. P. 1586-1589.
4. Tatte T., Saal K., Kink I., Kurg A., ^[mus R., Mаeorg U., Rahi M., Rinken A., ^[mus A. Surface Preparation of smooth siloxane surfaces for AFM visualization of immobilized biomolecules // Science. 2003. V. 532-535. P. 10851091.
5. Gupta P.K. Inniss D., Kurkjian Ch.R., Zhong Q. Nanoscale roughness of oxide glass surfaces // Journal of Non-Crystalline Solids. 2000. V. 262. P. 200-206.
6. Sytnik R. D., Doronina A., Tolstousova O. V. Organic compounds in glass modification technology // Glass and Ceramics. 2001. V. 58. P. 11-12.
Поступила в редакцию 01.11.2012 г.
