CC BY
10
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Влияние Helicobacter pylori и вируса Эпштейна-Барр на изменение экспрессии транскрипционных, ростовых факторов, PD-1, PD-L1, PD-L2 и белка LC3B в ткани рака желудка
Августинович А.В.1, Спирина Л.В.1, 2, Афанасьев С.Г.1, Волков М.Ю.1, Доспан А.Б.2
1 Научно-исследовательский институт онкологии, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук», 634050, г. Томск, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 634050, г. Томск, Российская Федерация
Рак желудка (РЖ) занимает 3-е место в мире по показателю смертности среди злокачественных новообразований различных локализаций. Хроническое воспаление является независимым фактором риска для данной патологии. Самыми распространенными инфекционными агентами РЖ являются Helicobacter pylori и вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ).
Цель исследования - изучение экспрессии транскрипционных, ростовых факторов, компонентов AKT/ mTOR сигнального пути, а также белка LC3B ткани опухоли желудка в зависимости от инфицирования H. pylori и ВЭБ.
Материал и методы. В исследование включены 55 больных операбельным РЖ, получивших комбинированное лечение в абдоминальном отделении клиник НИИ онкологии Томского НИМЦ. Пациенты были распределены на группы в зависимости от наличия установленной методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени инфекции H. pylori и ВЭБ. Сформированы 4 группы: 1-я группа - больные с ДНК H. pylori в ткани опухоли (n=10); 2-я группа - пациенты без ДНК H. pylori в ткани опухоли (n=45); 3-я группа - больные с ДНК ВЭБ в ткани опухоли (n=5); 4-я группа - пациенты без ВЭБ в ткани опухоли (n=50). Сочетанная инфекция на основании обнаружения ДНК H. pylori и ВЭБ диагностирована у 4 больных.
Экспрессию молекулярных показателей оценивали методом ПЦР в реальном времени. Содержание белка LC3B определяли методом вестерн-блоттинга. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 12.0.
Результаты и обсуждение. Пациенты в исследуемых группах не различались между собой по размеру опухоли, вовлеченности регионарных лимфатических узлов. Однако в случае инфицирования H. pylori и при сочетанном обнаружении с ДНК ВЭБ отмечены увеличение числа больных с низкодифференцирован-ными опухолями и сниженный ответ опухоли на неоадъювантную химиотерапию.
Выявлено увеличение экспрессии CAIX в 18,5 раза при наличии ДНК H. pylori, а при сочетанной инфекции данный показатель повышался в 22,1 раза по сравнению с пациентами без инфекции. У больных с ДНК H. pylori выявлен рост экспрессии PTEN в 1,6 раза по сравнению с больными без инфицирования H. pylori, что свидетельствовало об активации молекулярных сигнальных каскадов.
При наличии ДНК ВЭБ отмечено снижение экспрессии mTOR в 4,77 раза, а при сочетанном выявлении ДНК H. pylori и ВЭБ - в 6,35 раза по сравнению с больными, у которых не выявлены ДНК изучаемых инфекций. Выявленные факты указывают на вовлеченность изменения экспрессии компонентов сигнальных каскадов под влиянием ВЭБ, в том числе в случае сочетанной инфекции, которые могут быть связаны с агрессивностью раковых клеток.
Ключевые слова:
рак желудка; Helicobacter pylori; вирус Эпштейна-Барр; транскрипционные факторы; ростовые факторы; PD-1; PD-L1; PD-L2; LC3B
В настоящее время иммуногенность опухоли связывают с рецепторами и лигандами программируемой клеточной гибели PD-1, PD-L1 и PD-L2, что в проведенном исследовании не отмечено.
Стоит отметить изменение экспрессии и содержания белка LC3B. При инфекции H. pylori и ВЭБ (группы 2 и 4) показан рост экспрессии и уровня LC3B в 2,8; 1,5 и 5,8 и 1,67 раза соответственно по сравнению с неинфи-цированными больными (группы 1 и 3). При этом при сочетанной инфекции в случае выявления ДНК обеих инфекций отмечался рост только белка в 1,65 раза по сравнению с инфицированными больными.
Заключение. Полученные данные подтверждают вовлеченность H. pylori и ВЭБ в молекулярные механизмы развития злокачественных новообразований желудка. В проведенном исследовании у незначительной части больных с РЖ при обнаружении ДНК H. pylori и ВЭБ возможно быстрое развитие опухолевой прогрессии за счет активации аутофагии, ангиогенеза, что подтверждается большим количеством пациентов с низкодифференцированными опухолями и увеличением количества пациентов со сниженным ответом опухоли на проведенное лечение.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов
Вклад авторов. Идея и концептуальное решение - Афанасьев С.Г.; дизайн исследования - Спирина Л.В.; сбор и обработка материала - Доспан А.Б.; выполнение исследований - Волков М.Ю., Августинович А.В.; оформление и редактирование текста - Спирина Л.В.
Для цитирования: Августинович А.В., Спирина Л.В., Афанасьев С.Г., Волков М.Ю., Доспан А.Б. Влияние Helicobacter pylori и вируса Эпштейна-Барр на изменение экспрессии транскрипционных, ростовых факторов, PD-1, PD-L1, PD-L2 и белка LC3B в ткани рака желудка // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2023. Т. 12, № 2. С. 14-22. DOI: https://doi. org/10.33029/2305-3496-2023-12-2-14-22
Статья поступила в редакцию 08.11.2022. Принята в печать 28.03.2023.
The effect of Helicobacter pylori and Epstein-Barr virus on changes in the expression of transcription, growth factors, PD-1, PD-L1, PD-L2 and LC3B protein in gastric cancer tissue
Avgustinovich A.V.1, Spirina L.V.12, Afanas'ev S.G.1, Volkov M.Yu.1, Dospan A.B.
1 Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences, 634050, Tomsk, Russian Federation
2 Siberian State Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation, 634050, Tomsk, Russian Federation
Gastric cancer (GC) ranks 3rd in the world in terms of mortality among malignant neoplasms of various localizations. Chronic inflammation is an independent risk factor for this pathology. The most common infectious agents for stomach cancer are Helicobacter pylori (H. pylori) and Epstein-Barr virus (EBV).
The aim of the study was to study the transcription, growth factors, components of the AKT/mTOR signaling pathway expression, as well as the LC3B protein of gastric tumor tissue depending on infection with H. pylori and EBV.
Material and methods. The study included 55 patients with operable GC who received combined treatment in the Department of abdominal oncology, clinics of the Cancer Research Institute of TNRMC. Patients were divided into groups depending on the presence of H. pylori infection and EBV. 4 groups were formed: group 1 represented by patients with the presence of H. pylori DNA in tumor tissue (n=10), group 2 - patients without H. pylori DNA in tumor tissue (n=45), group 3 - patients with the presence of EBV DNA in tumor tissue (n=5), group 4 - patients without EBV in tumor tissue (n=50). Combined infection by detection DNA of H. pylori and EBV were diagnosed in 4 patients, 51 people were a group of patients without a combined infection.
The molecular parameters expression was evaluated by real-time PCR. The LC3B protein content was evaluated by Western blotting. The DNA of H. pylori and EBV in tumor tissue was detected using real-time PCR.
Results and discussion. Patients in the study groups did not differ in tumor size, involvement of regional lymph nodes. However, in the case of H. pylori infection and with combined detection with EBV DNA, there was an increase in the number of patients with low-grade tumors and a reduced tumor response to neoadjuvant chemotherapy.
An 18.5-fold increase in CAIX expression was revealed in the presence of H. pylori DNA, and in case of combined infection, this indicator increased 22.1-fold compared to patients without infection. In patients with the presence of H. pylori DNA, an increase in PTEN expression was revealed by 1.6 times compared with patients without H. pylori infection, which indicated the activation of molecular signaling cascades.
Keywords:
gastric cancer; Helicobacter pylori; Epstein-Barr virus; transcriptional factors; growth factors; PD-1; PD-L1; PD-L2; LC3B
2
It was noted in the presence of EBV DNA with a decrease in mTOR by 4.77 times and with combined -AKT by 6.35 times compared with patients who did not have DNA of the studied infections. The revealed facts indicate the involvement of changes in the expression of components of signaling cascades under the influence of EBV, including in the case of combined infection, which may be associated with the aggressiveness of cancer cells.
Currently, the immunogenicity of the tumor includes receptors and ligands of programmed cell death PD-1, PD-L1 and PD-L2, which was not noted in the study.
It is worth noting the change in the expression and content of the LC3B protein. With H. pylori and EBV infection (group 2 and 4), an increase in expression and content of the indicator was shown by 2.8; 1.5 and 5.8; 1.67 times, consequently, compared with non-infected patients (group 1 and 3). At the same time, with a combined infection, in the case of DNA detection of both infections, there was an increase in protein alone by 1.65 times compared with infected patients.
Conclusion. The data obtained confirm the involvement of H. pylori and EBV in the molecular mechanisms of the development of malignant neoplasms of the stomach. In the conducted study, in a small part of patients with stomach cancer, when detecting H. pylori and EBV DNA may rapidly develop tumor progression due to the activation of autophagy, angiogenesis, which is confirmed by a large number of patients with low-grade tumors and an increase in the number of patients with a reduced tumor response to treatment.
Funding. The study had no sponsor support.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Contribution. Idea and conceptual solution - Afanas'ev S.G.; design and research - Spirina L.V.; material collection - Dospan A.B.; research execution - Volkov M.Yu., Avgustinovich A.V.; text design and editing - Spirina L.V.
For citation: Avgustinovich A.V., Spirina L.V., Afanas'ev S.G., Volkov M.Yu., Dospan A.B. The effect of Helicobacter pylori and Epstein-Barr virus on changes in the expression of transcription, growth factors, PD-1, PD-L1, PD-L2 and LC3B protein in gastric cancer tissue. Infektsionnye bolezni: novosti, mneniya, obuchenie [Infectious Diseases: News, Opinions, Training]. 2023; 12 (2): 14-22. DOI: https://doi.org/10.33029/2305-3496-2023-12-2-14-22 (in Russian) Received 08.11.2022. Accepted 28.03.2023.
Рак желудка (РЖ) в течение многих лет занимал первые позиции в структуре злокачественных новообразований [1]. Согласно современным представлениям, РЖ - это генетически гетерогенное заболевание, в возникновении, росте и прогрессировании которого участвует несколько различных патофизиологических механизмов [2].
Значимым инфекционным агентом в развитии РЖ является Helicobacter pylori, которая опосредует онкогенез в клетках желудка [3]. Считается, что инфекция H. pylori и клиническая стадия болезни могут увеличить риск смерти больных РЖ [4]. Наличие H. pylori - один из независимых факторов риска прогрессирования и прогноза при РЖ [5].
Вторым инфекционным агентом, который, возможно, опосредует развитие РЖ, является вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ). ВЭБ ассоциируют с возникновением отдельной группы опухолей с манифестированием мутаций значимых онкогенов и онкосупрессоров [6]. Сообщалось, что РЖ, ассоциированный с ВЭБ, связан с хроническим воспалением эпителия желудка, вызванным H. pylori [7].
Кроме того, персистирующая сочетанная инфекция H. pylori и ВЭБ способствует агрессивному течению РЖ. Молекулярные механизмы, лежащие в основе агрессивности H. pylori и ВЭБ-опосредованного РЖ, изучены недостаточно. Установлено, что коинфекция ВЭБ и H. pylori усиливала экспрессию онкогенного белка ганкирина [8]. Кроме того, показана способность H. pylori и ВЭБ активировать аутофа-гию [9], универсальный процесс, принимающий активное участие в онкогенезе [10, 11].
Ассоциированный с ВЭБ рак желудка имеет ряд генетических и биологических особенностей, что сопровождается
вовлеченностью иммунной системы и высокой экспрессии PD-L1 - лиганда запрограммированной смерти 1 (programmed death Ligand 1) [12]. Модификация микроокружения опухоли с привлечением большого количества иммунокомпетентных клеток также является признаком опухолей, развивающихся на фоне инфекции H. pylori [13, 14]. Существует связь между инфицированием H. pylori, ВЭБ и Нег2пеи-статусом опухоли [15, 16], это связано с вовлеченностью вирусных белков и онкогенных факторов в механизмы трансдукции сигнала в опухолевой клетке [17].
Изменение экспрессии транскрипционных и ростовых факторов играет важную роль в развитии РЖ [18]. Показано снижение экспрессии 4EBP1 в ткани РЖ под влиянием нео-адъювантной терапии. Молекулярные маркеры, способные предсказывать развитие резистентности к противоопухолевой терапии, связаны с особенностями AKT/mTOR сигнального пути [19]. В целом влияние H. pylori и ВЭБ на изменение экспрессии транскрипционных, ростовых факторов в ткани рака желудка практически не изучено.
Цель исследования - изучение экспрессии транскрипционных, ростовых факторов, компонентов AKT/mTOR сигнального пути, а также белка LC3B ткани опухоли желудка в зависимости от инфицирования H. pylori и ВЭБ.
Материал и методы
В исследование включены 55 больных с диагнозом РЖ, проходивших комбинированное лечение в клиниках НИИ онкологии Томского НИМЦ и в течение 2 мес получивших 8 курсов предоперационной полихимиотерапии по схеме FLOT
(доцетаксел - 50 мг/м2, внутривенно капельно в 1-й день, оксалиплатин 85 мг/м2, 2-часовая внутривенная инфузия в 1-й день; фолинат кальция (лейковорин) - 200 мг/м2, 2-часовая внутривенная инфузия в 1-й день, фторурацил - 2400 мг/м2, внутривенная 46-48-часовая инфузия в течение 2 сут).
Критерии включения в исследование: морфологически доказанный рак желудка T24N03 (по TNM классификации Международного противоракового союза 1980 г., пересмотр 2017 г.); больные, не получавшие ранее лечение; общее удовлетворительное состояние больного; возраст больных не старше 70 лет [статус Карновского >60%, по шкале Группы исследования рака Eastern Cooperative OcoLogy Group (ECOG) 0-1]; согласие больного на лечение; отсутствие синхронных и метахронных, злокачественных опухолей.
Критерии невключения в исследование: общее тяжелое состояние пациента - ECOG >2; больные РЖ с метастазами при любом T и N; больные, получавшие ранее любое специфическое противоопухолевое лечение по поводу РЖ; больные с декомпенсированным опухолевым стенозом антраль-ного отдела желудка, кровотечением из опухоли, кахексией, перфорацией, дисфагией; отказ пациента от лечения; наличие отдаленных метастазов по данным клинического обследования, включая лапароскопию (в том числе Cy+ по данным цитологического исследования лаважа брюшной полости); гиперчувствительность к препаратам. Эффективность лечения оценивали по шкале RECIST 1.1.
Пациенты распределены на группы с учетом выявленной инфекции H. pylori и ВЭБ, подтвержденной методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. ДНК H. pylori выявлена у 10 человек, ДНК ВЭБ - у 5, соче-танная инфекция ДНК H. pylori и ВЭБ была диагностирована у 4 больных.
Для анализа полученных результатов были сформированы 6 групп: 1-я группа - больные с ДНК H. pylori в ткани опухоли (n=10); 2-я группа - пациенты без ДНК H. pylori в ткани опухоли (n=45); 3-я группа - больные с ДНК ВЭБ в ткани опухоли (n=5); 4-я группа - пациенты без ВЭБ в ткани опухоли (n=50). Сочетанная инфекция на основании обнаружения ДНК H. pylori и ВЭБ была диагностирована у 4 больных (5-я группа). Контрольная (6-я) группа включала 36 больных.
Клиническая характеристика пациентов представлена в табл. 1.
Выделение ДНК («Экстрация 1000», «Вектор Бест», Россия) и последующую детекцию проводили, согласно инструкции производителя набора со стандартными контрольными материалами.
ДНК H. pylori и ВЭБ в биоптатах опухолевой ткани больных выявляли с использованием метода ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флюоресцентной детекцией продуктов, согласно инструкции производителя («Вектор Бест», Россия).
РНК выделяли с помощью набора RNeasy mini Kit, содержащего ДНКазу I (Qiagen, Германия). Для оценки количества выделенной РНК на спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, США) оценивали концентрацию и чистоту выделенной РНК. Концентрация РНК варьировала от 80 до
Таблица 1. Клинико-морфологическая характеристика больных раком желудка, включенных в исследование
Характеристика Количество больных, абс. (%)
ECOG:
0 50 (92)
1 5 (8)
Пол:
мужской 42 (76)
женский 13 (24)
Гистологический вариант опухоли:
высокодифференцированная адено-карцинома 2 (4)
умеренно дифференцированная аденокарцинома 16 (28)
низкодифференцированная аденокарцинома 33 (60)
недифференцированный рак 2 (4)
перстневидно-клеточный рак 2 (4)
Локализация опухоли в желудке:
тело 27 (48)
антральный отдел 15 (28)
субтотальное поражение 13 (24)
сТМ
T2N0M0 11 (20)
T3N0M0 13 (24)
T4N0M0 2 (4)
T3^M0 13 (24)
T4^M0 7 (12)
T4N2M0 2 (4)
T4N3M0 7 (12)
250 нг/мкл, А260/А280 = 1,95-2,05; А260/А230 = 1,90-2,31. Целостность РНК (RIN) оценивали при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, США) и набора R6K ScreenTape (Agilent Technologies, США). RIN составил 5,6-7,8.
Уровень экспрессии генов оценивали при помощи количественной обратно-транскриптазной ПЦР в режиме реального времени с использованием красителя SYBR Green на амплификаторе iCycLer (Bio-Rad, США). Для получения кДНК на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью набора OT m-MuLV-RH («БиоЛабмикс», Россия) со случайными гексануклеотидными праймерами в соответствии с инструкцией к набору (табл. 2). ПЦР ставили в 3 репликах в объеме 25 мкл, содержащем 12,5 мкл БиоМастер HS-qPCR SYBR BLue («БиоЛабмикс», Россия), 300 нМ прямого и обратного праймеров и 50 нг кДНК.
Двухшаговая программа амплификации включала 1 цикл -94 °С, 10 мин - предварительная денатурация; 40 циклов -1-й шаг 94 °С, 10 с и 2-й шаг 20 с - при температуре 60 °С. Праймеры были подобраны с использованием программы Vector NTI Advance 11.5 и базы данных NCBI (http://www. ncbi.nLm. nih.gov/nuccore).
В качестве референсного гена использовали ген «домашнего хозяйства» фермента GAPDH (gLyceraLdehyde-3-phosphate dehydrogenase) и уровень экспрессии каждого целевого гена нормализовали по отношению к экспрессии
Таблица 2. Последовательность праймеров проб исследованных генов
Ген Последовательность
PTEN F 5'-GGGAATGGAGGGAATGCT-3'
NM_001304717.2 R 5'-CGCAAACAACAAGCAGTGA-3'
4E-BP1 F 5'- CAGCCCTTTCTCCCTCACT -3'
NM_004095.3 R 5'- TTCCCAAGCACATCAACCT -3'
AKT1 F 5'- CGAGGACGCCAAGGAGA -3'
NM_001014431.1 R 5'- GTCATCTTGGTCAG GTGGTGT -3'
c-RAF F 5'- TG GTGTGTCCTGCTCCCT -3'
NM_002880.3 R 5'- ACTG CCTGCTACCTTACTTCCT -3'
GSK3b F 5'- AGACAAGGACGGCAGCAA -3'
NM_001146156.1 R 5'-CTGGAGTAGAAGAAATAACGCAAT-3'
70S kinase alpha F 5'- CAGCACAGCAAATCCTCAGA -3'
NM 001272042.1 R 5'- ACACATCTCCCTCTCCACCTT -3'
m-TOR NM_004958.3 F 5'- CCAAAGGCAACAAGCGAT-3' R 5'- TTCACCAAACCGTCTCCAA -3'
PDK1 NM_001278549.1 F 5'- TCACCAGGACAG CCAATACA -3' R 5'- CTCCTCGGTCACTCATCTTCA -3'
GAPDH NM_001256799.2 F 5'- GGAAGTCAGGTGGAGCGA-3' R 5'-GCAACAATATCCACTTTACCAGA-3'
CAIX F 5'-GTTGCTGTCTCGCTTGGAA-3'
NM 001216.2 R 5'-CAGGGTGTCAGAGAGGGTGT-3'
2HIF-1a F 5'- CAAGAACCTACTG CTAATG CCA-3'
NM_001243084.1 R 5'- TTTGGTGAGGCTGTCCGA-3'
EPAS1 F 5'- TGGAGTATGAAGAGCAAGCCT-3'
NM 001430.4 R 5'-GGGAACCTGCTCTTGCTGT-3'
NFKB1 F 5'-CGTGTAAACCAAAGCCCTAAA-3'
NM_001165412.1 R 5'-AACCAAGAAAGGAAGCCAAGT-3'
RELA F 5'-GGAGCACAGATACCACCAAGA-3'
NM 001145138.1 R 5'-GGGTTGTTGTTGGTCTGGAT-3'
VHL F 5'- GGCAGGCGAATCTCTTGA-3'
NM_000551.3 R 5'-CTATTTCCTTTACTCAGCACCATT-3'
PD-L2 NM 025239 F 5'- GTTCCACATACCTCAAGTCCAA-3' ATAGCACTGTTCACTTCCCTCTT-3'
PD-L1 NM_001267706 F 5'- AGGGAGAATGATGGATGTGAA-3' R 5'-ATCATTCACAACCACACTCACAT-3'
PD-1-1 XM_017004293 F 5'- CTGGGCGGTGCTACAACT3' R 5'-CTTCTGCCCTTCTCTCTGTCA-3'
LC3 F 5'- CCCAAACCGCAGACACAT-3'
NM_032514.4 R 5'-ATCCCACCAGCCAGCAC-3'
AMPK F 5'- AAGATGTCCATTGGATGCACT-3'
NM 006252.4 R 5'-TGAGGTGTTGAGGAACCAGAT-3'
Примечание. NM - номер последовательности РНК в NCBI Nucleotide Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore); F - прямой праймер; R - обратный праймер.
GAPDH. Количественный анализ экспрессии проводили по 2ДДИ по отношению к конститутивно-экспрессируемому гену-рефери фермента GAPDH.
Получение гомогенатов: замороженную ткань (100 мг) измельчали в жидком азоте, затем ресуспендировали в 300 мкл 50 мМ трис-НС1 буфера (рН 7,5), содержащего 2 мМ аденозинтрифосфата, 5 мМ хлорида магния, 1 мМ ди-тиотреитола, 1мМ ЭДТА и 100 мМ хлорида натрия. Гомогенат центрифугировали 60 мин при 10 000 д и 4 °С, использовали далее для приготовления проб с дитиотреитолом для проведения электрофореза.
Электрофорез проводили по 1_аеттИ в 13% полиакрил-амидном геле.
Вестерн-блоттинг: после электрофореза переносили полипептиды на PVDF-мембрану (1тшоЬу1оп, МНИроге, США)
с помощью влажного переноса в блот-модуле (Bio-Rad, США). Иммунодетекцию белка LC3B в ткани проводили с использованием моноклональных антител к белку LC3B (Affinity Biosciences, США). Результаты исследования оценивали с помощью гель-документирующей системы Chemidoc (BioRad, США), используя программное приложение ImageLab. Стандартизацию проводили относительно р-актина, относительное содержание которого в неизмененной ткани принимали за 100%. Результаты выражали в процентах содержания показателей в неизмененной ткани.
Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета программ Statistica 12.0, проверку нормальности распределения признака - с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Результаты определения экспрессии генов представлены как Me [Q1; Q3]. Тест Манна-Уитни
Таблица 3. Уровень экспрессии транскрипционных и ростовых факторов в ткани опухоли в зависимости от наличия ДНК H. pylori или вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), в том числе при их сочетанном обнаружении
Уровень экспрессии определяемых маркеров в группах пациентов, усл. ед.
Маркер ДНК H. pylori (-) ДНК H. pylori (+) ДНК ВЭБ (-) ДНК ВЭБ (+) ДНК H. pylori и ДНК контрольная
(n=45) (n=10) (n=50) (n=5) ВЭБ (+) (n=54) группа (n=36)
NF-kB p65 1,41 [0,36; 3,26] 1,83 [1,07; 3,18] 1,38 [0,46; 3,26] 1,69 [0,01; 2,3] 6,36 [2,3; 10,41] 1,35 [0,36; 3,18]
NF-kB p50 1,36 [0,48; 6,54] 4,13 [0,68; 14,72] 1,28 [0,54; 7,84] 1,77 [0,14; 10,26] 6,01 [0,14; 11,88] 1,36 [0,54; 7,84]
VEGFR2 1,39 [0,54; 3,63] 0,68 [0,19; 1,26] 1,30 [0,33; 3,63] 0,78 [0,63; 1,05] 4,55 [0,63; 8,46] 1,05 [0,33; 3,48]
1,24 [0,32; 3,29] 1,70 [0,51; 9,06] 1,38 [0,38; 5,29] 0,77 [0,06; 2,0] 15,7 [0,06; 31,34] 1,37 [0,38; 4,17]
CAIX 0,93 [0,32; 1,98] 17,22 [2,93; 31,78]* 1,07 [0,35; 3,66] 0,27 [0,19; 14,32] 23,05 [14,32; 31,78]** 1,04 [0,34; 2,94]
HIF-1 1,78 [0,54; 8,3] 9,13 [0,02; 18,64] 1,93 [0,54; 10,13] 0,96 [0,03; 2,02] 9,14 [0,02; 18,25] 1,78 [0,54; 9,35]
HIF-2 1,0 [0,2; 3,36] 0,71 [0,13; 14,03] 0,99 [0,17; 3,36] 0,5 [0,06; 20,23] 23,78 [0,06; 47,5] 0,99 [0,17; 3,36]
VHL 0,97 [0,38; 2,0] 1,07 [0,06; 2,37] 1,0 [0,36; 2,09] 0,71 [0,16; 1,51] 27,13 [0,06; 54,19] 0,99 [0,36; 2,0]
Примечание. * - значимость различий по сравнению с больными без ДНК H. pylori в опухоли (1-я группа), p<0,05; ** - значимость различий по сравнению с контрольной группой (6-я группа), p<0,05.
использовали для оценки значимости различий количественных признаков. Для сравнения качественных признаков применяли критерий х2. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Пациенты в анализируемых группах не отличались по размеру опухоли и вовлеченности в патологический процесс регионарных лимфоузлов. Однако в случае инфицирования H. руЬп и при сочетанном обнаружении с ДНК ВЭБ отмечены увеличение числа больных с низкодифференцированными опухолями и сниженный ответ опухоли на неоадъювантную химиотерапию (увеличение доли больных со стабилизаций
и прогрессированием после проведенного лечения). Выявленный факт свидетельствует об агрессивном характере течения заболевания.
В результате проведенного исследования отмечено увеличение экспрессии карбоангидразы IX (CAIX) в 18,5 раза при наличии ДНК H. pylori, а при сочетанном обнаружении с ДНК ВЭБ данный показатель повышался в 22,1 раза по сравнению с пациентами, отрицательными по этим патогенам (табл. 3). CAIX - важный ангиогенный фактор, вовлеченный в процессы роста и распространения опухоли, связанный с развитием гипоксии [18].
Компоненты AKT/mTOR сигнального пути играют важную роль в сигнальной трансдукции при РЖ. Особое внимание уделяется дефициту PTEN, фосфатазе, относящейся
Таблица 4. Уровень экспрессии компонентов AKT/mTOR сигнального пути в ткани опухоли при наличии ДНК H. pylori
или вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), в том числе при их сочетанном обнаружении
Уровень экспрессии определяемых компонентов в группах пациентов, усл. ед.
Компонент ДНК H. pylori (-) ДНК H. pylori (+) ДНК ВЭБ (-) ДНК ВЭБ (+) ДНК H. pylori и ДНК контрольная
(n=45) (n=10) (n=50) (n=5) ВЭБ (+) (n=4) группа (n=36)
4EBP1 1,32 [0,62; 3,13] 1,09 [0,45; 12,82] 1,31 [0,62; 4,0] 3,13 [0,45; 4,35] 76,87 [0,45; 153,28] 1,32 [0,62; 4,0]
AKT 1,41 [0,85; 3,4] 0,53 [0,07; 1,41] 1,27 [0,66; 3,1] 1,2 [0,33; 10,43] 0,2 [0,07; 0,33]*** 1,27 [0,72; 3,4]
c-RAF 1,27 [0,54; 6,75] 3,89 [0,69; 16,11] 1,35 [0,56; 12,75] 0,93 [0,13; 2,14] 2,39 [0,05; 4,72] 1,28 [0,56; 10,5]
GSK-3ß 1,05 [0,62; 2,42] 1,84 [0,16; 7,26] 1,08 [0,59; 2,19] 7,26 [4,42; 16,84]** 3,71 [0,16; 7,26]*** 1,11 [0,62; 2,46]
70s 6 киназа 1,38 [0,72; 2,33] 2,93 [0,02; 43,41] 1,35 [0,72; 3,8] 1,44 [0,13; 2,63] 21,71 [0,0; 43,41] 1,38 [0,72; 3,3]
mTOR 0,99 [0,5; 1,6] 0,89 [0,19; 1,51] 1,06 [0,54; 1,6] 0,22 [0,19; 0,44]** 0,21 [0,19; 0,22] 1,0 [0,5; 1,6]
PDK 0,87 [0,51; 2,53] 1,8 [0,89; 6,89] 0,98 [0,54; 2,82] 0,3 [0,05; 1,24] 13,51 [0,3; 26,72] 0,95 [0,54; 2,53]
PTEN 1,35 [0,33; 3,77] 2,21 [1,44; 18,25]* 1,51 [0,38; 5,57] 2,13 [0,01; 43,71] 22,92 [2,13; 43,71] 1,44 [0,35; 5,57]
Примечание. * - значимость различий по сравнению с больными без ДНК H. pylori в опухоли (1-я группа), p<0,05; ** - значимость различий по сравнению с больными без ДНК ВЭБ в опухоли (3-я группа), p<0,05; *** - значимость различий по сравнению с контрольной группой (6-я группа), p<0,05.
Таблица 5. Уровень экспрессии PD-1, PD-L1, PD-L2, AMPK в ткани опухоли при наличии ДНК H. pylori или вируса Эпштей-на-Барр (ВЭБ) и их сочетанном обнаружении
Уровень экспрессии определяемых маркеров в группах пациентов, усл. ед.
Маркер ДНК H. pylori (-) ДНК H. pylori (+) ДНК ВЭБ (-) ДНК ВЭБ (+) ДНК H. pylori и ДНК контрольная
(n=45) (n=10) (n=50) (n=5) ВЭБ (+) (n=54) группа (n=36)
PD 0,69 [0,38; 2,34] 3,64 [0,08; 14,12] 0,74 [0,35; 3,18] 1,5 [0,5; 4,65] 33,63 [0,08; 67,18] 0,78 [0,37; 3,18]
PD-L1 0,84 [0,35; 3,87] 1,82 [0,37; 6,63] 1,04 [0,35; 5,4] 0,84 [0,82; 3,76] 5,2 [3,76; 6,63] 0,84 [0,35; 3,87]
PD-L2 1,45 [0,52; 3,4] 3,15 [0,66; 7,4] 1,53 [0,54; 5,35] 0,77 [0,29; 1,7] 46,03 [0,29; 91,77] 1,53 [0,54; 5,06]
AMPK 1,2 [0,11; 2,89] 1,17 [0,41; 2,77] 1,21 [0,41; 2,77] 0,09 [0,02; 3,26] 3,96 [0,0; 7,95] 1,2 [0,29; 2,77]
к белкам-онкосупрессорам [20]. У больных с ДНК H. pylori выявлен рост экспрессии PTEN в 1,6 раза по сравнению с больными без H. pylori (табл. 4). При наличии ДНК ВЭБ и сочетанной инфекции был выявлен рост экспрессии GSK-3ß в 6,6 и 3,3 раза соответственно по сравнению с больными без этих маркеров. Модификация экспресси-онного профиля в опухоли затрагивала также экспрессию mTOR и AKT, ключевых киназ сигнального пути. Это отмечено при наличии ДНК ВЭБ при снижении mTOR в 4,77 раза и при сочетанной AKT в 6,35 раза по сравнению с больными, у которых не были выявлены ДНК изучаемых инфекций. Выявленные факты указывают на вовлеченность изменения экспрессии компонентов сигнальных каскадов под влиянием ВЭБ, в том числе в случае сочетанной инфекции, которая может быть связана с агрессивностью раковых клеток.
Иммуногенность опухоли связывают с рецепторами и лигандами программируемой клеточной гибели PD-1, PD-L1 и PD-L2, которая может изменяться под влиянием инфекционных агентов любого происхождения, в том числе вовлеченных в процессы онкогенеза. В проведенном исследовании изменений данных показателей не отмечено (табл. 5), что, вероятно, связано с небольшим количеством пациентов с опухолями желудка, у которых были выявлены ДНК H. pylori и ВЭБ.
Стоит отметить изменение экспрессии и содержания белка LC3B. При инфекции H. pylori и ВЭБ (2-я и 4-я группы) показан рост экспрессии и содержания показателя в 2,8; 1,5 и 5,8; 1,67 раза соответственно по сравнению с неинфици-рованными больными (1-я и 3-я группы) (табл. 6). При этом при сочетанной инфекции в случае выявления ДНК обеих инфекций отмечался рост только белка в 1,65 раза по сравнению с инфицированными больными.
Аутофагия является универсальным процессом адаптации клетки к неблагоприятным условиям, играет значимую роль в процессах онкогенеза и способствует не только опухолевому росту, но и развитию резистентности к противоопухолевому лечению [10, 19]. Полученные данные свидетельствуют об активации аутофагии, которая сопровождает развитие H. pylori и ВЭБ-ассоциированных видов РЖ, что можно использовать в персонализированной терапии опухолей данной локализации.
Хронический инфекционный процесс является значимым фактором в развитии злокачественных опухолей желудка. Отмечается активация ангиогенеза при нали-
чии как ДНК H. pylori, так и ДНК H. pylori и ВЭБ. Имеются противоречивые данные о роли CAIX, активирующей в условиях ацидоза развитие новых сосудов [21]. Повышение экспрессии CAIX показано в ткани РЖ, связанного с развитием воспалительного процесса вследствие инфицирования H. pylori. Полученные данные свидетельствуют о роли инфекционных агентов в трансформации клеток эпителия желудка в опухолевые. В исследовании G. Wang и соавт. показаны значимость транскрипционных и ростовых факторов в развитии опухолей желудочно-кишечного тракта, их вовлеченность в процессы опухолевой прогрессии, в том числе ангиогенез, модификация опухолевого микроокружения и т.д. [18].
Инфицирование H. pylori и ВЭБ сопровождается изменением активности сигнальных каскадов [15, 16], что способствует формированию значимых молекулярно-генетиче-ских маркеров опухоли [17]. В проведенном исследовании выявлена активация PTEN, одного из показателей, характеризующих сигнальный каскад (путь), при наличии признаков инфицирования H. pylori пациента с РЖ. При обнаружении ДНК ВЭБ и в том числе одновременно с H. pylori отмечено повышение экспрессии GSK-3ß на фоне снижения уровня мРНК mTOR, AKT. Известно, что модификация данного сигнального каскада является ключевым событием при развитии инвазивных свойств опухоли, что приведено в работе J. Xu и соавт. [22]. Вероятно, при инфицировании ВЭБ и сочетанном влиянии инфекционных агентов происходит модификация биологических свойств опухоли с формированием агрессивного фенотипа, что влияет на прогноз заболевания и эффективность противоопухолевой терапии.
В ранее проведенном исследовании выявлена ассоциация между PD-L1 статусом опухоли и молекулярными маркерами в опухоли [19]. Стоит отметить, что экспрессия PD-1, PD-L1, PD-L2 в опухоли не зависела от инфицирования H. pylori и ВЭБ, обнаруженных в материале злокачественных клеток. Однако выявлена активация аутофагии в опухоли, ассоциированной с инфицированием H. pylori, ВЭБ, а также при сочетанной инфекции. Аутофагия, являясь универсальным патогенетическим процессом, который определяет особенности жизнедеятельности клетки, значима и для опухолей желудочно-кишечного тракта [19, 23]. M.C. Mommersteeg и соавт. обнаружили особенности клеточного метаболизма в H. pylori-ассоциированных видах РЖ, что, вероятнее всего, связано с проявлением провоспали-
Таблица 6. Экспрессия и содержание LC3B в ткани опухоли в зависимости от наличия ДНК H. pylori и вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ)или их одновременного выявления
Уровень экспрессии LC3B в группах пациентов
Показатель ДНК H. pylori (-) ДНК H. pylori (+) ДНК ВЭБ (-) ДНК ВЭБ (+) ДНК H. pylori и ДНК контрольная
(n=45) (n=10) (n=50) (n=5) ВЭБ (+) (n=54) группа (n=36)
Экспрессия LC3B, усл. ед. 0,7 [0,32; 1,53] 2,0 [0,02; 5,62]* 0,65 [0,32; 1,45] 3,8 [0,13; 3,97] 3,9 [0,13; 3,97] 0,68 [0,31; 1,52]
Белок 84,1 124,7 83,5 139,0 139,0 84,1
LC3B, % [20,0; 139,0] [36,89; 145,89]* [23,65; 123,33] [11,98; 166,56]** [11,98; 166,56]*** [20,0; 139,0]
Примечание. * - значимость различий по сравнению с больными без ДНК H. pylori в опухоли (1-я группа), p<0,05; **- значимость различий по сравнению с больными без ДНК ВЭБ в опухоли (3-я группа), p<0,05; *** - значимость различий по сравнению с контрольной группой (6-я группа), p<0,05.
тельных свойств и высоким риском предраковых изменений эпителия желудка, приводящих к развитию мутаций бел-ков-онкосупрессоров и онкобелков [24]. Рост экспрессии и содержания белка LC3B, маркера аутофагосом, выявленное в проведенном исследовании свидетельствует о роли аутофагии в развитии опухолей желудка, особенно на фоне хронического воспаления, ассоциированного с инфицированием H. pylori и ВЭБ.
Заключение
Таким образом, выявлено увеличение экспрессии CAIX, компонентов AKT/mTOR сигнального пути и белка LC3B в ткани РЖ, связанное с хроническим воспалением
на фоне инфицирования H. pylori и ВЭБ и развитием EVB-ассоциированного РЖ. Наиболее выраженная модификация внутриклеточного сигнального пути отмечается у больных с наличием в ткани опухоли ДНК ВЭБ и при сочетанной инфекции.
Полученные данные подтверждают вовлеченность H. pylori и ВЭБ в молекулярные механизмы развития злокачественных новообразований желудка. В проведенном исследовании у части больных РЖ при обнаружении ДНК H. pylori и ВЭБ возможно быстрое развитие опухолевой прогрессии за счет активации аутофагии, ангиогенеза, что подтверждается большим количеством пациентов с низкодифференци-рованными опухолями и увеличением со сниженным ответом опухоли на проведенное лечение.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Августинович Александра Владимировна (Alexandra V. Avgustinovich) - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник отделения абдоминальной онкологии НИИ онкологии Томского НИМЦ, Томск, Российская Федерация E-mail: aov862@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-7301-7581
Спирина Людмила Викторовна (Lyudmila V. Spirina)* - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии и молекулярной биологии с курсом клинической лабораторной диагностики ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии опухолей НИИ онкологии Томского НИМЦ, Томск, Российская Федерация E-mail: spirinalvl@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-5269-736X
Афанасьев Сергей Геннадьевич (Sergei G. Afanas'ev) - доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделением абдоминальной онкологии НИИ онкологии Томского НИМЦ, Томск, Российская Федерация E-mail: afanasievsg@oncology.tomsk.ru http://orcid.org/0000-0001-6066-3998
Волков Максим Юрьевич (Maksim Yu. Volkov) - кандидат медицинских наук, врач отделения абдоминальной онкологии НИИ онкологии Томского НИМЦ, Томск, Российская Федерация E-mail: dok75-75@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-6776-4898
Доспан Азияна Буяновна (Aziyana B. Dospan) - студент VI курса медико-биологического факультета ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России, Томск, Российская Федерация E-mail: aziyanadospan99@mail.ru http://orcid.org/0000-0001-7431-4764
* Автор для корреспонденции.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Ajani J.A., D'Amico T.A., Bentrem D.J., et al. Gastric cancer, version 2.2022, NCCN clinical practice guidelines in oncology. J Natl Compr Canc Netw. 2022; 20 (2): 167-92. DOI: https://doi.org/10.6004/jnccn.2022.0008
2. Yeoh K.G., Tan P. Mapping the genomic diaspora of gastric cancer. Nat Rev Cancer. 2022; 22 (2): 71-84. DOI: https://doi.org/10.1038/s41568-021-00412-7
3. Ishaq S., Nunn L. Helicobacter pylori and gastric cancer: A state of the art review. Gastroenterol Hepatol Bed Bench. 2015; 8 (suppl 1): 6-14.
4. Ragab A.E., Al-Madboly L.A., Al-Ashmawy G.M., et al. Unravelling the in vitro and in vivo anti-Helicobacter pylori effect of delphinidin-3-O-glucoside rich extract from pomegranate exocarp: Enhancing autophagy and downregulating TNF-a and COX2. Antioxidants (Basel). 2022; 11 (9): 1752. DOI: https://doi.org/10.3390/an-tiox11091752
5. Wang J., Liu X. Correlation analysis between Helicobacter pylori infection status and tumor clinical pathology as well as prognosis of gastric cancer patients. Iran J Public Health. 2018; 47 (10): 1529-36.
6. Lin H.C., Chang Y., Chen R.Y., et al. Epstein-Barr virus latent membrane pro-tein-1 upregulates autophagy and promotes viability in Hodgkin lymphoma: Implications for targeted therapy. Cancer Sci. 2021; 112 (4): 1589-602. DOI: https://doi. org/10.1111/cas.14833
7. Suzuki Y., Ito S., Nomura K. et al. Multiple Epstein-Barr virus-associated gastric cancers arising in a patient with autoimmune gastritis. Intern Med. 2022 Sep 28. DOI: https://doi.org/10.2169/internalmedicine.0673-22
8. Kashyap D., Baral B., Jakhmola S., et al. Helicobacter pylori and Epstein-Barr virus coinfection stimulates aggressiveness in gastric cancer through the regulation of gankyrin. mSphere. 2021; 6 (5): 0075121. DOI: https://doi.org/10.1128/ mSphere.00751-21
9. Zhang L., Sung J.J., Yu J., et al. Xenophagy in Helicobacter pylori- and Epstein-Barr virus-induced gastric cancer. J Pathol. 2014; 233 (2): 103-12. DOI: https://doi. org/10.1002/path.4351 PMID: 24633785.
10. Cao Y., Luo Y., Zou J., et al. Autophagy and its role in gastric cancer. Clin Chim Acta. 2019; 489: 10-20. DOI: https://doi.org/10.1016Zi.cca.2018.11.028
11. Spirina L.V., Avgustinovich A.V., Afanas'ev S.G., et al. Molecular mechanism of resistance to chemotherapy in gastric cancers, the role of autophagy. Curr Drug Targets. 2020; 21 (7): 713-21. DOI: https://doi.org/10.2174/1389450120666191 127113854
12. Naseem M., Barzi A., Brezden-Masley C., et al. Outlooks on Epstein-Barr virus associated gastric cancer. Cancer Treat Rev. 2018; 66: 15-22. DOI: https://doi. org/10.1016/j.ctrv.2018.03.006
13. Silva R., Gullo I., Carneiro F. The PD-1:PD-L1 immune inhibitory checkpoint in Helicobacter pylori infection and gastric cancer: A comprehensive review and fu-
ture perspectives. Porto Biomed J. 2016; 1 (1): 4-11. DOI: https://doi.Org/10.1016/j. pbj.2016.03.004
14. Shen B., Qian A., Lao W., et al. Relationship between Helicobacter pylori and expression of programmed death-1 and its ligand in gastric intraepithelial neoplasia and early-stage gastric cancer. Cancer Manag Res. 2019; 11: 3909-19. DOI: https:// doi.org/10.2147/CMAR.S203035
15. Cyprian F.S., Al-Antary N., Al Moustafa A.E. HER-2/Epstein-Barr virus crosstalk in human gastric carcinogenesis: A novel concept of oncogene/oncovirus interaction. Cell Adh Migr. 2018; 12 (1): 1-4. DOI: https://doi.org/10.1080/19336918.20 17.1330244
16. Algin E., Baykara M., Yilmaz G., et al. Is there any relationship between Helicobacter pylori infection and human epidermal growth factor receptor 2 expression in gastric cancer? J Cancer Res Ther. 2020; 16 (suppl): 128-32. DOI: https://doi. org/10.4103/jcrt.JCRT_891_18
17. Lin J.H., Tsai C.H., Chu J.S., et al. Dysregulation of HER2/HER3 signaling axis in Epstein-Barr virus-infected breast carcinoma cells. J Virol. 2007; 81 (11): 5705-13. DOI: https://doi.org/10.1128/JVI.00076-07
18. Wang G., Cheng Z., Liu F., et al. CREB is a key negative regulator of carbonic anhydrase IX (CA9) in gastric cancer. Cell Signal. 2015; 27 (7): 1369-79. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.cellsig.2015.03.019
19. Spirina L., Avgustinovich A., Afanas'ev S., et al. PD-L1 status in gastric cancers, association with the transcriptional, growth factors, AKT/mTOR components change, and autophagy initiation. Int J Mol Sci. 2021; 22 (20): 11176. DOI: https:// doi.org/10.3390/ijms222011176
20. Hu M., Zhu S., Xiong S., et al. MicroRNAs and the PTEN/PI3K/Akt pathway in gastric cancer (review). Oncol Rep. 2019; 41 (3): 1439-54. DOI: https://doi. org/10.3892/or.2019.6962
21. Nortunen M., Huhta H., Helminen O., et al. Carbonic anhydrases II, IX, and XII in Barrett's esophagus and adenocarcinoma. Virchows Arch. 2018; 473 (5): 567-75. DOI: https://doi.org/10.1007/s00428-018-2424-z
22. Xu J., Liu D., Niu H., et al. Resveratrol reverses Doxorubicin resistance by inhibiting epithelial-mesenchymal transition (EMT) through modulating PTEN/Akt signaling pathway in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2017; 36 (1): 19. DOI: https:// doi.org/10.1186/s13046-016-0487-8
23. Chen Q., Xu X.Y., Hou X.X., Chen S.C. The upregulation of proteins light chain 3 and autophagy-related 5 and the occurence of intestinal-type gastric cancer. J Physiol Pharmacol. 2021; 72 (6): 8. DOI: https://doi.org/10.26402/jpp.2021.6.08
24. Mommersteeg M.C., Simovic I., Yu B., et al. Autophagy mediates ER stress and inflammation in Helicobacter pylori-related gastric cancer. Gut Microbes. 2022; 14 (1): 2015238. DOI: https://doi.org/10.1080/19490976.2021.2015238
