CC BY
22
УДК 577.25
© А.Г. Бабичева, Н.Н. Тризно, 2011
А.Г. Бабичева, Н.Н. Тризно
ВЛИЯНИЕ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ НА РЕГУЛЯЦИЮ СОСУДИСТОГО ТОНУСА АОРТЫ КРЫСЫ
ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России
При суточной инкубации аорты крысы с дексаметазоном происходит усиление сократительной реакции на воздействие ангиотензина II, вазопрессина и норадреналина и ослабление серотонин-индуцированного ответа сосудов. Доказано, что активация глюкокортикоидных рецепторов индуцирует синтез мРНК соответствующих мембранных рецепторов. В результате десенситизации глюкокортикоидных рецепторов в 2 раза падает уровень экспрессии мРНК ангиотензиновых и вазопрессиновых рецепторов, что приводит к снижению вазоконстрикторной реакции сосудов по отношению к этим агентам. Экспрессия вазоконстрикторных рецепторов серотонина при истощении глюкокортикоидных рецепторов не изменяется, в то время как сократительная активность сосудов в ответ на действие серотонина возрастает.
Ключевые слова: аорта, глюкокортикоидныерецепторы, серотонин, экспрессия генов.
A.G. Babicheva, N.N. Trizno GLUCOCORTICOID INFLUENCE ON REGULATION OF VASCULAR TONUS AORTA IN RATS
A daily incubation of rat aorta by dexamethasone increases a vasoconstrictive reaction in response to angiotensin II, vasopressin, and norepinephrine but reduces serotonin-induced decrease of vessels. It has proved that glucocorticoid receptors activation induces mRNA synthesis of responding membrane receptors. Levels of angiotensin II and vasopressin receptors mRNA halves decreased due to glucocorticoid receptors decensitization, as the result the vessel reaction diminishes in response to these vasoconstrictive agents. Glucocorticoid receptors decensitization does not change expression of constrictive serotonin receptors while the pressor activity of aorta expands under the influence of serotonin.
Key words: aorta, glucocorticoid receptors, seceptors, serotonin, gene expression.
Ведущим звеном развития стресса является усиление выделения в кровь глюкокортикоидов (ГК), которые обладают гипертензивным эффектом [5]. Механизм действия отдельных гормонов, так же как и характер взаимодействия различных гормональных систем, участвующих в регуляции сосудистого тонуса при стрессе, чрезвычайно сложен и недостаточно изучен. Однако в литературе имеются данные в пользу того, что мишенью для глюкокортикоидных рецепторов служат различные G-белки [9]. Одновременно показана решающая роль глюкокортикоидов в процессе связывания альфа1-адренорецепторов с G-белками [3, 4]. Однако более поздние работы свидетельствуют о том, что и другие G-белок-связанные рецепторы (ангиотензиновые, вазопрессиновые, эндотелиновые) в тканях сосудов также находятся под контролем ГК [7, 10, 11]. Авторы подчеркивают значимость механизма регуляции глюкокортикоидами мембранных рецепторов, сопряженных с G-белками (G-protein-coupled receptors, GCPR), и, следовательно, трансмембранных сигнальных путей в гладкомышечных клетках сосудов. Кроме этого, в настоящей работе впервые исследуется влияние глюкокортикоидов на регуляцию сосудистого тонуса крысы в ответ на серотонин, так как в литературе имеются данные только о влиянии кортикостероидов на экспрессию мРНК 5НТ1А-рецепторов мозга [2, 8].
В связи с этим целью настоящего исследования было выявить механизмы дизрегуляции тонуса аорты крысы в ответ на вазоконстрикторные агенты (серотонин, ангиотензин II, вазопрессин) при воздействии глюкокортикоидов.
Материалы и методы. Регуляцию тонуса аорты исследовали на 48 крысах-самцах линии Wistar массой тела 200-220 г. Влияние глюкокортикоидов на регуляцию сосудистого тонуса оценивали in vivo и in vitro. Крысам внутрибрюшинно вводили дексаметазон (KRKA, Россия) в дозе 3 мг/кг в течение 5 дней. На 6-й день под наркозом животных декапитировали, извлекали грудной отдел аорты, который затем очищали от жировой и соединительной тканей и помещали в охлажденный физиологический раствор Кребса-Хенселейта. Активацию глюкокортикоидных рецепторов in vitro проводили в результате инкубации свежевыделенных сосудов от интактных животных в культуральной среде DMEM («Биолот», Россия) с дексаметазоном в дозе 10 мкМ в течение 24 часов.
Измерение силы изометрического сокращения изолированных колец сосудов.
Измерение силы сокращения изолированных фрагментов сосудов проводили в изометрическом режиме по методу Mulvany M.J. и Halpern W. [6]. Для оценки функционального состояния сосудов на них воздействовали агонистом а1-адренорецепторов норадреналином в концентрации 10-7М. Расслабление сосуда под действием агониста мускариновых рецепторов карбахолина в дозе 10-5М (Fluka, USA) более чем на 50% свидетельствовало о целостности эндотелиального слоя. Измерение силы сокращения изолированных колец
аорты исследовалось в ответ на введение вазоконстрикторных агентов, опосредующих регуляцию сосудистого тонуса: серотонин, эндотелин-1, норадреналин (Sigma, USA), ангиотензин II и вазопрессин (Fluka, USA).
Измерение уровня экспрессии генов рецепторов сосудов методом RT-PCR.
Фрагменты сосудов от исследований in vivo и in vitro, не использованных в физиологических экспериментах, консервировали в пробирке, содержащей 10 объемов раствора EverFresh RNA («Силекс», Россия). Выделение тотальной РНК из образцов ткани осуществляли тризольным методом. Определение концентрации РНК проводили спектрофотометрическим методом. Обратную транскрипцию проводили с помощью набора «Синтез первой цепи кДНК» фирмы «Синтол» (Россия) строго в соответствии с прилагаемой инструкцией. ПЦР с детекцией в реальном времени проводили на приборе Abi Prizm 3700 фирмы Applied Biosystems (США) используя набор реактивов фирмы «Синтол» (Россия). Специфические праймеры для анализа исследуемых генов были изготовлены фирмой «Синтол» (Россия). В работе были использованы праймеры с зондом, меченые флуоресцентным агентом TaqMan, комплементарные участку PCR-продукта. В качестве внутреннего контроля был использован ген «домашнего хозяйства» -эукариотический фактор элонгации eF1A. Реакционную смесь готовили согласно прилагаемой инструкции.
Статистический анализ данных проводили с использованием программы Statistica 6.0. Достоверность различий между группами определяли с помощью критерия Стьюдента (t - критерий).
Результаты и обсуждение. В результате проведенных исследований экспериментально обосновано значение изменения функциональной активности глюкокортикоидных рецепторов в регуляции сосудистого тонуса. Как показано на рисунке 1, применение дексаметазона в течение 5 дней значительно уменьшает в 2,2 раза чувствительность сосудов к ангиотензину II (10-8М), в 2,5 раза - вазопрессину (10-8М) и в 1,5 раза -эндотелину-1 (10-8М) и практически не изменяет - на норадреналин (10-7М). Однако воздействие серотонином (10-6М) на сосуды привело к увеличению вазоконстрикторной реакции по сравнению с контрольным ответом. При этом глюкокортикоид не изменяет эндотелий-зависимого расслабления в ответ на карбахолин (негидролизуемый ацетихолинэстеразами аналог ацетилхолина), что свидетельствовало о целостности эндотелия.
Установлено, что активация глюкокортикоидных рецепторов путем суточной инкубации аорты крысы с дексаметазоном в концентрации 10 мкМ приводит к увеличению силы сосудистого сокращения в 2 раза в ответ на действие ангиотензина II, в 2,8 раза - вазопрессина и в 1,2 раза - норадреналина, но не влияет на вазоконстрикторную реакцию, вызванную эндотелином-1. При этом опять фиксировался противоположный ответ на серотонин по сравнению с другими эндогенными вазоконстрикторами (рис. 2). В качестве контроля были взяты сосуды после суточной инкубации в среде DMEM. Нами не было выявлено достоверных различий в силе изометрического сокращения свежевыделенных и инкубированных (контрольных) сосудов на АТП, VP и 5HT. Это доказывает, что манипуляции с аортой в культуральной среде DMEM без дексаметазона не привели к изменениям в сосудистой реактивности на исследуемые вазоконстрикторные агенты.
1600
u
, 1/1ПП
ATII VP ET-1 5HT NE
Рис. 1. Изменение силы сокращения изолированных колец аорты после длительного применения дексаметазона (3мг/кг). Данные представлены как М±т (n=6). Сокращения: ATII - ангиотензин II, VP -вазопрессин, ET-1 - эндотелин-1, 5HT - серотонин, NE - норадреналин; * - достоверность отличия от
контроля, р<0,05
Для подтверждения результатов физиологических исследований о глюкокортикоид-индуцированной активации рецепторов ангиотензина II и вазопрессина мы выявили уровень экспрессии мРНК АТ1 А- и VP1А-рецепторов методом количественной ПЦР (PCR-«real time»). Ввиду многообразия 5НТ-рецепторов мы
исследовали уровень мРНК только рецепторов типа 2А, которые, по литературным и нашим собственным данным [1], являются основными вазоконстрикторами.
1400 -|
и
Ж
ATII VP ET-1 5HT NE
Рис. 2. Изменение силы сокращения изолированных колец аорты после инкубации с дексаметазоном (10мкМ) в течение 24 ч. Данные представлены как М±m (п=5). Сокращения: см. рис. 1 * - достоверность
отличия от контроля, р<0,05
Показано, что усиление реактивности сосудов по отношению к ангиотензину II и вазопрессину вызвано глюкокортикоид-индуцированной активацией экспрессии их рецепторов, о чем свидетельствует 4-кратное увеличение содержания мРНК АТ1А-рецепторов для ангиотензина II и 8-кратное - мРНК VlA-рецепторов для вазопрессина в аорте крысы после активации ГРц дексаметазоном в течение суток (рис. 3). Выявлено, что активация ГРц не оказывает прямого влияния на экспрессию вазоконстрикторных 5НТ2А-рецепторов. Предположено, что ГРц могут действовать опосредовано, усиливая экспрессию и функциональную активность мембранных рецепторов других вазоактивных соединений, которые в свою очередь могут изменять свойства 5НТ-рецепторов на уровне межрецепторного взаимодействия («cross-talk»).
900 800 700 600 500 400 300 200 100 0
*
*
1 ■ 1 11 : 1 ■-
Ш Контроль □ Дексаметазон (24ч) ■ Дексаметазон (5 дней)
ГРц АТ1А VP1A 5HT2A
Рис. 3. Изменение уровня экспрессии рецепторов в аорте крысы при воздействии дексаметазона методом ИТ-РСИ. Данные представлены как М±т (п=7). Сокращения: ГРц - глюкокортикоидные рецепторы, АТ1А - ангиотензиновые рецепторы типа 1А, УР1Л - вазопрессиновые рецепторы типа 1А, 5НТ2А - серотониновые рецепторы типа 2А; * - достоверность отличия от контроля, р<0,05
Результаты настоящего исследования имеют принципиально важное значение для понимания роли глюкокортикоидных рецепторов в регуляции сокращения сосудов через 5НТ-рецепторы. По-видимому, серотонинэргическая система относится к компенсаторным механизмам поддержания сосудистого тонуса. Полученные данные позволяют говорить о том, что десенситизация глюкокортикоидных рецепторов является
важным патогенетическим фактором нарушения регуляции сосудистого тонуса, по крайней мере, на уровне адреналиновой, ренин-ангиотензиновой, вазопрессиновой и серотониновой систем, и высказать предположение о глюкокортикоид-зависимых механизмах развития гипореактивности сосудов к вазоконстрикторным гормонам при стресс-реакции.
Заключение. Установлено, что воздействие в течение суток на сосуды дексаметазона в концентрации, активирующей ГРц, не приводит к изменению уровня экспрессии мРНК для собственных рецепторов. А это значит, что глюкокортикоиды могут относительно длительное время стимулировать ГРц и таким образом усиливать индуцированный синтез мРНК соответствующих мембранных рецепторов. В результате происходит усиление сократительной реакции на воздействие ангиотензина II, вазопрессина и норадреналина. На данный момент непонятно за счет чего происходит ослабление серотонин-индуцированного ответа сосудов после инкубации с глюкокортикоидом. Вероятнее всего, за это ответственны вазодилататорные 5НТ-рецепторы, экспрессия которых при этом тоже может изменяться.
В настоящей работе подтверждено, что при десенситизации ГРц в аорте крысы не только значительно снижается уровень тотальной РНК, но и на 40% уменьшается относительное содержание мРНК для ГРц. Это означает, что десенситизация ГРц обусловлена снижением их экспрессии. Показано, что при десенситизации ГРц в аорте крысы в 2 раза падает уровень экспрессии мРНК АТ1А и VPlA-рецепторов, что приводит к снижению вазоконстрикторной реакции сосудов по отношению к ангиотензину II и вазопрессину. Полученные данные подтверждают высказанное нами предположение о том, что угнетение функциональной активности ГРц может являться одной из причин развития нарушений регуляции сосудистой сократимости.
Экспрессия 5НТ2А-рецепторов при десенситизации ГРц не изменяется, в то время как возрастает сократительная активность сосудов в ответ на действие серотонина, что указывает на иной механизм регуляции чувствительности кровеносных сосудов к серотонину. На наш взгляд, усиление прессорной реакции сосудов на серотонин на фоне истощения ГРц может происходить в результате повышения экспрессии генов других вазоконстрикторных 5НТ-рецепторов (например, «молчащих» в покое рецепторов типа 1 А) либо усиления связывания серотонина с 2А-рецепторами [1].
ЛИТЕРАТУРА
1. Кожевникова Л.М., Давыдова А.Г., Авдонин П.В. Деполяризация плазматической мембраны и активация рецепторов эндогенных вазоконстрикторов как возможные механизмы усиления вазоконстрикторного ответа на действие серотонина при травматическом шоке у крыс // Известия РАН. Серия биологическая. - 2009. - № 3. - С. 343-357.
2. Chalmers D.T., Kwak S.P., Mansour A. [et al.]. Corticosteroids regulate brain hippocampal 5-HT1A receptor mRNA expression // J. Neurosci. - 1993. - Vol. 13, № 3. - P. 914-923.
3. Haigh R.M., Jones C.T. Effect of glucocorticoids on alpha 1-adrenergic receptor binding in rat vascular smooth muscle // J. Mol Endocrinol. - 1990. - Vol. 5, № 1. - P. 41-48.
4. Haigh R.M., Jones C.T., Milligan G. Glucocorticoids regulate the amount of G proteins in rat aorta // J. Mol Endocrinol. - 1990. - Vol. 5, № 2. - P. 185-188.
5. Mantero F., Boscaro M. Glucocorticoid-dependent hypertension // J. Steroid Biochem Mol Biol. - 1992. -Vol. 43, № 5. - P. 409-413.
6. Mulvany M.J., Halpern W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats // Circ Res. - 1977. - Vol. 41, № 1. - P. 19-26.
7. Murasawa S., Matsubara H., Kizima K. [et al.]. Glucocorticoids regulate V1a vasopressin receptor expression by increasing mRNA stability in vascular smooth muscle cells // Hypertension. - 1995. - Vol. 26, № 4. - P. 665-669.
8. Ou X.M., Storring J.M., Kushwaha N. [et al.]. Heterodimerization of mineralocorticoid and glucocorticoid receptors at a novel negative response element of the 5-HT1A receptor gene // J. Biol. Chem. - 2001. -Vol. 27, № 276(17). - P. 14299-14307.
9. Saito N., Guitart X., Hayward M. [et al.]. Corticosterone differentially regulates the expression of Gs alpha and Gi alpha messenger RNA and protein in rat cerebral cortex // Proc Natl Acad Sci USA. - 1989. - Vol. 86, № 10. - P. 3906-3910.
10. Schiffrin E.L., Lariviere R., Li J.S., Sventek P. [et al.]. Deoxycorticosterone acetate plus salt induces overexpression of vascular endothelin-1 and severe vascular hypertrophy in spontaneously hypertensive rats // Hypertension. - 1995. - Vol. 25, № 4 (Pt 2). - P. 769-773.
11. Ullian M.E., Walsh L.G., Morinelli T.A. Potentiation of angiotensin II action by corticosteroids in vascular tissue // Cardiovasc Res. - 1996. - Vol. 32, № 2. - P. 266-273.
Бабичева Александра Геннадьевна, ассистент кафедры патологической физиологии ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121, тел. (8512) 52-41-43, е-mail: [email protected]
Тризно Николай Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121, тел. (8512) 52-53-14, е-шаП: [email protected]
