ВЛИЯНИЕ ГИПОКСИИ НА ЭКСПРЕССИЮ РЯДА ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ СО СПОРТИВНОЙ УСПЕШНОСТЬЮ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 577.21:796

ВЛИЯНИЕ ГИПОКСИИ НА ЭКСПРЕССИЮ РЯДА ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ СО СПОРТИВНОЙ УСПЕШНОСТЬЮ

К. В. Жур, Л. А. Кундас,

И. Б. Моссэ, д-р биол. наук, профессор,

Институт генетики и цитологии НАН Беларуси;

Г. М. Загородный, канд. мед. наук, доцент,

Республиканский научно-практический центр спорта

С. Л. Минин,

Городской центр олимпийского резерва по ледовым дисциплинам

Аннотация

Цель исследования - изучить влияние гипоксии на экспрессию генов HIF1A, MTHFR и UCP2, ответственных за физическую работоспособность спортсмена. Нами установлено достоверное увеличение среднегруппового уровня мРНК генов MTHFR и UCP2 и снижение активности гена HIF1A у спортсменов в ответ на интервальные гипоксические тренировки (при этом, обнаружены индивидуальные различия). Активность гена UCP2 у атлетов, имеющих разные варианты полиморфизма этого гена, различается: у обладателей генотипа Val/Val гена UCP2 показаны более высокие значения экспрессии гена по сравнению с носителями генотипов Val/Ala и Ala/Ala. Анализ активности генов позволяет контролировать реакцию атлета на физическую нагрузку и своевременно корректировать программу тренировок.

EFFECTS OF HYPOXIA ON GENE EXPRESSION ASSOCIATED WITH PHYSICAL PERFORMANCE

Abstract

The object of this study has been to determine the influence of hypoxia on HIF1A, UCP2 and MTHFR gene expression, responsible for physical performance of athletes. We found that average UCP2 and MTHFR mRNA levels significantly increased after hypoxic training, but the expression ofHIFIA decreased. Individual variations in these gene expressions have been observed. Gene expression of UCP2 varies in athletes having different variations in polymorphism of this gene: it has been higher for athletes with Val/Val genotype than for sportsmen with Val/Ala or Ala/Ala genotypes. Analysis of gene expression allows to control athlete's response to physical activity and correct training program accordingly.

Введение

В настоящее время спортивная генетика является весьма востребованной областью исследований, так как направлена на решение таких важных задач, как оценка предрасположенности атлета к определенным видам спорта, выявление вариантов генов, способствующих достижению высоких спортивных результатов, или ассоциированных с риском развития профессиональных патологий и др. Наличием полиморфных вариантов в генах, ответственных за спортивную деятельность, объясняется успех спортсмена в видах спорта определенной направленности, например, требующих развития выносливости либо скоростно-силовых качеств. Этим лее объясняется и различная реакция атлетов на одинаковую по объему и интенсивности физическую нагрузку, или, например, ответ на интервальную гипоксическую тренировку. Стандартный моле-кулярно-генетический анализ в спорте сводится к определению наличия того или иного варианта гена, ассоциированного с конкретным свойством организма, при этом не учитывается тот факт, что результативность спортсмена зависит не только от присутствия в генотипе определенных вариантов генов, но и от активности работы этих генов. Если генотип человека не меняется на протяжении всей жизни, то экспрессия генов, напротив, тканеспецифична и изменяется в зависимости от возраста, питания, выполнения физических нагрузок, приема фармакологических препаратов и др.

Спортсмен при физических нагрузках испытывает разные степени гипоксии в результате значительного повышения потребности в кислороде. В ответ на гипоксию организм постепенно адаптируется к условиям недостатка кислорода, повышается кислородная емкость крови, увеличиваются диаметр, длина и количество функционирующих капилляров в единице объема ткани, что способствует повышению скорости циркуляции крови и доставки кислорода тканям.

При этом растет количество митохондрий, ускоряется синтез дыхательных белков и ферментов, обеспечивающих более полную утилизацию кислорода в митохондриях, повышаются активность антиоксидной системы и антигипоксантные свойства тканей, что способствует усилению окислительных процессов и обеспечению устойчивости организма ко всем видам гипоксии [1, 2]. Зачастую, чтобы ускорить процесс адаптации и повысить аэробную производительность организма в профессиональном спорте, активно используют интервальные гипоксические тренировки (ИГТ) -эффективный метод, имитирующий условия высокогорья, основанный на перестройке деятельности дыхательной, сердечно-сосудистой и нервной систем в ответ на изменяющуюся концентрацию кислорода во вдыхаемой воздушной смеси при нормальном атмосферном давлении.

Сложный процесс адаптации организма к недостатку кислорода возможен благодаря активации генов, ответственных за все вышеперечисленные процессы. Активность генов, а следовательно и процесс адаптации к интенсивным физическим нагрузкам, имеет индивидуальный характер.

Цель работы - изучить влияние гипоксической тренировки на экспрессию генов HIF1A, MTHFR и UCP2 в периферической крови спортсменов. Для исследования выбраны лейкоциты, так как это первые клетки, после клеток легочной ткани, которые испытывают гипоксию. Ряд научных работ подтверждает, что уровень мРНК исследуемых генов в клетках крови коррелирует с уровнем мРНК этих лее генов в мышечной ткани [3]. Кроме того, этот материал является более доступным, а забор пробы менее болезненным и инвазивным по сравнению с биопсией мышечной ткани.

Выбор генов HIF1A, MTHFR и UCP2 для изучения экспрессии обусловлен анализом литературных данных, которые свидетельствуют о том, что продукты этих генов вносят существенный вклад в адаптацию спортсменов к интенсивным физическим нагрузкам. Продукт гена HIF1A является ведущим транскрипционным регулятором генов, ответственных за реакцию на недостаток кислорода, обеспечивает быстрые и адекватные ответы на гипоксический стресс, активизирует гены, регулирующие процесс ангиогенеза, вазомоторный контроль, энергетический метаболизм, эритропоэз и другие [4, 5]. Ген MTHFR играет важную роль в метилировании ДНК и, соответственно, регулирует экспрессию генов, в том числе генов, необходимых для адаптации к физическим нагрузкам [6, 7]. Продукт гена UCP2 является одним из представителей семейства разобщающих белков и принимает участие в термогенезе, регуляции обмена жиров и расхода энергии, защите от реактивных форм кислорода, а также влияет на секрецию инсулина и нейропротекцию [8].

Таким образом, анализ уровней экспрессии генов, ответственных за адаптацию атлета к физическим нагрузкам, позволит проводить более корректный отбор и специализацию начинающих спортсменов, а также подобрать оптимальную систему тренировочного процесса и индивидуального медико-биологического обеспечения.

Методы исследования

Протестировано 15 спортсменов высокой квалификации, входящих в состав национальной команды Республики Беларусь по конькобежному спорту, средний возраст - 22,3±0,8 лет. Эксперимент проводили в предсоревновательный период, характеризующийся выполнением больших объемов специальной тренировочной работы с высокой интенсивностью. Спортсмены тренировались в условиях гипоксии (моделируемая высота - до 3200 м) ежедневно по два часа на протяжении 14 дней по схеме, рекомендованной методическими рекомендациями, с постоянным контролем насыщаемости крови кислородом. Условия гипоксии создавались при помощи оборудования фирмы Low Oxygen systems (Германия), позволяющего без снижения атмосферного давления моделировать в условиях закрытых помещений воздействие на организм недостатка кислорода.

Забор крови проводили на второй день после начала гипоксических тренировок и после окончания блока тренировок (через 14 дней). В качестве биологического материала для исследования использовали ДНК и РНК, выделенные из лейкоцитов периферической крови с помощью наборов реагентов для экстракции нуклеиновых кислот (Синтол, Россия). Генотипирование генов осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с использованием праймеров и TaqMan-зондов собственного дизайна и набора реагентов для проведения ПЦР в реальном времени (Синтол, Россия).

Анализ экспрессии исследованных генов проводили методом ПЦР с обратной транскрипцией с ген-специфичными праймерами TaqMan Gene Expression Assays (Hs00153153_ml, Hs01075227_ml, Hs00195560_ml (Applied Biosystems)). Синтез кДНК проводили с помощью набора Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Уровень экспрессии изучаемых генов нормализовали относительно экспрессии гена «домашнего хозяйства» GAPDH (Hs03929097_gl(Applied Biosystems)). Детекцию флюоресценции, а также первичную обработку

результатов осуществляли программным обеспечением CFX Manager 3.1 прибора CFX96, BIO-RAD (США) в автоматическом режиме. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 10,0 (StatSoft Inc., США). Сравнение групповых средних показателей с целью определения статистической значимости различий между ними производилось с помощью применения критерия Манн-Уитни (Mann-Whitney U-test) в том случае, если число групп равно 2, в случае большего количества групп применяли методы дисперсионного анализа (ANOVA). Для проверки различий между двумя выборками парных измерений применяли критерий ранговой суммы Вилкоксона. Различия считались статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

Анализ изменения экспрессии генов у спортсменов в ответ на интервальную гипоксиче-скую тренировку выявил статистически достоверное увеличение активности генов MTHFR и UCP2: среднегрупповой уровень экспрессии гена MTHFR возрос с 0,20±0,02 усл. ед до 0,66±0,05; (р< 0,0007), гена UCP2 - с 0,39±0,05 до 1,55±0,09; (р < 0,0006). Результаты анализа представлены на рисунке 1.

Рисунок 1 - Изменение среднегруппового уровня экспрессии генов И1Е1Л ПСР2 (Б), МТИЕК (В) в ответ на интервальную гипоксическую тренировку

Увеличение экспрессии гена МТИЕК свидетельствует о запуске механизмов адаптации к тренировкам в условиях гипоксии. Это обусловлено тем, что фермент метилентетрагидрофола-тредуктаза, кодируемый геном МТИЕК, катализирует восстановление 5,10-метилентетрагидрофолата в 5-метилтетрагидрофолат. Последний является активной формой фолиевой кислоты, необходимой для образования метионина из гомоцистеина и далее S-аденозилметионина, играющего ключевую роль в процессе метилирования ДНК. В свою очередь метилирование ДНК контролирует активность многочисленных генов, в том числе задействованных в процессе адаптации к физическим нагрузкам и к гипоксии, а также ответственных за рост мышечной ткани и синтез митохондрий [6, 7].

Известно, что фермент, кодируемый геном ПСР2, влияет на энергетический метаболизм, контролируя выработку инсулина клетками поджелудочной железы. Например, экспрессия гена ПСР2 увеличивается в скелетных мышцах человека в ответ на тренировку аэробной направленности. Повышенная активность гена изменяет продукцию гликолитических и окислительных ферментов, в результате чего происходит сдвиг в сторону более экономного способа энергообеспечения -окислительного фосфорилирования [8]. Таким образом, увеличение экспрессии гена ПСР2 в лейкоцитах в ответ на интервальные гипоксические тренировки свидетельствует о переходе на более экономичный способ энергообеспечения.

В то лее время активность гена И1Е1Л, ключевого транскрипционного регулятора активности генов, ответственных за реакцию на недостаток кислорода, в нашем исследовании достоверно снизилась при воздействии гипоксии с 3,04±0,25 до 1,61±0,13; (р<0,001). Молено предположить, что в ответ на гипоксию уровень экспрессии гена И1Е1Л быстро и резко возрастает для запуска комплекса генов, ответственных за адаптацию к недостатку кислорода, поэтому в то время, когда активность данных генов увеличивается, экспрессия гена И1Е1Л уже снижается, поскольку ни одна биологическая система не может длительное время находиться в состоянии перенапряжения.

В отличие от среднегрупповых значений экспрессии генов, уровень их активности у разных спортсменов значительно варьирует. Например, у спортсмена № 11 экспрессия гена ПСР2 увеличилась в 1,8 раза после курса гипоксических тренировок, а у спортсмена № 14 - более чем в 12 раз, в то время как начальный уровень экспрессии у них составил 0,87 и 0,13 усл. ед. соответственно (рисунок 2А). Индивидуальные различия характерны и для экспрессии генов МТИЕК и И1Е1Л (рисунок 2Б, В).

UCP2

HIF1A

1,50 1,00 0,50 0,00

Ф

JJ[I ОТ J1 jj

м

вг

9 10 11 12 13 14 15

1 2 3 4 5 6 7

Номер образца □ до гипокситерапии В после ги п о кситер а п и и

А

5 5

г >.

о к

= -

Я ф

= 2— с

ш

■i

12 3

5 6 7

9 10 11 12 13 14 15

Номер образца

□ до гипокситерапии ■ после гипокситерапии

Б

MTHFR

*: F Л

I ! |[

i §

jP

Номер обрлзца

□ :to 1нпокснтсриши Н после пшоксшсрашш

В

Рисунок 2 - Изменение уровней экспрессии генов A) UCP2 Б) HIF1A В) MTHFR в группе спортсменов в ответ на интервальную гипоксическую тренировку

Индивидуальные различия в экспрессии генов у спортсменов могут объясняться наличием в их генах разных полиморфных вариантов. Мы проанализировали взаимосвязь полиморфизмов Val55Ala гена UCP2, С1774Т гена HIF1A, С1298А и С677Т гена MTHFR с уровнями их экспрессии у конькобежцев. Установлены статистически достоверные различия в активности работы гена UCP2 под воздействием гипоксических тренировок у обладателей генотипа Val/Val по сравнению с носителями генотипов Val/Ala и Ala/Ala (0,71±0,13 против 0,31±0,02 усл. ед. соответственно; р = 0.017) (рисунок 3). Для обладателей варианта Т677Т гена MTHFR характерны более низкие значения экспрессии гена по сравнению с аналогичными показателями у носителей генотипов С/Т ж С/С, однако они были статистически незначимы и определялись на уровне тенденции. Анализ полиморфных вариантов С1289А гена MTHFR и С1774Т гена HIF1A не выявил различий в экспрессии мРНК между группами спортсменов с различными генотипами.

Рисунок 3 - Экспрессия гена UCP2 у спортсменов в зависимости от полиморфизма Val55Ala на второй день интервальных гипоксических тренировок

Следовательно, результаты генотипирования по полиморфизму Val55Ala гена UCP2 позволяют прогнозировать адаптацию спортсменов к тренировкам. В случае носительства аллеля 55А1а уровень мРНК гена будет ниже, чем для носителей генотипа Val / Val, что в свою очередь повлияет на продукцию разобщающего белка, и, следовательно, на метаболизм свободных жирных кислот, секрецию инсулина и другие процессы, контролируемые этим геном, что важно учитывать при составлении индивидуальной программы тренировок спортсмена.

Несмотря на то, что в данной работе не выявлена достоверная ассоциация полиморфизма А1298С гена MTHFR с его экспрессией, в предыдущем исследовании [9] нами была установлена ассоциация генотипа А/А по гену MTHFR с более высокой аэробной производительностью, которая характеризуется такими показателями, как максимальное потребление кислорода, аэробная мощность, аэробный индекс и частота сердечных сокращений на пороге анаэробного обмена, что подтверждает влияние этого полиморфного варианта на спортивную успешность атлета. Молено предположить, что наличие полиморфного варианта С1298А гена MTHFR влияет не на его экспрессию, а на стабильность кодируемых им продуктов - мРНК или фермента метиле нтетрагидрофолатре дуктазы.

Таким образом, нагрузка одинаковой интенсивности изменяет экспрессию генов у разных спортсменов в разной степени и порой в различных направлениях. Полученные нами данные указывают на необходимость индивидуального подхода к составлению программы тренировок и медикаментозного обеспечения.

Заключение

Выявлено, что в ответ на стимулирующее и адаптирующее действие тренировок в условиях гипоксии происходит статистически достоверное увеличение среднегруппового уровня экспрессии генов MTHFR и UCP2. В то же время выявлено снижение активности гена HIF1A. Установлено, что уровни экспрессии генов, ассоциированных с физической работоспособностью, характеризуются значительной индивидуальной вариабельностью у спортсменов. В частности, различия в экспрессии гена UCP2 обусловлены наличием в генотипах спортсменов различных вариантов полиморфизма Val55Ala. Так, нами установлено, что для обладателей генотипа Val/ Val гена UCP2 характерны более высокие значения экспрессии гена по сравнению с носителями генотипов Val/Ala и Ala/Ala.

Следовательно, анализ уровня экспрессии генов, ответственных за реакцию на недостаток кислорода и, соответственно, за физическую работоспособность спортсмена, позволит контролировать реакцию атлета на физическую нагрузку и своевременно корректировать программу тренировок.

Таким образом, комплексный подход, включающий как анализ полиморфного состояния генов, так и степени их экспрессии, является информативным для оценки работоспособности и степени адаптации спортсмена к физическим нагрузкам.

Список использованных источников

1. Czuba, M. The effects of hypobaric hypoxia on erythropoiesis, maximal oxygen uptake and energy cost of exercise under normoxia in elite biathletes / M. Czuba, A. Maszczyk, D. Gerasimuk, R. Roczniok, O. Fidos-Czuba, A. Zajac, A. Golas, A. Mostowik, J. Langfort // J Sports Sci Med. - 2014. - № 1. - T. 13(4). P. 912-920.

2. Garvican-Lewis, L. A. Altitude Exposure at 1800 m Increases Haemoglobin Mass in Distance Runners / L. A. Garvican-Lewis, I. Halliday, С R. Abbiss, P. U. Saunders, С J. Gore // J Sports Sci Med. - 2015. - № 8. -T. 14(2). -P. 413417.

3. Zeibig, J. Do blood cells mimic gene expression profile alterations known to occur in muscular adaptation to endurance training? / J. Zeibig, H. Karlic, A. Lohninger, R. Damsgaard, G. Smekal // Eur J Appl Physiol. -2005. - № 95 (1). - P. 96-104.

4. Ameln, H., Physiological activation of hypoxia inducible factor-1 in human skeletal muscle / H. Ameln, T. Gustafsson, J. Sundberg, K. Okamoto, E. Jansson, L. Poellinger, Y. Makino // FASEB J. - 2005. - № 19 (8). -P.1009-1011.

5. LUNDBY, C. Regular endurance training reduces the exercise induced HIF-lalpha and HIF-2alpha mRNA expression in human skeletal muscle in normoxic conditions / C. Lundby, M. Gassmann // Eur J Appl Physiol. - 2006. - № 96 (4). - P. 363-369.

6. Terruzzi, I. Genetic polymorphisms of the enzymes involved in DNA methylation and synthesis in elite athletes / I. Terruzzi, P. Senesi, A. Montesano, L. Luzi // Physiol. Genomics. -2011. -№43 (16). - P. 965-973

7. Barres, R. DNA methylation in metabolic disorders / R. Barres, J. R. Zierath // Am J Clin Nutr. -2011. -№93(4). -P. 897-900.

8. Buemann, B. The association between the Val / Ala-55 polymorphism of the uncoupling protein 2 gene and exercise efficiency / B. Buemann, B. Schierning, S. Toubro, B. M. Bibby, T. Sorensen, L. Dalgaard, O. Pedersen, A. Astrup // Int J Obes Relat Metab Disord. - 2001. - № 25 (4). - P. 467-471.

9. Жур, К. В. Ассоциация полиморфизмов ряда генов физической активности с метаболическими показателями работоспособности / К. В. Жур, Л. А. Кундас, Е. В. Нестеренко, И. В. Головкова, С. П. Питомец, И. Б. Моссэ // Приложение к журналу «Весщ Нацыянальнаи акадэмп навук Беларуси Серия биологических наук; серия медицинских наук. - 2014. - Ч. 4. - С. 37-40.

31.07.2015

УДК 796:615.216.6

МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЗАПРЕЩЕННЫХ В СПОРТЕ ВЕЩЕСТВ И МЕТОДОВ: ОБЗОР ПОСЛЕДНИХ СОБЫТИЙ

Н. Г. Кручинский, д-р мед. наук, доцент,

Полессский государственный университет,

Национальная комиссия терапевтического использования запрещенных

в спорте веществ и методов

Аннотация

В статье изложены основные принципы Международного стандарта терапевтического использования запрещенных в спорте веществ и методов, разработанного Всемирным антидопинговым агентством, как обязательной к исполнению части Всемирной антидопинговой программы для всех стран-подписантов Всемирного антидопингового кодекса. Рассмотрены принципы организации работы по оформлению заявки на терапевтическое использование и алгоритм принятия решения по ее одобрению на примере атлетов национального уровня. В соответствии с новой редакцией Международного стандарта терапевтического использования запрещенных в спорте веществ и методов изложены основные изменения и направления деятельности комиссии по терапевтическому использованию.

INTERNATIONAL STANDARD OF THERAPEUTIC USE OF THE SUSBSTANCES AND METHODS PROHIBITED IN SPORTS: REVIEW OF THE LATEST DEVELOPMENTS

Abstract

The article describes basic principles of International standard of therapeutic use of the substances and methods prohibited in sports, developed by the World Anti-Doping Agency as a binding part of the World Anti-Doping Programme for all the countries that signed the World Anti-Doping Code. On the example of national-level athletes the principles of work organization on the preparation of application form of therapeutic use and procedure of decision making on its approval have been analyzed. According to the new version of International standard of therapeutic use of the substances and methods prohibited in sports the main changes and activities of the commission on therapeutic use have been stated.