CC BY
57
doi: 10.24411/0235-2451-2020-10806 УДК 633.34:57.043
Влияние гипо- и гипертермии на удельную активность ферментов класса оксидоредуктаз семян сои и множественность их форм
B. А. КУЗНЕЦОВА, А. А. БЛИНОВА, Л. Е. ИВАЧЕНКО
Всероссийский научно-исследовательский институт сои, Игнатьевское ш., 19, Благовещенск, Амурская обл., 675027, Российская Федерация
Резюме. Исследования проводили с целью определения роли ферментов класса оксидоредуктаз - супероксиддисмутазы (СОД), пероксидазы (ПОД), полифенолоксидазы (ПФО), каталазы (КАТ), в адаптации семян сои (Glycine max (L.) Merr) к воздействию широкого диапазона температур для дальнейшего создания новых продуктивных сортов сои или отбора среди уже зарегистрированных устойчивых к воздействию гипо- и гипертермии в условиях резко континентального климата. Объект исследования - семена, собранные с растений сои сорта Лидия, выращенных на луговой черноземовидной почве в Амурской области в 2019 г. Семена подвергали воздействию положительных температур - 4, 10, 37, 42 и 45 °С в течение 5 ч. Контроль -семена, выдержанные при температуре 23 °С. Под влиянием гипо- и гипертермии в семенах сои происходило увеличение уровня малонового диальдегида с 1,85 мкмоль/г сырой массы (в контроле) до 3,8 мкмоль/г сырой массы (температура 4 °С) и 5,22 мкмоль/г сырой массы (температура 45 °С), что свидетельствует о появлении окислительного стресса. Самую высокую суммарную активность ферментов (72,1 ед./мг белка, при величине этого показателя в контроле 38,5 ед./мг белка) наблюдали под действием температуры 10 °С. Для ПОД отмечена повышенная удельная активность, а для СОД - высокий полиморфизм форм, что позволяет использовать эти ферменты в качестве маркера повышенной устойчивости сои к воздействию температур. Результаты исследований свидетельствуют об участии ферментов группы оксидоредуктаз в защитно-приспособительных реакциях растений сои на воздействие гипо- и гипертермии.
Ключевые слова: соя (Glycine max (L.) Merr), гипотермия, гипертермия, перекисное окисление липидов, малоновый диаль-дегид, удельная активность, множественные формы, супероксиддисмутаза, полифенолоксидаза, пероксидаза, каталаза, оксидоредуктазы.
Сведения об авторах: В. А. Кузнецова, старший научный сотрудник (e-mail: kva@vniisoi.ru); А. А. Блинова, младший научный сотрудник; Л. Е. Иваченко, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник.
Для цитирования: Кузнецова В. А., Блинова А. А., Иваченко Л. Е. Влияние гипо- и гипертермии на удельную активность ферментов класса оксидоредуктаз семян сои и множественность их форм // Достижения науки и техники АПК. 2020. Т. 34. № 8.
C. 39-44. doi: 10.24411/0235-2451-2020-10806.
Influence of hypo- and hyperthermia on the specific activity of oxidoreductases of soybean seeds and the multiplicity of their forms
V. A. Kuznetsova, A. A. Blinova, L. E. Ivachenko
All-Russian Scientific Research Institute of Soybean, Ignatevsky highway, 19, Blagoveshchensk, Amurskaya obl., 675027, Russian Federation
Abstract. The purpose of the studies was to determine the role of oxidoreductase enzymes - superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), polyphenol oxidase (PPO), catalase (CAT) - in the adaptation of soybean seeds (Glycine max (L.) Merr) to a wide range of temperatures for further breeding of new productive soybean varieties or to select already registered varieties resistant to hypo- and hyperthermia in a sharply continental climate. The object of the study was the seeds collected from soybean plants of Lidia variety grown on meadow chernozem-like soil in the Amur region in 2019. The seeds were exposed to positive temperatures - 4 C, 10 C, 37
C, 42 C, and 45 C for 5 h. The control was the seeds kept at the temperature of 23 C. Under the influence of hypo- and hyperthermia, the level of malondialdehyde in soybean seeds increased from 1.85 umol/g of wet weight (in the control) to 3.8 umol/g of wet weight (at the temperature of 4 C) and 5.22 umol/g of wet weight (at the temperature of 45 C) that indicated the oxidative stress. The highest total enzyme activity (72.1 ME/mg of protein, with a value of this indicator in the control of 38.5 ME/mg of protein) was observed under the action of a temperature of 10 C. For POD, we noted increased specific activity, whereas for SOD, we noted a high polymorphism of forms that made it possible to use these enzymes as a marker of increased soybean's cold and heat resistance. The study results indicated the participation of oxidoreductase enzymes in the protective and adaptive reactions of soybean plants to the effects of hypo- and hyperthermia.
Keywords: soybean (Glycine max (L.) Merr); hypothermia; hyperthermia; lipid peroxidation; malondialdehyde; specific activity; multiple forms; superoxide dismutase; polyphenol oxidase; peroxidase; catalase; oxidoreductase.
Author Details: V. A. Kuznetsova, senior research fellow (e-mail: kva@vniisoi.ru; A. A. Blinova, junior research fellow; L. E. Ivachenko,
D. Sc. (Biol.), leading research fellow.
For citation: Kuznetsova VA, Blinova AA, Ivachenko LE. [Influence of hypo- and hyperthermia on the specific activity of oxidoreductases of soybean seeds and the multiplicity of their forms]. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2020;34(8):39-44. Russian. doi: 10.24411/02352451-2020-10806.
Во всем мире соя признана главной бобовой масличной сельскохозяйственной культурой. Для того чтобы удовлетворить постоянно растущий спрос на ее продукцию, необходимо создавать сорта, формирующие высокую стабильную продуктивность в неблагоприятных условиях среды [1]. Один из самых важных факторов, влияющих на формирование урожая сельскохозяйственных культур, в том числе сои, - погодные условия. Повышение температуры, изменение количества осадков, неустойчивый характер погоды,
связанное с ними распространение вредителей и болезней, становятся причиной частичной потери урожая еще на ранней стадии онтогенеза [1].
Основной регион возделывания сои в России -Амурская область, на долю посевов этой культуры в регионе приходится около 30 % от общей площади в России (857,1 тыс. га за 2019 г.). Климат области резко континентальный, поэтому колебания температур -один из ключевых факторов, оказывающих негативное влияние на урожайность сои [1, 2]. Летом часто наблю-
даются снижение температуры до 4 °С и повышение до 45 °С. Гипо- и гипертермия часто приводят к образованию активных форм кислорода (АФК), которые вызывают перекисное окисление липидов (ПОЛ), что в свою очередь способствует развитию окислительного стресса в растениях [3]. При этом начинаются повреждения на молекулярном уровне с нарушением функций белков и нуклеиновых кислот, а также структуры клеточных мембран (снижается их пластичность, увеличивается проницаемость для ионов водорода), что может снизить активность синтеза АТФ в клетке и вызвать энергетический голод [3, 4].
Анализ влияния гипо- и гипертермии на растения -удобная модель для изучения адаптивных возможностей клеток и организмов к воздействию окислительного стресса, ее широко используют в лабораторных исследованиях. Один из механизмов адаптации, в том числе к температурному фактору, на клеточном уровне - изменение интенсивности дыхания и снижение генерации АФК. При этом степень перекисного окисления липидов, которая характеризует уровень окислительного стресса, можно определить путем измерения концентрации малонового диальдегида (МДА) [4].
Адаптация к воздействию окислительного стресса происходит при активном участии антиоксидантной системы клетки, которая включает ферменты и низкомолекулярные вещества (флавоноиды и феноль-ные соединения, пролин, глутатион и аскорбиновая кислота) [5, 6]. В ответ на воздействие стрессового фактора чаще всего наблюдается накопление перечисленных низкомолекулярных соединений и изменение активности антиоксидантных ферментов - наиболее важных компонентов в регуляции АФК, образующихся при окислительном стрессе [7, 8]. Основные защитные ферменты в растениях - супероксиддисмутаза (СОД, ЕС 1.15.1.1), каталаза (КАТ, ЕС 1.11.1.6), пероксидаза (ПОД, ЕС 1.11.1.7) и полифенолоксидаза (ПФО, ЕС 1.10.3.1) [9]. Изменения структуры этих энзимов могут приводить к появлению новых их множественных форм и соответственно новых признаков протекания адаптации. Различные изоформы фермента обладают разной активностью при изменении условий среды, поэтому образование изоферментов с отличающейся молекулярной массой может служить свидетельством адаптивной реакции сельскохозяйственных культур к воздействию температурного фактора [10].
СОД - важнейшим фермент антиоксидантной системы (АОС) растений, который входит в первую линию защиты. Она катализирует реакцию восстановления супероксидрадикала до пероксида водорода. Реакция СОД на стрессовые факторы может быть различной. Высокий уровень ее активности зачастую коррелирует с устойчивостью растений к засухе, патогенным воздействиям, другим биотическим и абиотическим факторам [11]. Установлено снижение активности СОД при окислительном стрессе, вызванном гипотермией, воздействием пероксида водорода, углекислого газа [4, 10, 12].
КАТ - основной фермент АОС, ликвидирующий избыточные количества пероксида водорода, однако вследствие низкого сродства к субстрату она эффективна только при высоких концентрациях Н202. Реакция каталазы на действие стрессовых факторов может быть различной. Например, снижение ее активности наблюдали у теплолюбивых растений в условиях окислительного стресса, вызванного низкими температурами. При этом у более холодоустойчивых растений при
гипотермии активность КАТ практически не изменялась или незначительно увеличивалась [4].
ПОД - фермент АОС, очень чувствительный к любому внешнему воздействию. Ее активность меняется в зависимости от состава почв, температурного режима, влияния вирусных и бактериальных патогенов. ПОД участвует в ответе на раневой стресс, реагирует на поедание растения насекомым и вредителями. Активность фермента также повышается при усилении метаболизма - во время весеннего активного роста и в период цветения (при закладке генеративных органов и образовании плодов) [3].
ПФО - защитный фермент, который играет важную роль в деградации фенолов и флавоноидов сельскохозяйственных культур. Ферментативное потемнение -одна из значительных проблем качества зерновых культур, фруктов и др., которое обычно приводит к негативным последствиям для цвета, вкуса и аромата. Реакция обусловлена главным образом окислением по-лифенольных соединений ПФО. В стрессовых условиях ее активность в клетке возрастает, что препятствуем распространению АФК [13].
В связи с изложенным, активация АОС играет большую роль в защите растений от неблагоприятных факторов среды и рассматривается как важная составляющая их адаптации к неблагоприятным условиям, в том числе высоким и низким температурам. При этом особый интерес вызывает изучение реакции компонентов АОС на молекулярном уровне, позволяющее выяснить эколого-биологические механизмы адаптации сои к воздействию температур, что актуально при создании устойчивых к температурному фактору сортов [10, 12].
Цель исследований - установить роль оксидоре-дуктаз в приспособлении семян сои к влиянию гипо- и гипертермии при повышении уровня ПОЛ для создания новых продуктивных сортов или отбора среди уже зарегистрированных, устойчивых к воздействию гипо- и гипертермии в условиях резко континентального климата.
Условия, материалы и методы. В качестве объекта исследований использовали сою (Glycine max (L.) Merr) сорта Лидия, посевы которого занимают большие площади в регионе. Семена собраны с растений сои, выращенной на луговой черноземовидной почве опытного поля ФГБНУ ВНИИ сои в с. Садовое Амурской области в 2019 г. Для изучения влияния гипо- и гипертермии семена культуры выдерживали в чашках Петри в количестве по 25 шт. в 4-х повторностях в термостате электрическом суховоздушном охлаждающем (модель ТСО-1/80 СПУ) в течение 5 ч при температурах 4, 10, 37, 42 и 45 °С. Контроль - семена, выдержанные при 23 °С. Анализ активностей СОД, ПФО, ПОД, КАТ и содержание МДА в семенах сои проводили в лаборатории биотехнологии ФГБНУ ВНИИ сои.
Концентрацию МДА определяли, основываясь на его свойстве реагировать при высокой температуре в кислой среде с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), образуя при этом окрашенный триметиновый комплекс. Анализ выполняли в соответствии с методическими указаниями (Методы определенияредокс-статуса культивируемых клеток растений: учебно-методическое пособие / Г. В. Сибгатуллина, Л. Р. Хаертдинова, Е. А. Гумерова и др. Казань: КПФУ, 2011. 61 с.). Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при 532 нм и 600 нм против контроля, содержащего только реакционную смесь.
Для получения экстрактов растворимых белков се_ Достижения науки и техники АПК. 2020. Т 34. № 8
мян сои навеску материала (500 мг) гомогенизировали и экстрагировали в фарфоровых ступках в течение 15 минут при температуре 0...5 °С. Растворимые белки, содержащие ферменты класса оксидоредуктаз, экстрагировали в буфере, содержащем 15 мл раствора 0,15М хлорида натрия, затем центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин (Некрасова Г. Ф., Кисилева И. С. Руководство к лабораторным и практическим занятиям по «Экологической физиологии растений». Екатеринбург: Изд-во УГУ, 2008. 267 с.). После центрифугирования в надосадочной жидкости измеряли содержание белка по методу Лоури (Protein measurement with the Folin phenol reagent/ O. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr, et al. // Journal of Biological Chemistry. 1951. Vol. 193. No. 1. Pp. 265-275).
Активность СОД определяли спектрофотометриче-ским методом, который основан на способности фермента ингибировать фотохимическое восстановление тетразолиевого нитросинего. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Cary 50 при 560 нм против темнового контроля в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см (Методы биохимического исследования растений/А. И. Ермаков, В. В. Арасимович, Н. П. Ярош и др. Л.: Колос, 1972. 456 с.). Активность КАТ определяли спектрофотометрическим методом, который основан на измерении скорости разложения пероксида водорода каталазой исследуемого образца с образованием воды и кислорода (А. И. Ермаков и др., 1972). Активность ПОД определяли колориметрическим методом А. Н. Бояркина в модификации А. Т. Мокроносова, который основан на измерении скорости реакции окисления бензидина до образования бензидинового синего в присутствии пероксида водорода и пероксидазы (O. H. Lowry, et al., 1951). Активность ПФО определяли спектрофотометрическим методом А. И. Ермакова, который основан на измерении оптической плотности продуктов реакции, образовавшихся при окислении пирокатехина за определенный промежуток времени. Увеличение оптической плотности образца регистрировали на фо-тоэлектроколориметре КФК-2 при длине волны 590 нм в течение 2 мин в кювете с поглощающим слоем 2 см, интервал времени составлял 20 секунд [14]. Удельную активность СОД, КАТ, ПОД и ПФО определяли в двух
биологических и трех аналитических повторностях, ее значение выражали в ед/мг белка.
Электрофоретические спектры оксидоредуктаз выявляли методом электрофореза на колонках 7,5 %-ного полиакриламидного геля, определение энзимных форм на геле проводили соответствующими гистохимическими методами (Некрасова Г. Ф. и др., 2008; Polyphenol oxidase of bird cherry-oat aphid / A. Urbanska, M. Waluk,
H. Matok, et al. //Aphids and Other Homopterous Insects. 2001. Vol. 8. Pp. 55-64). Для выявленных множественных форм (МФ) ферментов определяли значения их относительной электрофоретической подвижности, которую обозначили Rf и строили схемы энзимограмм. Нумерация форм ферментов приведена от более высокоподвижных к низкоподвижным формам (Иваченко Л. Е. Ферменты как маркеры адаптации сои к условиям выращивания. Благовещенск: Изд-во БГПУ, 2011. 192с.). Каждой форме было присвоено свое сокращенное обозначение в соответствии со значениями их Rf (для каталазы - К1-К8, пероксидазы - ПОД1-ПОД18, супероксиддисмутазы - СОД1-СОД21, полифенолок-сидазы - ПФО1-ПФО19) [14].
Обработку результатов исследования осуществляли с использованием статистических средств STATISTICA 10. Оценку связи между активностью оксидоредуктаз, а также с уровнем МДА осуществляли на основе коэффициента корреляции. Достоверность изменений исследуемых параметров определяли по различиям средних значений с использованием критерия Стьюдента. В расчетах принят 5 %-ный уровень значимости.
Результаты и обсуждение. При влиянии температур 4 °С и 45 °С в семенах сои содержание МДА значительно повышалось, по сравнению с контрольными семенами, выдержанными при температуре 23 °С. Уровень МДА в контроле при этом составлял
I,85 мкмоль/г сырой массы, в условиях влияния низкой положительной температуры (4 °С) - 3,8 мкмоль/г сырой массы, высокой температуры 45 °С - 5,22 мкмоль/г сырой массы. Это характеризует увеличение степени ПОЛ в семенах сои, вызванное действием гипо- и гипертермии (рис. 1).
При воздействии остальных исследуемых температур (10 °С, 37 °С и 42 °С) уровень МДА значимо не отличался от его содержания в контрольных образцах,
Рис. 1. Диаграмма уровня МДА (а) и суммарной активности (А уд.) антиоксидантных ферментов класса оксидоредуктаз (б) семян сои, подверженных влиянию разных температур (погрешность на графике - доверительный интервал при 5 %-ном уровне значимости).
50
45
40
35
л
* 30
ф
\0 1- 25
20
ф
15
<
10
5
0
Л
Й
Й1
Ш
л
II
±1
ш
и
4
10
23
37
42
45
°С
Рис. 2. Диаграмма удельной активности (А уд.) оксидоредуктаз семян сои, подверженных влиянию разных температур (погрешность на графике - доверительный интервал при 5 %-ном уровне значимости): □ - СОД; □ - ПОД; ■ - КАТ; ■ - ПФО.
наличие окислительного стресса при этом не обнаружено, значит влияние этого диапазона температур находится в пределах зоны толерантности для изученного сорта.
Согласно литературным данным, влияние температуры на активность оксидоредуктаз неоднозначно и зависит не только от продолжительности и интенсивности действия фактора, но и от вида растения [11]. При анализе суммарной активности ферментов класса оксидоредуктаз установлено, что самого высокого уровня она достигает при воздействии на семена температуры 10 °С. Уровень МДА в этом варианте не превышал контроль, температуру в котором считают оптимальной для протекания биохимических процессов (так называемые нормальные условия). Следовательно, АОС семян сои достаточно успешно справляется с воздействием низкой закаливающей температуры, при этом происходит быстрая мобилизация защитной системы для снижения степени ПОЛ [2].
Самая низкая суммарная удельная активность, по сравнению с контрольными семенами, отмечена в образцах, подвергшихся влиянию температуры 45 °С, при этом уровень МДА достигал наибольшей величины, которая была в 3 раза выше, чем в контроле, что свидетельствует о повреждающем действии гипертермии на семена, которое способствует развитию окислительного стресса. Согласно литературным данным [9], при такой температуре образуются так называемые «стрессовые белки», что характеризует шоковое влияние гипертермии на растения. Скорее всего белки семян в этом случае уже подвергаются частичной денатурации и ферменты не устойчивы к такой высокой температуре. Значительное повышение суммарной активности исследуемых окислительно-восстановительных ферментов, по сравнению с контролем, обнаружено также при влиянии температур 4 °С и 42 °С, что характеризует их активацию в условиях гипо- и гипертермии.
Активность СОД и ПОД во всех исследуемых образцах была значительно выше активности КАТ и ПФО. Наибольшая удельная активность ПОД отмечена в варианте с кратковременным (в течение 5 ч) влиянием температуры 10 °С. При этом уровень МДА не отличался от контрольного, а активность других ферментов класса оксидоредуктаз была незначительно больше контроля, что свидетельствует о высокой отзывчивости ПОД на воздействие
внешних факторов (рис. 2). Кроме того, мы зафиксировали обратную зависимость между активностью ПОД и КАТ (коэффициент корреляции составляет -0,70), что связано со схожими функциями этих антиоксидант-ных ферментов в растениях, среди которых снижение количества активных форм пероксида водорода.
Под влиянием температур 37 и 42 °С активность СОД увеличилась, по сравнению с величиной этого показателя в контроле, в среднем в 3 раза. Одновременно возрастал уровень МДА, что свидетельствует о начинающемся окислительном стрессе. Это уже способствует образованию АФК, но в таких условиях фермент первой линии защиты АОС еще вполне активен и успешно справляется с нагрузкой, то есть быстро инактивирует образующиеся активные соединения, которые могут нанести вред (см. рис. 2). При этом установлена прямая зависимость между СОД и КАТ (коэффициент корреляции составляет 0,76), следовательно, указанные ферменты работаю «в паре», что может играть решающую роль в снижении окислительного стресса, вызванного действием гипо- и гипертермии.
Наименьшая удельная активность СОД отмечена в образцах, выдержанных при температуре 45 °С, при этом активность других оксидоредуктаз была выше, чем в контроле, что важно при воздействии этой температуры и помогает системе АОС справится с влиянием гипертермии.
При влиянии на семена сои температуры 10 °С активность СОД была в 2 раза выше, чем в контрольных, однако содержание МДА в этих вариантах находилось на одном уровне. Такие изменения указывают на закаливающее воздействие кратковременного (5 ч) влияния температуры 10 °С, то есть окислительный стресс еще не начался, но мобилизация защитной системы уже произошла, что значительно повышает резистентность семян сои, обеспечивает дружные всходы, увеличивает устойчивость к температурным перепадам на ранних этапах онтогенеза, когда происходят заморозки, и в итоге положительно влияет на урожайность. Результаты наших исследований о влиянии низких положительных температур на активность СОД не противоречат литературным данным [6, 10]. Например, Dogru с соавторами установили, что в листьях ячменя при воздействии температуры 2 °С в течение 24 ч произошло повышение активности СОД на 15 % от исходного уровня. После окончания действия гипотермии она медленно снижалась, возвращаясь к исходной величине через 48 ч [6].
Во всех изученных семенах сои, подверженных влиянию гипо- и гипертермии, за исключением варианта с низкой положительной температурой (4 °С), наблюдали повышение активности ПФО. Она более устойчива к воздействию внешних факторов, при этом сам фермент более стабилен. Наименьшую активность ПФО отмечали в семенах, выдержанных при температуре 4 °С, однако следует отметить, что в этом варианте фермент
Рис. 3. Схемы энзимограмм оксидоредуктаз семян сои, подверженных влиянию разных температур.
обладал самой высокой гетерогенностью - обнаружено наибольшее количество его форм (12). Это указывает на возможность быстрой биохимической адаптации семян сои к низким повреждающим температурам благодаря изменению в экспрессии генов. Самая высокая активность ПФО отмечена под действием гипертермии (42 °С), при этом было зафиксировано 9 МФ. Наименьшую гетерогенность ПФО наблюдали после воздействия температуры 37 и 45 °С, когда было выявлено по 7 форм фермента.
При влиянии температурного фактора на семена сои самой высокой гетерогеннностью обладал СОД, при этом стабильными и устойчивыми к воздействию широкого диапазона температур оказались низкомолекулярные формы СОД5 и СОД7, обнаруженные во всех исследуемых образцах (рис. 3). Следовательно, они принимают участие в адаптивных реакциях семян сои к воздействию внешних факторов. Для ПФО стабильных форм не обнаружено, в каждом образце отмечали индивидуальный спектр МФ, что свидетельствует о достаточно высокой лабильности ПФО и тонкой ее подстройке под разные факторы среды.
Наименьшей гетерогенностью СОД отличались семена, которые подвергали воздействию высокой температуры (45 °С), что соотносится с самой низкой активностью и подтверждает негативное влияние гипертермии.
Наибольшее число МФ СОД (14 шт.) обнаружено после воздействия закаливающей температуры 10 °С, при этом уровень МДА был близок к контролю, а удельная активность невысокой. Такие результаты свидетельству-
ют о хорошей адаптивной способности изученного сорта к влиянии этой температуры, следовательно, он холодоустойчив.
В оптимальных условиях при температуре 23 °С в семенах сои отмечен минимум активности и полиморфно-сти каталазы (5 изоформ). При температуре 37 °С минимум удельной активности фермента сохранялся, но число множественных форм каталаз снижалось, исчезли КАТ3, КАТ4 и КАТ5, которые не устойчивы в этом диапазоне температур. Нахождение семян сои в условиях повышенной температуры 42 °С приводило к возрастанию удельной активности каталаз, относительно контроля, в два раза, причем в этих условиях выявлено 5 форм фермента со средней 1^. После воздействия температуры 45 °С активность каталаз семян сои снижалась до минимума вследствие денатурации белка. Самыми устойчивыми к влиянию температурного фактора были формы КАТ2 и КАТ3, которые возможно способствуют наибольшему повышению активности фермента (см. рис. 3).
Под воздействием стрессовых температур 4 и 45 °С в семенах сои появилась только одна форма перокси-даз со средней - П6. В других вариантах отмечали высокомолекулярные формы с низкой которые обусловливают более высокую активность фермента. Выдерживание семян при температуре 37 и 42 °С привело к возникновению новых форм пероксидаз со средней и невысокой активности фермента.
Интересно, что в этом эксперименте не отмечена корреляция между удельной активностью оксидоредуктаз и уровнем МДА, при этом на энзимограмме мы наблюдали активные перестройки множественных форм этих ферментов как в качественном, так и в количественном соотношении. Следовательно, они способны быстро реагировать на внешние факторы и устранять образующиеся АФК, что повышает устойчивость сои к воздействию окислительного стресса.
Выводы. В результате проведенных исследований установлено, что воздействие различных температур на исследуемые образцы сои приводит к увеличению уровня МДА с 1,85 мкмоль/г сырой массы (в контроле) до 3,8 мкмоль/г сырой массы (в условиях влияния температуры 4 °С) и до 5,22 мкмоль/г сырой массы (при влиянии температуры 45 °С), что свидетельствует о появлении окислительного стресса в ее семенах. Установлены значительные изменения удельной активности оксидоредуктаз при возникновении окислительного стресса. Самую высокую суммарную активность ферментов наблюдали после воздействия температуры 10 °С. Она составила 72,1 ед./мг белка, при величине
этого показателя в контроле 38,5 ед./мг белка. Анализ энзимограмм ферментов СОД, КАТ, ПФО и ПОД показал активную экспрессию генов в ответ на воздействие температурного фактора. При этом выявлена высокая гетерогенность СОД и ПФО, низкая КАТ и ПОД.
Установленные закономерности можно использовать при создания новых продуктивных сортов сои или отбора среди уже зарегистрированных, устойчивых к воздействию гипо- и гипертермии в условиях резко континентального климата Амурской области.
Литература.
1. Синеговская В. Т., Наумченко Е. Т. Зависимость урожайности сои отэколого-агрохимических факторов//Российская сельскохозяйственная наука. 2019. № 3. С. 16-18. doi: 10.31857/S2500-26272019316-18.
2. Antioxidant responses of the pest natural enemy Hylyphantes graminicola (Araneae: Linyphiidae) exposed to short-term heat stress / Y. Zhao, Y. Li, M. He, et al.// Journal of Thermal Biology. 2020. Vol. 87. Article 102477. doi.org/10.1016/j.jtherbio.2019.102477.
3. Jumrani K., Bhatia V. S. Interactive effect of temperature and water stress on physiological and biochemical processes in soybean // Physiol Mol Biol Plants. 2019. Vol. 25. No. 3. P. 667-681. doi: 10.1007/s12298-019-00657-5.
4. Луцкий Е. О., Сундырева М. А., ХаблюкВ. В. Влияние водного и температурного стресса на активность антиоксидантных ферментов винограда // Плодоводство и виноградарство Юга России. 2019. № 56 (2). С. 110-121. doi 10.30679/2219-53352019-2-56-110-121.
5. Uniconazole confers chilling stress tolerance in soybean (Glycine max L.) by modulating photosynthesis, photoinhibition, and activating oxygen metabolism system / J. J. Zhao, N. F. Feng, X. X. Wang, et al. // Photosynthetica. 2019. Vol. 57. No. 2. P. 446-457. doi: 10.32615/ps.2019.059.
6. Dogru A., Cakirlar H. Efects of leaf age on chlorophyll fuorescence and antioxidant enzymes activity in winter rapeseed leaves under cold acclimation conditions // Brazilian Journal of Botany. 2020. Vol. 43. P. 11-20. doi: 10.1007/s40415-020-00577-9.
7. Lipids and proteins -major targets of oxidative modifications in abiotic stressed plants / N. A. Anjum, A. Sofo, A. Scopa, et al. // Environmental Science and Pollution Research. 2015. No. 22. Pp. 4099-4121.
8. Динамика активности супероксиддисмутазы и экспрессии кодирующих ее генов в листьях пшеницы при холодовой адаптации /Н. С. Репкина, А. А. Игнатенко, К. М. Панфилова, и др. //Труды Карельского научного центра Российской академии наук. 2017. № 5. С. 89-98. doi: 10.17076/eb573.
9. Иваченко Л. Е., Лаврентьева С. И., Кузнецова В. А. Активность каталаз, пероксидаз, амилаз, эстераз и рибонуклеаз сои в условиях температурного стресса //Вестник Московского государственного областного университета. Серия: Естественные науки. 2012. № 4. С. 24-31.
10. Measuring genes expression involved in enzymatic defense and ABA biosynthesis in Solanum lycopersicum L. (red cloud cultivar) under cold stress/N. Samadi, S. Saeidi-Sarb, H. Abbaspoura, et al.// Russian Journal of Plant Physiology. 2020. Vol. 67. No. 1. P. 131-138. doi: 10.1134/S1021443720010173.
11. Physiological responses of highland barley seedlings to NaCl, drought, and freeze thaw stress / Y. Chang, J. Zhang, G. Bao, et al. // Journal of Plant Growth Regulation. 2020. Vol. 39. Iss. 1. Pp. 1-8. doi: 10.1007/s00344-020-10085-5.
12. High temperature and drought stress cause abscisic acid and reactive oxygen species accumulation and suppress seed germination growth in rice / J. Liu, M. Hasanuzzaman, H. Wen, et al. // Protoplasma. 2019. Vol. 256. Pp. 1217-1227. doi: 10.1007/ s00709-019-01354-6.
13. Колесникова М. В. Активность ферментов полифенолоксидазы и пероксидазы под влиянием совместной запашки соломы озимой пшеницы и штамма Humicola fuscoatra ВНИИСС 016// Научный альманах. 2018. № 4-3 (42). С. 200-204. doi: 10.17117/na.2018.04.03.200.
14. Активность супероксиддисмутазы и полифенолоксидазы семян районированных сортов сои Амурской селекции / В. А. Кузнецова, А. А. Блинова, Л. Е. Иваченко и др. // Таврический вестник аграрной науки. 2019. № 3 (19). С. 86-93. doi: 10.33952/2542-0720-2019-3-19-86-93.
References
1. Sinegovskaya VT, Naumchenko ET. [Dependence of soybean yield on environmental and agrochemical factors]. Rossiiskaya sel'skokhozyaistvennaya nauka. 2019;(3):16-8. Russian. doi:10.31857/S2500-26272019316-18.
2. Zhao Y, Li Y, He M, et al. Antioxidant responses of the pest natural enemy Hylyphantes graminicola (Araneae: Linyphiidae) exposed to short-term heat stress. Journal of Thermal Biology. 2020;87: Article 102477. doi.org/10.1016/j.jtherbio.2019.102477.
3. Jumrani K, Bhatia VS. Interactive effect of temperature and water stress on physiological and biochemical processes in soybean. Physiol Mol Biol Plants. 2019;25(3):667-81. doi: 10.1007/s12298-019-00657-5.
4. Lutskii EO, Sundyreva MA, Khablyuk VV. [Effect of water and temperature stress on the activity of grape antioxidant enzymes]. Plodovodstvo i vinogradarstvo Yuga Rossii. 2019;(2):110-21. Russian. doi 10.30679/2219-5335-2019-2-56-110-121.
5. Zhao JJ, Feng NF, Wang XX, et al. Uniconazole confers chilling stress tolerance in soybean (Glycine max L.) by modulating photosynthesis, photoinhibition, and activating oxygen metabolism system. Photosynthetica. 2019;57(2):446-57. doi: 10.32615/ ps.2019.059.
6. Dogru A, Cakirlar H. Efects of leaf age on chlorophyll fuorescence and antioxidant enzymes activity in winter rapeseed leaves under cold acclimation conditions. Brazilian Journal of Botany. 2020;43:11-20. doi: 10.1007/s40415-020-00577-9.
7. Anjum NA, Sofo A, Scopa A, et al. Lipids and proteins -major targets of oxidative modifications in abiotic stressed plants. Environmental Science and Pollution Research. 2015;(22):4099-121.
8. Repkina NS, Ignatenko AA, Panfilova KM, et al. [Dynamics of superoxide dismutase activity and expression of genes encoding it in wheat leaves during cold adaptation]. Trudy Karel'skogo nauchnogo tsentra Rossiiskoi akademii nauk. 2017;(5):89-98. Russian. doi: 10.17076/eb573.
9. Ivachenko LE, Lavrent'eva SI, Kuznetsova VA. [Activity of soybean catalases, peroxidases, amylases, esterases and ribonucleases under temperature stress conditions]. Vestnik Moskovskogo gosudarstvennogo oblastnogo universiteta. Seriya: Estestvennye nauki. 2012;(4):24-31. Russian.
10. Samadi N, Saeidi-Sarb S, Abbaspoura H, et al. Measuring genes expression involved in enzymatic defense and ABA biosynthesis in Solanum lycopersicum L. (red cloud cultivar) under cold stress. Russian Journal of Plant Physiology. 2020;67(1):131-8. doi: 10.1134/ S1021443720010173.
11. Chang Y, Zhang J, Bao G, et al. Physiological responses of highland barley seedlings to NaCl, drought, and freeze thaw stress. Journal of Plant Growth Regulation. 2020;39(1):1-8. doi: 10.1007/s00344-020-10085-5.
12. Liu J, Hasanuzzaman M, Wen H, et al. High temperature and drought stress cause abscisic acid and reactive oxygen species accumulation and suppress seed germination growth in rice. Protoplasma. 2019;256:1217-27. doi: 10.1007/s00709-019-01354-6.
13. Kolesnikova MV. [Activity of polyphenol oxidase and peroxidase enzymes under the influence of joint plowing of winter wheat straw and the Humicola fuscoatra strain VNIISS 016]. Nauchnyi al'manakh. 2018;(4-3):200-4. Russian. doi: 10.17117/ na.2018.04.03.200.
14. Kuznetsova VA, Blinova AA, Ivachenko LE, et al. [Activity of superoxide dismutase and polyphenol oxidase of seeds of zoned varieties of soybeans of the Amur selection]. Tavricheskii vestnik agrarnoi nauki. 2019;(3):86-93. Russian. doi: 10.33952/2542-07202019-3-19-86-93.
