CC BY
39
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ПРИКЛАДНОЙ БИОЛОГИИ И БИОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ
А. А. Жук, О. И. Большакова
Влияние гиперэкспрессии гена АРР человека на холинэргические и дофаминэргические нейроны Drosophila melanogaster
Болезнь Альцгеймера - наиболее распространённая форма первичных дегенеративных деменций пожилого возраста, которая характеризуется расстройством памяти и когнитивных функций вплоть до распада интеллекта и психической деятельности в целом.
Ключевым нейроморфологическим проявлением заболевания является образование в головном мозге сенильных бляшек и нейрофибриллярных клубков. Появление сенильных бляшек вызвано накоплением в ткани мозга агрегатов токсичного р-амилоидного пептида (Ар), который образуется в результате процессинга белка АРР (amyloid precursor protein). В большинстве работ, исследующих эффекты гиперэкспрессии АРР в клеточных культурах или у трансгенных животных, наблюдаемые нейропатологические нарушения трактуются как результат нейротоксичного действия Ар или Ар -олигомеров и агрегатов.
Для исследования влияния гиперэкспрессии АРР на нейроны головного мозга мы использовали трансгенные линии Drosophila melanogaster, экспрессирующие в нервных клетках АРР человека. Ранее мы показали, что экспрессия АРР вызывает нейродегенерацию в мозге Drosophila, которая наблюдается в виде вакуолей различного размера, как в местах расположения нервных клеток, так и в нейропиле. В настоящей работе исследовано, как влияет экспрессия АРР на конкретные клеточные популяции, в частности холинергические и дофаминэргические нейроны.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Линии и условия содержания мух
В работе были использованы трансгенные линии Drosophila melanogaster: UAS-APP (содержит ген АРР человека), UAS-APP-Swedish (содержит ген АРР человека с мутацией Swedish, приводящей к наследственной форме БА), GAL4-Cha-UAS-GFP (содержит ген холинацетилтрансферазы, меченый зеленым флуоресцентным белком), w118, UAS-CD8-GFP, ple-GAL4. Во время проведения экспериментов мух содержали на стандартной дрожжевой среде при температуре 29 °С и 12-часовом световом дне.
222
Приготовление образцов для конфокальной микроскопии Для приготовления образцов для конфокальной микроскопии мух помещали в фосфатный буфер, головы отделяли от тела и помещали в фиксирующий раствор (4-процентный параформальдегид в фосфатном буфере) на 7 мин при комнатной температуре. После фиксации в фосфатном буфере выделяли мозг, который помещали на стекла с углублениями в раствор - фосфатный буфер : глицерин (1:1). Конфокальная микроскопия и анализ изображений Конфокальная микроскопия была проведена с помощью микроскопа LSM5 Pascal со встроенными 35-мВт аргонным лазером. Сканирование всех образцов проводилось при одинаковых настройках сканирования. Флуоресцентный сигнал визуализировали при длине волны Л=488 нм. Толщина оптических срезов при сканировании составляла 1 ^м. Оценка интенсивности флуоресценции была проведена на микрофотографиях конфокальных срезов в программе LAS AF. Подсчет дофаминэргических нейронов был проведен на микрофотографиях срезов в программе ImageJ (version 1.38a for Windows). Обрабатывали по шесть образцов мозга каждого генотипа для каждой временной точки. Опыт был повторен три раза. Анализ обучаемости и памяти трансгенных мух Тест на обучение и память к распознаванию запахов основан на способности Drosophila к выработке условных рефлексов. Во время обучения 50-70 мух помещаются в тестовую трубку, покрытую изнутри металлической сеткой. Через трубку насосом непрерывно прокачивается воздух. Имеется два вещества с сильным запахом -3’ октанол и 4-метилциклогексанол. В течение одной минуты вместе с током воздуха подается одно вещество, и в его присутствии мухи получают слабые удары электрическим током. Далее в течение одной минуты подается воздух без вещества и электрошока (время «отдыха»), а затем в течение минуты второе пахнущее вещество, но уже без электрошока. Сразу же после этой процедуры измеряется способность к обучению: мухи на 2 мин помещаются в Т-образную трубку («точку выбора») между встречными течениями двух запахов. Через час с помощью подобной процедуры проверяется способность мух к запоминанию. Индекс обучения и памяти вычислялся путем вычитания числа мух, сделавших неправильный выбор, из числа мух, сделавших правильный выбор, отнесенное к общему числу мух и умноженное на 100.
Статистическая обработка результатов Достоверность различий между контролем и вариантами эксперимента определяли с помощью метода однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA) и теста множественных сравнений Тьюки-Крамера (Tukye-Kramer test) программы Kyplot. Статистически значимыми считали различия при P < 0.05.
223
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ нейродегенерации холинэргических нейронов
Для анализа холинергических нейронов мы использовали линию UAS-Cha-GFP. Она несет ген ацетилхолинтрансферазы и последовательность зеленого флуоресцентного белка (GFP), что дает возможность визуализировать холинэргические нейроны, которые продуцируют этот фермент. Анализ холинергических нейронов проводили у потомков от скрещиваний мух генотипа GAL-Cha-UAS-GFP и мух линий UAS-APP, UAS-APP-Swedish и BACE; APP-Swedish на 3-5, 15 и 29- 30 день методом конфокальной микроскопии. Ацетилхолин является основным медиатором возбуждения в центральных синапсах Drosophila, поэтому в контрольной линии UAS-Cha-GFP наблюдались многочисленные сигналы флуоресценции большой плотности по всему мозгу, а также в глазных долях. Поэтому для оценки общего количества холинергических нейронов мы использовали анализ уровня общей флуоресценции в мозге. В образцах мозга всех генотипов свечение наблюдалось в одних и тех же структурах: в антеннальных долях, центральном комплексе, промежуточных нейронах рядом с антенниальными долями, аксонах грибовидных тел, Кеньон-клетках. Однако в опытных образцах значительное свечение было сконцентрировано в центральном комплексе и промежуточных нейронах рядом с антеннальными долями, а в самих антеннальных долях свечение было слабее или наравне с центральным комплексом. В контроле же наблюдалась обратная ситуация: в антенниальных долях свечение сильнее, чем в центральном комплексе. Используя программу ImageJ, мы определили относительный уровень интенсивности флуоресценции. На 3-5 день уровень флуоресценции был следующим: cha/+ - 24,0±0,3; cha/APP -
19.1 ± 1,3; cha; APP-Sw - 21,6±2,1; cha/BACE;APP-Sw - 22,1±2,4.На 15-17 день: cha/+ - 25,4±3,2; cha/APP - 16,3 ± 1,3; cha; APP-Sw -19,7±2,6; cha/BACE;APP- Sw - 19,2±1,8. На 27-30 день: cha/+ -29,9±2,1; cha/APP - 4,8±1,1; cha; APP-Sw - 6,4±0,1; cha/BACE;APP-Sw - 7,3±2,2.
Как видно из полученных данных, уровень флуоресценции на 35 день одинаков в контрольной и опытных линиях, в то время как на 15-17 день он понижен в линиях экспрессирующих АРР и драматически снижается в мозге мух этих линий на 27-30 день. В контрольной линии уровень флуоресценции оставался практически неизменным за все время опыта. Параллельно оценке состояния холинергических нейронов мы провели анализ способности мух к обучению и запоминанию на 15 день их жизни по методу Tully и Quinn. Способность к обучению в этом тесте оценивается индексом обучения, который был следующим: контроль (cha-GAL4 x Oregon)-
18.1 ±0,5; cha/ APP - 2,6±1,1; cha; APP-Swedish - 3,4±1,4; cha/BACE;APP-Swedish -2,5±0,6. Индекс запоминания показывает
224
память животных: контроль (cha-GAL4 x Oregon) - 16,75±0,75; cha/ APP - 0,75±0,2; cha; APP-Swedish - 2,6±1,2; cha/BACE;APP-Swedish -2,8±1,3.
Анализ нейродегенерации дофамиэргических нейронов
Для визуализации нейронов методом конфокальной микроскопии мы использовали трансгенную линию UAS-CD8-GFP, мембраны нервных клеток в которой мечены зеленым флуоресцентным белком. Дофаминэргические нейроны в мозге Drosophila собраны в небольшие кластеры, расположенные по всему мозгу. Используя программу ImageJ и объемные изображения мозга, сделанные с помощью конфокального микроскопа, мы провели автоматический подсчет дофаминэргических нейронов, на 3-5 день, 15-17 день и 27-30 день. На 3-5 день было следующее количество нейронов в мозге линий: CD8/+;ple/+ - 95,1±6,2; CD8/+;APP/+;ple/+ - 72,2±10,5; CD8/+;APP/BACE;ple/+ - 66,9±7,0; CD8/+;APP-Sw/ple - 71,8±9,9; CD8/+;BACE/+;APP-Sw/ple - 68,2±9,5. На 15-17 день: CD8/+;ple/+ -92,7±4,3; CD8/+;APP/+;ple/+ - 35,3±3,9; CD8/+;APP/BACE;ple/+ -47,6±5,7; CD8/+;APP-Sw/ ple - 41,2±6,7; CD8/+;BACE/+;APP-Sw/ple -38,3±4,6. На 27-30 день: CD8/+;ple/+ - 97,3±10,1; CD8/+;APP/+;ple/+ -16,4±1,5; CD8/+;APP/BACE;ple/+ - 28,0±4,0; CD8/+;APP-Sw/ ple -24,3±3,6; CD8/+;BACE/+;APP-Sw/ple - 27,4±3,9. Полученные результаты показывают, что количество дофаминэргических нейронов статистически достоверно снижается в линиях, экспрессирующих АРР, начиная с 15-17 дня. В то время как в контрольной линии количество дофаминэргических нейронов остается на том же уровне в течение всего опыта. Мы также провели анализ способности мух к обучению и запоминанию. Индекс обучения на 15-17 день составил: контроль (ple-GAL4 x Oregon) - 15,5±2,2; APP;ple - 1,8±0,9; ple; APP-Swedish - 4,3±1,1; APP/ BACE;ple - 1,5±0,6; BACE;APP-Swedish/ple -4,0±1,7. Индекс запоминания составил: контроль (ple-GAL4 x Oregon) - 12,6±1,3; APP;ple - 1,5±0,6; ple; APP-Swedish - 1,4±0,8; APP/BACE;ple - 1,3±0,9; BACE;APP-Swedish/ple - 1,6±0,7.
Мы исследовали чувствительность дофаминэргических и холинергических нейронов к экспрессии АРР, АРР-Swedish человека и к образованию Ар. Полученные нами результаты указывают, что гибель этих нейронов, вызываемая экспрессией АРР, может происходить в мозге Drosophila в отсутствии образования Ар. При этом, если гибель нейронов регистрируется с 15 дня жизни мух, то наблюдаемое резкое снижение по сравнению с контролем способности к обучению и запоминанию, указывает на более ранние события, связанные с дисфункцией синапсов. Наши данные дают возможность предположить, что первичный эффект мутаций в APP при семейных формах БА связан с нарушением синаптической функции, в которой этот белок играет ключевую роль.
225
