CC BY
99
УДК 612.821 ББК 28.67
Лобанов Сергей Александрович
доктор медицинских наук, профессор г. Уфа
Lobanov Sergey Alexandrovich
Doctor of Medical Science,
Professor
Ufa
Костарев Александр Юрьевич
кандидат педагогических наук, доцент г.Уфа
Kostarev Alexander Yurievich
Candidate of Pedagogics,
Assistant Professor g.Ufa
Корнаухов Владислав Юрьевич
преподаватель
Уфа
Kornaukhov Vladislav Yurievich
Lecturer
Ufa
Данилов Александр Викторович
преподаватель г. Уфа
Danilov Alexander Viktorovich
Lecturer
Ufa
Данилов Евгений Викторович
преподаватель
г.Уфа
Danilov Evgeny Viktorovich
Lecturer
Ufa
Хасанов Тимур Зиннурович
аспирант г. Уфа
Khasanov Timur Zinnurovich Post-graduate Ufa
Влияние гипердинамии на ультраструктуру и метаболизм мозжечка у крыс The Influence of Hyperdinamia on Ultrastructure and Metabolism of the Rats’ Cerebellum
В работе представлены данные морфофункциональных исследований мозжечка при гиперднамии. Показана динамика ультраструктуры клеток, соотношения классов гликозаминогликанов и липидных фракций.
The data of morphofunctional studies of the cerebellumin case of hyperdynamia are presented in the article. The dynamics of the cell ultrastructure, correlation between glycosaminoglycan classes and lipid fractions are presenred in the article as well.
Ключевые слова: мозжечок, гипердинамия, ультраструктура, гликозами-ногликаны, липиды.
Key words: cerebellum, hyperdinamia, ultrastructure, glycosaminoglycans, lipids.
Актуальность.
В литературе как отечественных, так и зарубежных исследователей отмечается, что гипердинамия оказывает выраженные влияния на организм в целом, на функционирование его органов и систем с формированием или механизмов адаптации или дезадаптации [9,11,12]. Известно, что при действии гипердинамии прослеживаются изменения в обмене веществ с образованием большого количества различных промежуточных продуктов, оказывающих по принципу обратной связи регулирующие влияния на обмен веществ в клетках [3,10,13]. К сожалению, в литературе недостаточно уделяется внимание влиянию гипердинамии на ультраструктуру и метаболизм клеток мозжечка [2, 12].
Целью настоящего исследования явилось изучение изменений ультраструктуры и метаболизма нейронов и клеток глии мозжечка в постстрессорный период.
Материалы и методы исследования.
Эксперименты выполнены на крысах массой 225-250 г, содержавшихся на стандартном рационе, в осенне-зимний период в дневное время суток. Животные были поделены на две группы.
Первая группа (17 крыс) служили контролем.
Вторая группа (56 крыс) подвергалась действию гипердинамии в течение 3-х суток при помещении крыс в небольшие клетки, снизу которых располагалась бегущая дорожка (15 минутный бег + 5 минутный отдых в течение 3 часов до обеда и 3 часов после обеда в одно и тоже время суток).
Животных выводили из эксперимента на 3, 7, 14 и 30 сутки после окончания действия гипердинамии. Осуществляли забор головного мозга и выделение мозжечка с ножками.
Для электронной микроскопии материал фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере при рН 7,2-7,4 с последующей до-фиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия (OsO4) в течение одного часа. Затем обезвоживания в спиртах возрастающей концентрацией от 50 - до 96% и помещали в ацетон [6,7]. Экспериментальный материал заливали смолой ЭПОН - 812. Ультратонкие срезы готовились на ультратоме LKB - III, затем контра-стировались уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу. Изучение ультраструктуры производилось на электронном микроскопе JEM - 100S при ускоряющем напряжении 90 кВ.
Гистохимические исследования для выявления гликозаминогликанов проводились на стандартных криостатных (гистологических) срезах толщиной 10 микрон путем окрашивания альциановым синим при разных рН и молярностях (MgCl2) с последующим метилированием и ферментативным контролем [1,4,5,8]. Полуколичественный анализ осуществлялся на анализаторе форео-грамм - АФ - 2.
Липиды мозжечка изучались методом микротонкослойной хроматографии на силикагеле. Забирали кусочки мозжечка массой 25 мг и ножки мозжечка 13 мг. Экстракция липидов проводилась по методу Фолча [1, 5]. Содержание липидов и отдельных его фракций определяли разложением с концентрированной серной кислотой.
Результаты проведенных исследований обрабатывались методом вариационной статистики.
Результаты и обсуждение.
Анализ результатов проведенных исследований показывает, что уже к 3 - 7 суткам после действия гипердинамии нейроны и клетки глии мозжечка контактировали между собой при помощи многочисленных цитоплазматических отростков. Ядра содержали хроматин, который располагался в нуклеоплазме относительно равномерно или пристеночно между ядерными порами. Цитоплазматический матрикс повышенной электронной плотности (рис.1). Рибосомы представлены в виде полисом, свободно расположенные в цитоплазме и фикси-
рованные на мембранах канальцев гранулярного эндоплазматического ретику-лума. Его просвет заполнен мелкозернистым веществом более высокой электронной плотности, чем цитоплазматический матрикс. Комплекс Гольджи занимал небольшой объем цитоплазмы и был представлен мелкими везикулами. В зоне комплекса Гольджи встречаются лизосомы. Митохондрии овальной или палочкообразной формы в цитоплазме располагаются неравномерно, чаще образуют скопления у оснований отростков.
ш
Рис. 1. Мозжечок крысы при гипердинамии. Клетки мозжечка. Эксперимент. 7 сутки. н - нейрон, ол - олигодендроцит, эпр - эндоплазматический ретикулум, л - лизосомы. ЭМФ х 23 000.
К 14 суткам эксперимента адаптация к физической нагрузке сопровождалась увеличением ядра, фрагментацией и инвагинациями в ядерной мембране увеличивающими ее протяженность. В ядерной мембране нейронов возрастает количество открывшихся пор. В цитоплазме большинства клеток Пуркинье, нейронов зернистого слоя наблюдается гранулярная цитоплазматическая сеть с густо расположенными рибосомами. В цитоплазме также свободно располагаются многочисленные полисомы, которые заполняют значительный объем тело клетки. Пластинчатый комплекс увеличивается в объеме, его цистерны узкие, и лишь крупные везикулы расширены. Реакция митохондрий проявляется в их конденсации, расширении и уплотнении крист.
К 30 суткам эксперимента в ткани мозжечка наблюдаются изменения тинк-ториальных свойств. Вокруг большинства клеток Пуркинье прослеживаются участки просветления. Некоторые участки ткани мозжечка имеют мозаичный характер. Это можно связать с выраженными явлениями химизма клеток. В этот период в большинстве клеток Пуркинье и нейронов зернистого слоя мозжечка крыс тельца Ниссля представлены в виде широких, лежащих почти параллельно цистерн эндоплазматического ретикулума, которые разделены практически одинаковыми промежутками шириной 0,2 - 0,5 мкм.
Наружная поверхность мембран, ограничивающих цистерны эндоплазматического ретикулума, усеяна рибосомами, которые располагаются рядами, петлями, спиралями или группами. Рибосомы располагаются также и свободно в цитоплазматическом матриксе между цистернами эндоплазматического ретикулума. Они были упакованы в виде небольших групп или розеток.
По данным проведенного исследования можно отметить, что строение телец Ниссля в разных нервных клетках мозжечка существенно отличается. В некоторых нейронах мембраны, образующие цистерны, сплошь усеяны рибосомами; свободными остаются лишь небольшие участки мембран. Преобладание в цитоплазме нейронов и клеток глии прикрепленных рибосом может быть связано с синтезом белковых структур, который накапливается в просветах цистерн и высвобождается из клетки в форме секреторных гранул. У большей части клеток мозжечка преобладающая часть белковых структур, синтезируемая ими расходуется на поддержание и обновление протоплазмы и органелл. В особенности эти процессы выражены в той части цитоплазмы клетки, которая заполняет аксон. Интенсивность белкового синтеза в нейронах исключительно высокая. Неравномерное распределение рибосом, прикрепленных к мембранах эндоплазматического ретикулума, ведет к тому, что граница между гранулярной и агранулярной формами этого ретикулума стирается и можно легко проследить, как одна форма ретикулума переходит в другую.
В этот же период наряду с повышением структурно-функциональной активности и интенсификации метаболизма, в цитоплазме некоторых нейронов прослеживалось развитие деструктивных процессов. Они проявлялись в обра-
зовании миелиноподобных фигур, мелких липидных тел диаметром до 0,1 мкм и локальной вакуолизацией цитоплазмы нейронов мозжечка. Выявлялись мелкие лизосомы, повышенной электронной плотности.
Гистохимические исследования позволили проследить особенности динамики разных классов гликозаминогликанов (рис. 2).
сутки
Рис. 2. Соотношение гликозаминогликанов в мозжечке крыс при экспериментальной гипердинамии.
К - контроль, ГК - гиалуроновая кислота, Х-4-С - хондроитин-4-сульфат,
Х-6-С - хондроитин-6-сульфат, Г-С - гепаран-сульфат.
Результаты гистохимических исследований показывают, что существенные изменения гликозаминогликанов наблюдаются уже к 3-м суткам после ги-пердинамии и характеризуются увеличением несульфатированных и слабо-сульфатированных форм.
Накопление кислых гликозаминогликанов в межклеточном матриксе мозжечка происходит на фоне заметного уменьшения количества гиалуроновой кислоты и накопления Х-4-С и Х-6-С. Это приводит к разрыхлению межклеточного вещества. Повышенное содержание Х-С способствует взаимодействию основного вещества с липидами, белками, солями и водой, что обусловливает инфильтрацию ткани. При гипердинамии в межклеточном матриксе мозжечка наблюдается уменьшение содержания гиалуроновой кислоты, что свидетельст-
вует об изменении в системе гиалурновая кислота - гиалуронидаза в сторону увеличения последней.
Указанные сдвиги качественного состава кислых гликозаминогликанов тканей, обладающих определенной биологической активностью в отношении ряда ферментативных систем, имеют существенное значение в адаптивных изменениях метаболизма мозжечка.
Анализ результатов проведенных исследований позволил изучить особенности динамики липидов и их фракций в мозжечке, как в контроле, так и при гипердинамии. Данные суммарного содержания липидов мозжечка и относительного количества их основных классов представлены на рисунке 3.
Результаты исследований показывают, что гипердинамия оказывает выраженное влияние на содержание липидов в мозжечке. В мозжечке крыс экспериментальной группы содержание общих липидов уменьшилось почти в 1,3 раза. При этом качественный состав липидов мозжечка при экспериментальной гипердинамии не отличался от контрольной группы. В тоже время количественные соотношения исследуемых липидных фракций значительно изменялись.
Рис. 3. Содержание липидов в мозжечке и ножках при гипердинамии.
Пр. М. - правое полушарие мозжечка, Л. М. - левое полушарие мозжечка,
Н. М. - ножки мозжечка.
Нами было выявлено, что более выраженные изменения наблюдались в группе холестерин - эфиры холестерина.
50 454035 30-(%) 25 2015 105 0
30 сутки
Рис. 4. Относительное содержание фракций липидов в мозжечке.
К - контроль, ФЛ - фосфолипиды; ДГ - диацилглицерины; Х - холестерин;
СЖК - свободные жирные кислоты; ТГ - триацилглицерины; ЭХ - эфиры холестерина
К
3
7
14
В мозжечке крыс экспериментальной группы отмечалось повышение свободного холестерина почти в 1,9 раза с одновременным уменьшением этерифи-цированного холестерина почти на 61 % от первоначальных значений.
Результаты экспериментальных исследований позволяют констатировать о том, что основной метаболической системой, которая активно участвует в процессе адаптация - дезадаптация при экспериментальной гипердинамии является холестеролэстеразная система.
Наблюдаемое уменьшение содержания свободных жирных кислот в условиях проведенного эксперимента можно объяснить дальнейшими поэтапными превращениями при образовании холестерина из эфиров холестерина.
Изучение ножек мозжечка, где преобладают аксоны и дендриты нейронов показывает, что содержание отдельных липидных классов под влиянием экспериментальной гипердинамии изменяется иначе, чем в самом мозжечке.
В ножках мозжечка было выявлено уменьшение содержания холестериновой фракции почти на 35 % от первоначальных значений.
В тоже время повышение содержания эфиров холестерина практически не было выявлено. При этом среди липидов прослеживалось повышение содержания диглицеридов.
60л
50-
40-
(%) 30-
20-
10-
і
ш
¿я
¿л
Ыьк
□ ФЛ
□ ДГ
□ Х
□ СЖК
□ ТГ
□ ЭХ
К 3 7 14 30 сутки
Рис. 5. Относительное содержание фракций липидов в ножках мозжечке.
К - контроль, ФЛ - фосфолипиды; ДГ - диацилглицерины; Х - холестерин;
СЖК - свободные жирные кислоты; ТГ - триацилглицерины; ЭХ - эфиры холестерина
Экспериментальные исследования позволяют отметить, что при действии гипердинамии в структурах ножек мозжечка, так же, как и в мозжечке, происходит уменьшение содержания общего количества липидов почти в 2 раза.
Комплексный анализ результатов проведенных исследований показывает, что в нейронах и клетках глии мозжечка крыс прослеживаются явления адаптации и дезадаптации к повышенной физической нагрузке. Процессы адаптации мозжечка к разным физиологическим состояниям на субклеточном уровне протекают в нейронах коры мозжечка неодинаково. Высокая структурнофункциональная активность нейронов коры находится в непосредственной связи с функциональной деятельностью мозжечка, его возбудимостью. Адаптация к необычному ритму жизни (в связи с ежедневным бегом крыс по дорожке) сопряжена с деструкцией ультраструктур нейронов. Однако приспособительная компенсаторная реакция связана с процессами репаративной и физиологической регенерации, темп которой также усиливается. Регуляторные механизмы нейронов, обеспечивая усиление метаболизма, соответственно повышают его затраты энергии.
0
Полученные результаты гистохимических исследований свидетельствуют о том, что в ответ на гипердинамию происходят значительные изменения в содержании и соотношении разных классов гликозаминогликанов в мозжечке и в его ножках. Динамика этих изменений носит временной характер. В механизме реагирования на гипердинамию, по-видимому, могут иметь место, не только перестройки метаболизма клеток и изменения соотношений разных классов гликозаминогликанов в ткани мозжечка, но также изменения метаболизма и транспорта этих соединений в головном мозге, а также крови и ликворе.
Гипердинамия у крыс оказывает заметное влияние на липидный компонент ткани мозжечка и его ножек. Выявлено, что в разных полушариях мозжечка содержание липидов неравномерное. Эти изменения сохраняются и в условиях гипердинамии. При этом, если общее количество липидов под влиянием гипер-динамии снижается в мозжечке и ножках, относительное содержание отдельных липидных фракций изменяется по-разному, с участием принципиально различных механизмов взаимоотношений между ними. Обнаруженные изменения, вероятно, связаны с различной ролью мозжечка и его ножек в реализации ответной реакции крыс на гипердинамию.
Таким образом, полученные данные показывают, что ткань мозжечка активно реагируют на воздействие гипердинамии. Эти изменения затрагивают ультраструктурные компоненты клетки, клеточные и внутриклеточные мембраны и межклеточный матрикс. Структурные и функциональные изменения мембран напрямую зависят от состояния липидов и гликозаминогликанов.
Прослежено, что липидный компонент, входящий в состав мембранных структур и гликозаминогликаны которые формируют гликокаликс, изменяется довольно значительно. Однако, механизмы, с помощью которых изменяются гликозаминогликаны и липиды в ответ на воздействие гипердинамии, различны для изученных тканей и зависят, очевидно, от многих факторов, в том числе, их структуры, выполняемых функций и метаболических отношений.
Результаты исследования свидетельствуют также о принципиально различных механизмах взаимоотношений между отдельными липидными фрак-
циями в изученных отделах мозжечка крыс и связаны, вероятно, с их различной ролью в реализации ответной реакции организма на стресс.
Библиографический список
1. Берстон М. Гистохимия ферментов / М. Берстон.- М.: Мир, 1965.- 464 с.
2. Биохимия мозга: учебн. пособие / Под ред. И.П. Ашмарина, П.В. Стукалова, Н.Д. Ещенко. - СПб: Изд. СПб гос. университета, 1999. - 328 с.
3. Гольберг Н.Д. Активность триглицеридлипазы и транспорт жирных кислот при предельных физических нагрузках адаптированных к мышечной деятельности крыс / Н.Д. Гольберг, Б.И. Фельдкорен, В.А. Рогозкин // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2000. Т. 86. № 10. - C. 1331-1336.
4. Камышников В.С. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика: справочник в 2 т. / В.С. Камышников. - Мн.: Интерпрессервис, 2003. - Т.1 - 495с., ил. Т.2 - 463 с., ил.
5. Кононский А.И. Биохимия животных / А.И. Кононский. - М.: Колос, 1992. - 526 с.
6. Кравцова А.И. Электронно-микроскопическое изучение коры мозжечка мышей в норме и при недостатке белка и калорий в пище: автореф. дисс. ... канд. биолог. наук / А.И. Кравцова. - М.: 1986. - 18 с. - Библиогр.: 15 назв.
7. Лобанов С.А. Мозжечок и стресс: монография / С.А. Лобанов, Т.Ф. Емелёва. - Уфа: Вагант, 2005. - 112 с.
8. Лупа Х. Основы гистохимии. - М.: Мир, 1980. - 344 с.
9. Морфофункциональные изменения митохондрий при стрессе. / Лобанов С.А., Данилов А.В., Данилов Е.В., Асаева С.К., Арсланова Г.Ф. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - №12. - С. 699-702.
10. Attwell P.J. Cerebellar function in consolidation of a motor memory / P.J. Attwell, S.F. Cooke, C.H. Yeo // Neuron. - 2002. № 34. - P. 1011 - 1020.
11. Morara S. Ultrastructural analysis of climbing fiber-Purkinje cell synaptogenesis in the rat cerebellum / S. Morara // Neuroscience. - 2001. - № 108. - P. 655-671.
12. Mostert S. Effects of a short-term exercise training program on aerobic fitness, fatigue, health perception and activity level of subjects with multiple sclerosis / S. Mostert, J. Kesselring // Mult. Scler. - 2002. - № 8. - P. 161-168.
13. Ohyama T. Latent acquisition of timed responses in cerebellar cortex / T. Ohyama, M.D. Mauk // J. Neurosci. - 2001. - № 21. - P. 682-690.
Bibliography
1. Attwell, P.J. Cerebellar Function in Consolidation of a Motor Memory / P.J. Attwell, S.F. Cooke, C.H. Yeo // Neuron. - 2002. № 34. - P. 1011 - 1020.
2. Berston, М. Histochemistry of Ferments / М. Berston.- М.: Мк, 1965.- 464 p.
3. Biochemistry of Cord: Manual / under the Editorship of I.P. Ashmarin, P.V. Stukalov, N.D. Еshchenko. - SPb:Publishing House of SPb State University, 1999. - 328 p.
4. Kamyshnikov, V.S. Clinicobiochemistry Laboratory Diagnostics: Reference Book in 2 Vol. / V.S. ^mysh^^^. - М: Interpressservice, 2003. - Vol.1 - 495 p., ill. Vol.2 - 463 p., ill.
5. ^m^nsky, А.1. Animal Biochemistry / А.1. fomonsky. - М.: fo^los, 1992. - 526 p.
6. ^avtsova, А.1. Electron Microscopical Study of Mice’s Cerebellar Cortex in Health and in the Lack of Protein and Calories in Food: Synopsis of a Thesis ... Cand. of Biology / А.1. Кravtsova. - М.: 1986. - 18 p. - Biblior.: 15 Items.
7. Lobanov, SA. Cerebellum and Stress: Monograph / SA. Lobanov, ТГ. Еmelyeva. - Ufa: Vagant, 2005. - 112 p.
8. Lupa, Kh. The Bases of Histochemistry. - М.: Мк, 1980. - 344 p.
9. Morara, S. Ultrastructural Analysis of Climbing Fiber-Purkinje Cell Synaptogenesis in the Rat Cerebellum / S. Morara // Neuroscience. - 2001. - № 108. - P. 655-671.
10. Morphofunctional Changes of Mitochondrion under Stress Conditions / Lobanov SA., Danilov АУ., Danilov ЕУ., Аsaeva S.K, Аrslanova G.F. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2007. - №12. - P. 699-702.
11. Mostert, S. Effects of a Short-Term Exercise Training Program on Aerobic Fitness, Fatigue, Health Perception and Activity Level of Subjects with Multiple Sclerosis / S. Mostert, J. Kesselring // Mult. Scler. - 2002. - № 8. - P. 161-168.
12. Ohyama T. Latent Acquisition of Timed Responses in Cerebellar Cortex / T. Ohyama, M.D. Mauk // J. Neurosci. - 2001. - № 21. - P. 682-690.
