CC BY
16
УДК 577.112.6:577.112.382.
ВЛИЯНИЕ ГИДРОКСИПРОЛИН- И ПРОЛИНСОДЕРЖАЩИХ ГЛИПРОЛИНОВ НА ЭТАНОЛОВОЕ ЯЗВООБРАЗОВАНИЕ У КРЫС
К.Е. Багликова, А.В. Труфанова, З.В. Бакаева, Г.Е. Самонина, Л.А. Андреева, П.А. Климова, Б.В. Васьковский
(кафедра физиологии человека и животных; e-mail: g_samonina@ mail/ru; kema_baglikova@mail.ru)
Семейство глипролинов включает в себя дипеп-тиды Gly-Pro, Pro-Gly, Hyp-Gly и Gly-Hyp, а также трипептиды, сочетающие в разных последовательностях те же аминокислотные остатки, например Pro-Gly-Pro, Hyp-Gly-Pro, Pro-Gly-Hyp и т.п. Эндогенным источником глипролинов является коллаген, изобилующий повторами триплетов Gly-X-Y, где в X и Y позициях чаще всего расположены пролин и 4-гидроксипролин (или аланин) соответственно (Ramshaw et al., 1998). Процентное содержание данных аминокислот в коллагене составляет: Gly - 33,5%, Pro - 11,8, Hyp - 9,2, Ala - 10,9% (Rainey et al., 2002). Одним из источников образования глипролинов является гидролиз только что синтезированного коллагена (по данным разных авторов, от 10 до 60% от синтезированного коллагена) с образованием пептидов, состоящих менее чем из 5 аминокислот (Bienkowski, 1989; Rennard et al., 1982). Гидролиз пищевых соединительнотканных белков также может быть источником глипролинов. Добавление желатина (гидролизован-ный коллаген) в качестве пищевой добавки к обычному рациону крыс сопровождается четким протекторным противоязвенным эффектом на этано-ловой модели язвообразования (Исаев и др., 2003).
Широкий круг биологических активностей глипролинов (влияние на систему гемостаза (Ляпина и др., 2002), нейропротекторные эффекты (Бадмае-ва и др., 2005), влияние на гомеостаз слизистой оболочки желудка (СОЖ) (Samonina et al., 2002; Жуйкова и др., 2003; Бакаева, Самонина, 2005), снижение дегрануляции тучных клеток (Умарова и др., 2003)) позволяет считать их перспективными фармакоагентами.
Ранее в нашей лаборатории были исследованы протекторные противоязвенные свойства таких глипролинов, как PG, GP, PGP. Замена Pro на Hyp в дипептидах приводит к отмене противоязвенного эффекта в случае Hyp-Gly. Gly-Hyp, так же как и Gly-Pro, не эффективен в отношении этаноловых повреждений СОЖ (Бадмаева и др., 2004).
Патогенез повреждающего действия этанола включает множество различных механизмов, но на сегодняшний день большинство авторов сходятся во мнении, что при действии этанола нарушение гомеостаза слизистой желудка связано, в основном, с его прямым вазоконстрикторным действием
на кровеносные сосуды СОЖ с одновременным нарушением их проницаемости, что приводит к ишемии СОЖ и генерации свободных радикалов (КаИа ег а1., 1997; ИБ^ку ег а1., 1995).
Цель исследования
В связи с тем, что в цепочках коллагена в значительных количествах были обнаружены последовательности, где пролин замещен на гидроксипро-лин, перед нами была поставлена задача: 1) выяснить, проявляют ли противоязвенную активность трипептидные фрагменты коллагена, в которых пролин замещен на гидроксипролин: Нур^1у-Рго, Рго^1у-Нур и сопоставить возможные эффекты пептидов с эффектом Рго^1у-Рго; 2) исследовать влияние новых синтетических глипролиновых оли-гопептидов G1y-Pro-G1y, G1y-Pro-G1y-Pro, Рго^1у-Рго^1у, Рго^1у-Рго^1у-Рго, Рго^1у-Рго-Рго^1у-Рго, G1y-Pro-G1y-Pro-G1y-Pro на гомеостаз слизистой оболочки желудка.
Материалы и методы исследования
В опытах на этаноловой модели язвообразова-ния использовали белых беспородных крыс-самцов массой 200—250 г. За 18 ч до опыта животных лишали пищи и воды. Экспериментальные клетки с животными были снабжены специальными решетчатыми полами для исключения капрофагии.
Этаноловые повреждения вызывали внутриже-лудочным введением 96°-го этанола (1 мл/200 г веса). Забой проводили через 1 ч после введения этанола. Этаноловые повреждения подсчитывали следующим образом: оценивали площадь отдельного повреждения в каждом желудке в мм2, сумму площадей всех повреждений в данном желудке и среднюю площадь повреждений в каждой группе. Противоязвенное действие препарата оценивали по отношению площади повреждений у опытных животных к площади повреждений у контрольных крыс в процентах.
Исследуемые пептиды
G1y-Pro, Рго^1у, Рго^1у-Рго, G1y-Pro-G1y, G1y-Рго^1у-Рго, Рго^1у-Рго^1у, рго^1у-рго^1у-рго, Рто^у-Рго-Рю^у-Рго, G1y-Pro-G1y-Pro-G1y-Pro,
Gly-Hyp, Hyp-Gly, Hyp-Gly-Pro, Pro-Gly-Hyp, растворенные в физиологическом растворе непосредственно перед экспериментом, вводили внутрибрю-шинно и внутрижелудочно за 1 ч до начала действия ульцерогенного агента в дозе 3,7 мкмоль/кг (а в случае внутрижелудочного введения еще и 0,37 мкмоль/кг) в объеме 0,5 мл/200 г массы тела экспериментального животного. Контрольные животные получали по той же схеме равный объем изотонического раствора натрия хлорида. В работе были использованы пептиды Hyp-Gly, Gly-Hyp, Pro-Gly ("Bachem"), Hyp-Gly-Pro, Pro-Gly-Hyp (синтезированы в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова), Gly-Pro (Швейцария), Pro-Gly-Pro, Gly-Pro-Gly, Gly-Pro-Gly-Pro, Pro-Gly-Pro-Gly, Pro-Gly-Pro-Gly-Pro, Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro, Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro (синтезированы в лаборатории регуляторных пептидов Института молекулярной генетики РАН).
Статистическая обработка
Статистическую обработку результатов проводили при помощи компьютерного теста ANOVA с использованием параметрического LSD-теста. Различия считали значимыми при P < 0,05. Данные представлены в таблицах в виде среднего ± стандартная ошибка среднего.
Результаты и обсуждение
На этаноловой модели язвообразования (внутри-брюшинное (табл. 1) и внутрижелудочное (табл. 2, 3)
Таблица 1
Влияние внутрибрюшинного введения глипролинов в дозе 3,7 мкмоль/кг на этаноловое язвообразование у крыс
Таблица 2
Влияние внутрижелудочного введения глипролинов в дозе 3,7 мкмоль/кг на этаноловое язвообразование у крыс
Группа Средняя площадь, мм2 Количество животных (n) Значение Р
Control 47,28 ± 3,2 81
GH 43,52 ± 8,6 8 0,712266
HG 30,61 ± 4,6 8 0,102961
HGP 39,73 ± 6,3 9 0,435287
PGH 54,05 ± 15,9 7 0,536828
GP 47,04 ± 5,2 11 0,978006
PG 8 ± 2,2 11 0,000013
PGP 17,02 ± 2,4 19 0,000022
GPG 52,77 ± 5,5 11 0,534595
GPGP 13,22 ± 2,3 7 0,001843
PGPG 46,53 ± 16,4 7 0,945250
PGPGP 42,68 ± 9,1 6 0,692992
GPGPGP 16,69 ± 6,1 10 0,001017
PGPPGP 59,37 ± 19,3 5 0,340724
Таблица 3
Влияние внутрижелудочного введения глипролинов в дозе 0,37 мкмоль/кг на этаноловое язвообразование у крыс
Группа Средняя площадь, мм2 Количество животных (n) Значение Р
Control 47,28 ± 3,2 81
GH 33,25 ± 4 8 0,174181
HG 40,36 ± 8,2 8 0,502330
HGP 39,47 ± 6,8 9 0,424259
PGH 53,9 ± 17,7 4 0,642229
PG 33,15 ± 14,9 6 0,230451
PGP 17,06 ± 3,8 17 0,000059
GPG 57,54 ± 12,6 11 0,423689
GPGP 36,47 ± 19,9 4 0,448411
PGPG 92,9 ± 33,2 6 0,000130
PGPGP 59,41 ± 29,4 4 0,394632
GPGPGP 17,76 ± 6,6 13 0,000442
PGPPGP 134,25 ± 34,8 4 0,000000
введение) гидроксипролиновые трипептиды Нур-Gly-Pro и Рго^1у-Нур не только не снижали площадь этаноловых повреждений, а проявляли тенденцию к их увеличению. Дипептиды G1y-Hyp и Нур^1у, как было показано ранее, также не влияли на гомеостаз слизистой оболочки желудка, а G1y-Hyp даже достоверно увеличивал их по отношению к контролю (Бадмаева и др., 2004). Из 9 исследуемых пролинсодержащих глипролинов повы-
Группа Средняя площадь, мм2 Количество животных (n) Значение Р
Control 49,15 ± 3,3 85
GH 75,43 ± 11,2 18 0,004341
HG 43,46 ± 10,3 21 0,508370
HGP 70,82 ± 9,7 4 0,230044
PGH 53,07 ± 37,06 4 0,827582
GP 47,21 ± 9,9 7 0,889166
PG 16,2 ± 1,5 7 0,018103
PGP 15,69 ± 3,1 18 0,000304
GPG 53,47 ± 9,6 5 0,789857
GPGP 19,95 ± 5 16 0,002586
PGPG 62,4 ± 11,8 15 0,180211
PGPGP 40,41 ± 8,7 16 0,363864
GPGPGP 21,98 ± 4,4 17 0,004014
PGPPGP 50,31 ± 14,6 12 0,914451
шают гомеостаз СОЖ к действию этанола только PG, PGP, GPGP, GPGPGP (табл. 1-3). Мы решили сопоставить величины противоязвенных эффектов для каждого из эффективных пролинсодержа-щих глипролинов при разных способах введения (внутрибрюшинном и внутрижелудочном) и введении разных доз (3,7 мкмоль/кг и 0,37 мкмоль/кг). При внутрибрюшинном введении (3,7 мкмоль/кг) все 4 пептида проявляли протекторную противоязвенную активность, причем тенденцию к наибольшей продемонстрировали PG и PGP, а к наименьшей — GPGPGP (рисунок). Введение такой же дозы внутрижелудочно привело к увеличению противоязвенного эффекта для PG и небольшой тенденции к уменьшению для GPGP и GPGPGP (рисунок). Противоязвенная активность PGP практически
не изменялась. PG и GPGP оказались не эффективны в отношении этаноловых повреждений при снижении дозы до 0,37 мкмоль/кг (рисунок). Противоязвенные эффекты PGP и GPGPGP в этой же дозе остались такими же, как и при введении дозы 3,7 мкмоль/кг.
Анализируя влияние исследуемых пептидов на этаноловое язвообразование у крыс, можно сделать вывод о том, что в дипептиде Gly-Pro замена Pro на Hyp не влияет на величину этаноловых гемор-рагий, что совпадает с ранее полученными результатами нашей лаборатории (табл. 1). В Pro-Gly и Pro-Gly-Pro подобная замена приводит к обратному эффекту. Hyp-Gly, в отличие от Pro-Gly, не влияет на величину этаноловых геморрагий (табл. 1). В Pro-Gly-Pro замена N- или C-концевого пролина на гидроксипролин также приводит к изменению противоязвенных свойств. Hyp-Gly-Pro и Pro-Gly-Hyp не только не уменьшают площадь этаноловых повреждений, но даже проявляют тенденцию к их увеличению (табл. 1).
Обобщая полученные нами результаты, следует отметить, что гид-роксипролинсодержащие пептиды не эффективны в отношении периферических механизмов ульцеро-генеза по сравнению с пролинсо-держащими пептидами. Ранее было показано, что PG и PGP повышают устойчивость СОЖ к агрессивному воздействию этанола (Жуйко-ва и др., 2003). Из представленных синтетических пролинсодержащих пептидов лишь немногие обнаруживают протекторные противоязвенные свойства, а именно GPGP и GPGPGP. PGPG, PGPGP, PGPPGP, также как и GP, не уменьшали повреждения, индуцируемые этанолом.
Возникает определенное противоречие при исследовании вклада гидроксипролин- и пролинсодержащих глипролинов в противоязвенный эффект желатина (гидроли-зованный коллаген) на этаноловой модели язвообразования. С одной стороны, опираясь на полученные нами данные, можно сделать вывод, что гидроксипролиновые ди-и трипептиды не могут влиять на этаноловое язвообразование. Поэтому противоязвенный эффект желатина может быть обусловлен именно пролинсодержащими пептидами, такими как Pro-Gly, Pro-Gly-Pro, Gly-Pro-Gly-Pro и др. С другой
Противоязвенные эффекты PG (А), PGP (Б), GPGP (В) и GPGPGP (Г), при внутрибрюшинном (в/б, 3,7 мкмоль/кг) и при внутрижелудочном (в/ж, 3,7 и 0,37 мкмоль/кг)
введениях.
* — P < 0,05, ** — P < 0,01, *** — Р < 0,001 по отношению к контролю
стороны, в литературе имеются данные, что при внутрижелудочном введении человеку желатиновых гидролизатов, полученных из кожи свиньи, куриных ножек и хряща, в крови наблюдалось значительное увеличение именно гидроксипролинсодер-жащих олигопептидов, таких как Pro-Hyp, Pro-Hyp-Gly и др. с преобладанием первого (Iwai et al., 2005). Однако следует подчеркнуть, что авторы изучали наличие в плазме крови только гидрокси-пролинов. Вполне вероятно, что при этом образуются многие другие фрагменты коллагена, в числе которых могут быть и простейшие глипролины (PG, PGP). Необходимо в дальнейшем исследовать возможное участие различных гидроксипроли-новых пептидов в поддержании гомеостаза слизистой оболочки желудка на разных моделях язвооб-разования. Что касается отсутствия противоязвенных эффектов у многих исследуемых синтетических гли-пролинов, то здесь на данный момент трудно выявить структурно-функциональную зависимость противоязвенного действия пептидов. Эксперименты in vitro с исследованием фармакокинетики равномерно меченного тритием PGP в плазме крови человека демонстрируют высокую стабильность три-пептида, который обнаруживается в значительных количествах даже через 4 ч инкубации. Преимущественным путем его биодеградации является отщепление N-концевого пролина под действием ами-нопептидазы с образованием Gly-Pro (Золотарев и др., 2006). Следует вывод, что противоязвенный эффект PGP в отношении гомеостаза слизистой желудка обусловлен воздействием именно це-
лой молекулы, а не ее дипептидными метаболитами. Данные in vitro согласуются с неопубликованными экспериментальными данными нашей лаборатории при исследовании фармакокинетики меченого PGP in vivo на самцах крыс. Нельзя забывать, что при действии аминопептидазы освобождается и пролин. Как было показано нами ранее, пролин на этаноловой модели язвообразования действительно повышает устойчивость СОЖ к воздействию этанола. Противоязвенный эффект его на данной модели составил 30%, что в два раза ниже противоязвенного эффекта PGP (Жуйкова и др., 2003). Это свидетельствует о воздействии на слизистую желудка именно целой молекулы трипептида. Что касается биодеградации тетрапептида GPGP, то здесь можно лишь предполагать 2 варианта: воздействие интактной молекулы либо образование PGP посредством отщепления Gly c N-конца ами-нопептидазой. Роль карбоксипептидаз скорее всего незначительна, так как образующийся при этом дипептид Gly-Pro не эффективен в отношении периферических механизмов язвообразования. В случае пента- и гексапептидов возможно образование большого количества метаболитов, противоязвенная активность которых не изучена. Необходимы конкретные эксперименты по исследованию их биодеградации.
* * *
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 06-04-48833).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Ашмарин И.П., Бакаева З.В., Вась-ковский Б.В., Желязник Н.Я, Жуйкова С.Е., Золотарев В.А, Каменский А.А., Левицкая Н.Г., Ляпина Л.А., Мясоедов Н.Ф. Самонина Г.Е. 2003. Высокостабильные регуляторные олигопептиды — опыт и перспективы применения // Патофизиол. и эксперимент. терапия. № 4. 2—5.
Бадмаева К.Е., Самонина Г.Е., Вась-ковский Б.В., Платонова Р.Д. 2004. Сопоставление противоязвенного действия пептидов, содержащих пролин или гидроксипролин на этаноловой и стрессорной моделях язвообразования // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 4. 6—9.
Бадмаева С.Е., Копы лова Г.Н., Самонина Г.Е., Левицкая Н.Г., Умарова Б.А. 2005. Влияние глипролинов на стрессогенные нарушения поведения крыс // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 91. № 5. 543—550.
Бакаева З.В., Самонина Г.Е. 2005. Глипролины уменьшают развитие и ускоряют заживление ацетатных язв у крыс // Патофизиол. и эксперимент. терапия. № 2. 25—27.
Жуйкова С.Е., Бакаева З.В., Самонина Г.Е. 2003. Дифференцированные противоязвенные
эффекты возможных метаболитов пептида PGP — PG и GP-на этаноловой и стрессорной моделях вызова язв у крыс // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 2. 20—22.
Золотарев Ю.А., Дадаян А.К., Доло-тов О.В., Козик В.С., Кост Н.В., Соколов О.Ю., Дорохова Е.М., Мешавкин В.К., Иноземцева Л.С., Габаева М.В., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Павлов Т.С., Бадмаева К.Е., Бадмаева С.Е., Бакаева З.В., Копы лова Г.Н., Самонина Г.Е., Васьковский Б.В., Гривенников И.А., Зозуля А.А., Мясоедов Н.Ф. 2006. Равномерно меченные тритием пептиды в исследованиях по их биодеградации in vivo и in vitro // Биоорган. химия. 32. № 2. 80—88.
Исаев В.А., Самонина Г.Е., Бакаева З.В., Желязник Н.Я., Жуйкова С.Е., Гусева А.А., Ляпина Л.А., Пасторо-ва В.Е., Ашмарин И.П. 2003. Новый подход к снижению массы тела // Вопр. биол., мед. и фарм. химии. № 3. 45—47.
Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Ульянов А.М., Тарасов Ю.А., Ашмарин И.П. 2002. Влияние желатина и пептида Pro-Gly-Pro на состояние противосвертывающей системы и на развитие экс-
периментального диабета // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 1. 7—10.
Умарова Б.А., Копы лова Г.Н., Смирнова Е.А, Гусева А.А., Жуйкова С.Е. 2003. Секреторная активность тучных клеток при стрессе — влияние пептидов пролил-глицил-пролина и семакса // БЭБиМ. 136. № 10. 371-373.
Bienkowsky R.S. 1989. Intracellular degradation of newly synthesized collagen // Rev. Biol. Celular. 21. 423-43.
Iwai K., Hasegawa T., Tagushi Y., Mo-rimatsu F., Sato K., Nakamura Y., Higa-shi A., Kido Y., Nakabo Y., Ohtsuki K.2005. Identification of food-derived collagen peptides in human blood after oral ingestion of gelatin hydrolysates // Agricultural and food chemistry. N 53. 6531-6536.
Kalia N., Brown N.J., Jacob S., Reed M.W., Bardhan K.D. 1997. Studies on gastric mucosal microcirculation. 1. The nature of regional variations induced by ethanol injury // Gut. 40. 31-35.
Le J., Perier C., Peyroche S., Rascle F., Blanchon M.A., Gonthier R., Frey G., Chamson A. 1999. Urine glycyl-L-proline increase and skin trophicity // Amino Acids. 17. N 3. 315-322.
Ligumsky M., Sestieri M., Okon E., Ginsburg I. 1995. Antioxidants inhibit ethanol-induced
gastric injury in rat. Role of manganese, glycine, carotene // Scand. J. Gastroenterol. 30. N 9. 854-860.
Pfister R.R., Haddox J.L., Sommers S.I., Lam K.W. 1995. Identification and sinthesis of chemo-tactic tripeptides from alkali-degraded whole cornea: a study of N-acetyl-Proline-Glycine-Proline and N-methyl-Pro-line-Glycine-Proline // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36. 1306-1316.
Rainey J.K., Goh M.C. 2002. A statistically derived parameterization for the collagen triple-helix // Protein Science. N 11. 2748-2754.
Ramshaw J.A., Shah N.K., Brodsky B. 1998. Gly-X-Y tripeptide frequencies in collagen: a context for host-guest triple-helical peptides // J. Struct. Biol. 122. N 1. 86-91.
Rennard S.I., Stier L.E., Crystal R.G. 1982. Intracellular degradation of newly synthesized collagen // J. Invest. Dermatol. 79. N 1. 77—82.
Samonina G., Ashmarin I., Lyapina L. 2002. Glyproline peptide Family: review on bioactivity and possible origins // Phatophysiology. 8. 229—234.
Samonina G., Lyapina L., Kopylova G., Pastorova V., Bakaeva Z., Jeliaznik N., Zuykova S., Ashmarin I. 2000. Protection of gastric mucosal integrity by gelatin and simle proline-containing peptides // Patophysiology. 7. 69-73.
Поступила в редакцию 28.12.06
INFLUENCE OF HYDROXIPROLINE- AND PROLINE-CONTAINING GLIPROLINE ON ETHANOL-INDUCED GASTRIC LESIONS IN RATS
K.E. Baglikova, A. V. Trufanova, Z. V. Bakaeva, G.E. Samonina, L.A. Andreeva, P.A. Klimova, B. V. Vas 'kovsky
It was studied the antiulcer action of hydroxiproline- and proline-containing glyproline on ethanol-induced gastric lesions in rats. Hydroxiproline-peptides are not effective concerning peripheral mechanisms of ulcer foformation in contrast with proline-containing peptides. Protective ulcerogenic activity possess PG, PGP, GPGP, GPGPGP, which reduce the area of ethanol damages both at intraperitonial and at intragastric injection.
