CC BY
42
УДК 615.273.5:612.017.4:612.57
ВЛИЯНИЕ ГЕПАРИНА НА ТЕРМОПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА ЗООТОКСИНОВ В УСЛОВИЯХ ГИПЕРТЕРМИИ И В ПОСТГИПЕРТЕРМИЧЕСКИЙ ПЕРИОД
К.А Пурсанов1, А.Е. Хомутов2, В.В. Ягин2, О.В. Лушникова2,
'ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития»,
2ГОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»
Пурсанов Кузьма Анастасович, к. м. н., доцент - раб. тел.: (831) 465-59-60, e-mail: kpursanov@yandex.ru В экспериментах на лабораторных крысах показано, что предварительное введение гепарина и зоотоксинов с последующей тепловой экспозицией (50°С) снижает выживаемость животных при использовании пчелиного яда, яда скорпиона, яда кобры, гюрзы и гадюки и практически не изменяет выживаемость крыс при использовании яда эфы и щитомордника. Использование яда жабы в тех же условиях эксперимента снижает выживаемость животных до 70% относительно данных, полученных без введения гепарина.
Ключевые слова: гепарин, протамин сульфат, зоотоксины, гипертермия, постгипертермический период, выживаемость.
Experiments in lab mice showed that preliminary introduction of heparin and zootoxins with the followed thermal exposure (50°С) decreases survival rate for the animals in the case of usage of bee venom, quinquestriatus toxin, cobra venom, lebetina viper venom, viper venom, and practically does not change mice survival rate in the case of usage of carpet viper venom and copperhead snake venom. Usage of toad venom in the same experiment conditions decreases survival rate for the animals up to 70% in comparison with the data, obtained without heparin introduction.
Key words: heparin, protamine sulfate, zootoxins, hyperthermia, posthyperthermic period, survival rate.
В настоящее время хорошо установленным фактом является способность гепарина образовывать комплексы с широким спектром белков, пептидов, ферментов, катионных соединений, при этом могут меняться как его собственные свойства, так и свойства веществ, вступающих с ним во взаимодействие [1-8].
Ранее авторами было установлено, что гепарин вступает во взаимодействие с широким спектром ядов животных, относящихся к разным таксономическим группам и имеющим различные физиологические механизмы токсического действия [9-11]. Однако влияние гепарина на термопротекторное действие зоотоксинов в постгипертермический период не установлено, в связи с чем была поставлена серия экспериментов, в которых, в первую очередь, изучалось действие экзогенного и эндогенного гепарина на продолжительность жизни лабораторных крыс при температурной экспозиции 50°С.
Цель работы - изучение влияния гепарина на термопротекторные свойства ядов животных, относящихся к разным таксономическим группам, в условиях высокой внешней температуры и в постгипертермический период.
Материалы и методы. В работе использовался яд кобры среднеазиатской (Naja naja oxiana), эфы (Echis carinatus), щитомордника восточного (Agkistrodon piscivorus), гюрзы (Vipera lebetina), гадюки обыкновенной (Vipera berus), полученные из Ташкентского института зоологии и паразитологии, а также яд скорпиона (Butus eupeus), нативный яд пчелы (Apis mellifera) и яд жабы (Bufo bufo L), полученные в полевых условиях сотрудниками кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ.
Исследования были проведены на 230 белых крысах массой 180-210 г. Все животные до опыта содержались на общем
рационе вивария. Образцы ядов готовились непосредственно перед опытом. Физиологический раствор (контроль), гепарин, протамин сульфат и зоотоксины вводились внутрибрюшинно в объеме 1 мл.
Опыты по изучению действия высоких температур на показатели жизнедеятельности животных проводились в термокамере, конструкция которой была разработана на кафедре физиологии и биохимии человека и животных ННГУ. Эксперименты проводились при стабилизированной температуре 50°С. В отличие от предыдущих экспериментов [10], в данном исследовании регистрировали не продолжительность жизни крыс, а процент выживших особей через 45 тепловой экспозиции на фоне введения зоотоксинов. Тепловая экспозиция в пределах 45 мин. была выбрана не случайно и соответствует продолжительности жизни контрольной группы животных, которым вводился физиологический раствор с последующей тепловой экспозицией. Доза яда соответствовала данным экспериментов, в которых отмечалась максимальная продолжительность жизни.
Полученные данные были подвергнуты статистической обработке методом парных сравнений по критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение. Эксперименты, проведённые в условиях нормотермии (20°С), показали, что гепарин в широком диапазоне доз (0,5-5000 МЕ/кг) не вызывает изменений продолжительности жизни лабораторных крыс.
В условиях перегревания (40°С) при предварительном введении гепарина продолжительность жизни крыс увеличивается, причем максимальная продолжительность жизни регистрируется при введении гепарина в дозе 50 МЕ/кг. В этом случае животные живут после введения гепарина в условиях высокой внешней температуры в течение суток и более (таблица 1).
В ряде экспериментов, после 6-часовой тепловой экспозиции (40°С) на фоне введения гепарина в дозе 50 МЕ/кг, животные были отсажены из термокамеры и в течение 10 суток находились в обычных условиях вивария, после чего их забили. Морфологический анализ не показал каких-либо изменений со стороны внутренних органов.
При остром перегревании животных (50°С) на фоне введения гепарина продолжительность жизни снижалась, хотя только при введении гепарина в дозе 5000 МЕ/кг статистически достоверно отличалась от контрольных величин (таблица 1).
ТАБЛИЦА 1.
Продолжительность жизни крыс (мин.) при введении гепарина в условиях перегревания
ность жизни лабораторных животных соответствует 61±1,4 мин. (таблица 3). Через 24 часа после тепловой экспозиции в большинстве экспериментов при данных условиях опыта все животные погибают, однако при предварительном введении гепарина в дозе 5 МЕ/кг выживают 40%, а при введении про-тамин сульфата - 50% животных (таблица 3). Аналогичные результаты отмечаются и при введении яда гюрзы (4 мг/кг), гадюки (1 мг/кг), пчелы (2 мг/кг) и скорпиона (1 мг/кг). Изменяется только процент выживших животных в зависимости от таксономической принадлежности яда (таблица 3).
ТАБЛИЦА 2.
Продолжительность жизни крыс (мин.) при введении протамин сульфата в условиях перегревания
Т°С Контроль Доза протамин сулы ¡2 а
(физ. р-р) 4 8 16 32 64
40 117,4±11,2 140,8+3,6* 129,2+3,7 104,3+3,9 150,3+8,3* 100+15,0
50 59,8+2,8 46,6+2,4* 39,2+4,1* 35,4+4,5* 31,7+4,9* 29,6+2,5*
* Различия между контрольными и экспериментальными группами статистически значимы (р<0,05).
Исследованные токсины Максимальная продолжительность жизни (мин.) (Т=50°С) Выживаемость крыс (%) через 24 часа
Смесь Гепарин-яд Гепарин 5МЕ/кг рЕ е0 Г5 Гепарин 500МЕ/кг Протамин сульфат (10 мг/кг)
Контроль (физиол. р-р) 45+0,5 - 0 0 0 0
Кобра (1 мг/кг) 61+1,4* 0 40 0 0 50
Эфа (6 мг/кг) 159+9,2* 80 100 100 100 100
Щитомордник (4 мг/кг) 226+30* 100 100 100 100 100
Гюрза (4 мг/кг) 60+4,0* 0 40 0 0 50
Гадюка (1 мг/кг) 55+2,5* 0 0 0 0 0
Пчела (2 мг/кг) 79+2,9* 0 50 0 0 90
Скорпион (1 мг/кг) 69+4,9* 0 50 0 0 60
Жаба (2 мг/кг) 78+1,8* 70 70 70 70 70
Известно, что протамин сульфат, являющийся классическим антагонистом гепарина, блокирует эндогенный гепарин, содержащийся в периферической крови [12-14].
Нами был поставлен ряд экспериментов, в которых оценивалась продолжительность жизни лабораторных крыс в условиях острого перегревания на фоне введения протамин сульфата в широком диапазоне доз (от 1 до 62 мг/кг). Протамин сульфат в дозе 4 и 32 мг/кг достоверно увеличивал продолжительность жизни животных при температурной экспозиции 40°С, причем остальные дозы не вызывали термопротекторного эффекта и продолжительность жизни снижалась (таблица 2).
ТАБЛИЦА 3.
Влияние гепарина на термопротекторные свойства зоотоксинов
* Различия между контрольными и экспериментальными группами статистически значимы (р<0,05).
Эти данные свидетельствуют о том, что действие протамин сульфата и перегревания (40°С) на эндогенный гепарин имеет сложный разноплановый характер. По всей видимости, в случае с дозами 4 и 32 мг/кг происходит тканевая гипергепарини-зация как компенсация за уменьшение плазменного гепарина, что косвенным образом сказывается на повышении терморезистентности лабораторных животных.
В условиях острого перегревания (50°С) на фоне введения широкого диапазона доз протамин сульфата термопротекторного действия не наблюдается, причём с увеличением дозы протамина снижается продолжительность жизни экспериментальных животных (таблица 2).
При введении яда кобры в дозе 1 мг/кг с последующим острым перегреванием (50°С) максимальная продолжитель-
* Различия между контрольными и экспериментальными группами статистически значимы (р<0,05).
Иная картина наблюдается при остром перегревании (50°С) на фоне предварительного введения яда эфы (6 мг/кг), щитомордника (4 мг/кг) и яда жабы (2 мг/кг). При введении яда эфы при всех вариантах эксперимента выживаемость крыс достигает 100%, кроме варианта, в котором используется смесь яд-гепарин в соотношении 1:0,005. При введении яда щитомордника во всех сериях регистрируется 100-процентрое выживание животных, а при инъекции яда жабы во всех вариантах опыта выживаемость составляет 70% (таблица 3).
Таким образом, как показали наши исследования, выживаемость экспериментальных животных в постгипертермический период на фоне предварительного введения гепарина или протамин сульфата не зависит от таксономической принадлежности того или иного яда, не зависит от того, к нейротроп-ным антикоагулянтам (пчелиный яд, яд скорпиона и яд кобры), или к геморрагическим коагулянтам (яд эфы, щитомордника, гюрзы, гадюки) относится тот или иной яд.
По нашему мнению, выживаемость лабораторных крыс в постгипертермический период на фоне введения гепарина, зоотоксинов и последующей тепловой экспозиции связана с различной способностью взаимодействия животных ядов с гепарином. Ранее нами установлено, что пчелиный яд, яд скорпиона и яд кобры интенсивно взаимодействуют с гепарином,
в постгипертермический период
Т°С Контроль (физ. р-р) Доза гепарина (МЕ/кг)
0,5 5 50 500 5000
40 119+11 121+14 152+15* >24час 156+18* 132+12*
50 47,8+2,8 49,4+2,0 45+0,5 45+0,5 45+0,5 27,7+1,6*
с образованием комплексных соединений, которые частично
теряют свои физиологические свойства. Яд эфы слабо взаимодействует с гепарином, а яд щитомордника и жабий яд с гепарином вообще не взаимодействуют [15].
На наш взгляд, термопротекторный эффект зоотоксинов связан с неспецифической реакцией животных ядов, которые выступают в качестве стрессора. При длительных или многократных стрессорных воздействиях увеличивается мощность стресс-лимитирующих систем и формируется «феномен адаптационной стабилизации структур» (ФАСС), который проявляется в высокой устойчивости внутриклеточных структур к неблагоприятным воздействиям [16].
Развитие ФАСС связано с накоплением в клетках белков теплового шока, синтез которых значительно возрастает после длительных или многократных стрессорных воздействий. Усиление синтеза белков теплового шока индуцируется катехоламинами и кортикостероидами. В норме белки теплового шока являются шаперонами и обеспечивают правильную укладку полипептидной цепи вновь синтезируемых белков, а при стрессе осуществляют неспецифическую защиту белков клетки от денатурационных изменений, энергозависимое восстановление структуры частично денатурированных белков или сопровождение необратимо денатурированных белков в лизосомы для их последующего протеолиза [17].
Заключение. В результате проведённых исследований было установлено, что максимальная продолжительность жизни экспериментальных животных при тепловой экспозиции (50°С) зависит от дозы предварительно введённых зоотоксинов и их таксономической принадлежности. Выживаемость крыс в пост-гипертермический период на фоне предварительного введения гепарина зависит от способности зоотоксинов к взаимодействию с гепарином.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кудряшов Б.А. Биологические проблемы регуляции жидкого состояния и ее свертывания. М.: Медицина, 1975.
2. Хомутов А.Е. Гепарин и зоотоксины. В кн: Механизмы действия зоотоксинов. Горький, 1987. С.13-30.
3. Ляпина Л.А. Физиологические функции гепарина. Успехи современной биологии, 1987. № 103 (1). С. 66-80.
4. Chen J. et al. Enzymatic redesigning of biological active heparan sulfate. Journal of Biological Chemistry, 2006. № 12. Р. 329-332.
5. Troy N.Y. Blood-Compatible Nanoscale Materials Possible Using Heparin. Immediate Release, 2006. № 4. Р. 165-168.
6. Prakesh S. Shah A. et al. A Randomized, Controlled Trial of Heparin Versus Placebo Infusion to Prolong the Usability of Peripherally Placed Percutaneous Central Venous Catheters (PCVCs) in Neonates: The HIP (Heparin Infusion for PCVC) Study. Pediatrics, 2007. № 119. Р. 284-291.
7. Liang A., Liu X., Du Y., Wang K., Lin B. Further characterization of the binding of heparin to granulocyte colony-stimulating factor: Importance of sulfate groups. Electrophoresis, 2008. № 149 (2). Р. 109-112.
8. Meneghelli S., Luoni L., De Michelis M.I. Heparin Stimulates a Plasma Membrane Ca2+-ATPase of Arabidopsis thaliana. J. Biochem., 2008. № 143 (2). P. 253-259.
9. Хомутов А.Е., Ягин В.В. Худайбердыев М.Д., Некрасова Л.А. Влияние зоотоксинов на выживаемость экспериментальных животных в условиях перегревания. В кн.: Механизмы действия зоотоксинов. Горький, 1986. С. 34-39.
10. Хомутов А.Е., Гиноян Р.В., Ягин В.В. Термоадаптивные свойства зоотоксинов. Н. Новгород: Изд. ННГУ, 2005.
11. Хомутов А.Е., Пурсанов К.А., Калашникова Л.М. Пчелы, пчелиный яд, апитоксинотерапия. Н. Новгород: Изд-во НГМА, 2006.
12. Перлик Э. Антикоагулянты. Л.: Мир, 1965.
13. Albada U., Nieuwenhuis H.K., Sixma J.J. harmacokinetics of a low molecular weight heparin atfer intravenous and subcutaneous administration in human volunteers and its in vivo neutrallization by protamine sulfate. Thromb. and Haemost., 1987. № 58 (1). P. 167-169.
14. Wright C.J., Mahadoo J., Jaques L.B. Reversal by protamine of the prolonged response to intrapulmonary. Can. J. Surg., 1981. № 24 (2). P. 130-132.
15. Хомутов А.Е., Звонкова М.Б., Пахомова М.Е. Полифункциональные свойства гепарина. Вестник ННГУ. Серия биологическая. Н.Новгород, 2001. С.128-134.
16. Меерсон Ф.З., Малышева И.Ю. Феномен адаптационной стабилизации структур и защита сердца. М.: Наука, 1993.
17. Скулачев В.П. Эволюция, митохондрии и кислород. Соросовский образовательный журнал, 1999. № 9. С. 4-10.
