CC BY
62
Физиология
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2011, № 2 (2), с. 249-253
УДК 612.57
ВЛИЯНИЕ ГЕПАРИНА НА КАРДИОТРОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ МЕЛИТТИНА И ПЧЕЛИНОГО ЯДА
© 2011 г. М.Б. Звонкова 1, К.А. Пурсанов 2, А.Е. Хомутов 3
1 Нижегородский государственный педагогический университет
2 Нижегородская государственная медицинская академия
3 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
Поступила в редакцию 01.06.2011
В опытах на половозрелых крысах-самцах изучено влияние гепарина на кардиотропные эффекты пчелиного яда и мелиттина на изолированном сердце крысы. Показано, что пчелиный яд и мелиттин снижают частоту сердечных сокращений, максимальное давление в левом желудочке, скорость сокращения и скорость расслабления. Гепарин, введенный в виде смеси с пчелиным ядом и мелиттином, блокирует их кардиотоксические эффекты.
Ключевые слова: пчелиный яд, мелиттин, гепарин, изолированное сердце.
Введение
Мелиттин, являющийся основным действующим началом пчелиного яда, обладает повышенной поверхностной активностью. Так как молекула мелиттина амфифильна за счёт наличия и гидрофильных, и гидрофобных остатков, поэтому хорошо взаимодействует с мембранами [1]. Амфифильная молекула пептида «заякоривается» в наружном слое мембраны благодаря элект-ростатистическим взаимодействиям и «вклинивается» в бислой липидов мембраны [2], причём мелиттин способен встраиваться как в природные, так и в синтетические мембраны [3]. При этом он способен вносить существенные изменения не только в состав липидов, находящихся в непосредственной близости, но и изменять свойства липидов, находящихся на сравнительно б ольшом расстоянии [4].
Основные биологические, в том числе и кардиотропные эффекты мелиттина связаны как раз с его способностью менять или нарушать структуру мембран [5]. Связываясь с мембраной, пептид способен образовывать каналы, в результате чего повышается проницаемость для ионов [6], и может вызвать лизис клеток. При этом наблюдается накопление Ка+, Са2+ и утечка К+ и метаболитов пропорционально количеству ме-литтина, взаимодействующего с мембраной [7].
Материалы и методы
Эксперименты были проведены на 40 крысах массой 250-300 грамм. Работали по стандартной методике изолированного сердца Ланген-дорфа - Фаллена [8]. Крысам под нембутало-вым наркозом (35 мг/кг) вскрывали грудную полость, быстро вырезали сердце и помещали его в охлажденный раствор Кребса - Ханзеляй-та. В нем быстро отпрепарировали аорту и подсоединили к установке, обеспечивающей ретроградную перфузию через восходящую аорту буфера Кребса - Ханзеляйта. Установка представляла собой термостатируемый резервуар (оксигенатор), куда подавался перфузионный раствор. Резервуар соединялся силиконовой трубкой с металлической канюлей, на которую подвешивалось сердце, и термостатируемой камерой, куда оно помещалось. Перфузионный раствор подавался под давлением 85 мм водного столба, температура перфузата составляла 37°С. Для аэрации питающего раствора использовался воздух, который подавался через распыляющий фильтр. В левый желудочек сердца через предсердие вставляли латексный баллончик, соединенный с манотроном «МДХ11С» и с самописцем «Н338».
Сократительную активность сердца исследовали в изоволюмических условиях по Фаллену [8]. При этом проводили запись кривой внутри-желудочкового давления для последующего расчета частоты сердечных сокращений (ЧСС, уд/мин), развиваемого левым желудочком давления Рмакс (максимальной силы сердечного со-
кращения, мм рт. ст.), конечного диастолического давления (КДД, мм рт. ст.) и скоростных показателей - максимальной скорости сокращения +1РмаксМ? (мм рт. ст./с) и максимальной скорости расслабления -dlPмШÍ/dt (мм рт. ст./с) левого желудочка. Рассчитывали сократительную работу сердца как произведение силы сердечных сокращений на частоту [9].
Через 15 минут после начала перфузии (стабилизационный период) производили контрольную регистрацию параметров сократимости миокарда. Эти данные принимали за исходные, после чего производили воздействие.
В работе использовались высокомолекулярный гепарин производства Московского эндокринного завода, высокоочищенный мелиттин, выделенный из пчелиного яда в Институте био-органической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и пчелиный яд-сырец.
Смеси гепарина с физиологически активными веществами готовили с целью получения максимального количества комплексов гепарин - пептид в среде по специально разработанным методикам [10, 11], при этом пептиды смешивали с гепарином в дистиллированной воде в определенных соотношениях (мелит-тин:гепарин - 1:0.5; пчелиный яд:гепарин -1:0.5), затем смесь инкубировали в течение 1
часа при комнатной температуре и вводили в условиях относительной нормы.
Результаты экспериментов были статистически обработаны методом парных сравнений по критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение
В условиях относительной нормы и мелиттин (0.03 мг), и пчелиный яд (0.05 мг) вызывали резкое снижение частоты сердечных сокращений. Так, уже через 1 мин после введения в перфузат пчелиного яда частота сердечных сокращений достоверно снижалась с 161.7± ±8.3 до 97.5±7.8 уд/мин. К концу наблюдения (30 мин) ЧСС снижалась под действием пчелиного яда и мелиттина до 58.5±10.6 и 86.7± ±17.8 уд/мин соответственно (рис. 1).
Использование смесей пчелиный яд - гепарин и мелиттин - гепарин в соотношении 1:0.5 практически не влияло на ЧСС и даже через 30 мин достоверных отличий от исходных величин не наблюдалось (рис. 1).
Максимальное давление, развиваемое в левом желудочке изолированного сердца крысы при введении пчелиного яда, начиная со 2-й мин после введения достоверно снижается с 112.5±4.0 до 73.3±5.3 уд/мин, с последующим
Время от введения, мин
Рис. 1. Влияние пчелиного яда, мелиттина и их смесей с гепарином на частоту сердечных сокращений изолированного сердца крысы: 1 - пчелиный яд, без гепарина; 2 - пчелиный яд, с гепарином; 3 - мелиттин, без гепарина; 4 - мелиттин, с гепарином; * - различия между исходными и экспериментальными данными
постепенным снижением до 36.7±6.3 уд/мин к концу наблюдения. Введение смеси яд - гепарин не влияет на давление, развиваемое в левом желудочке изолированного сердца (рис. 2).
Общая тенденция снижения внутрисердечного давления сохраняется и при введении мелиттина. Однако в начальном периоде (1 мин после введения) давление повышается на 10-15% относительно исходных величин, а при введении смеси гепарин - мелиттин параметры давления увеличиваются на 25-30% от исходных (рис. 2).
Скорость сокращения изолированного сердца крысы при введении пчелиного яда и мелит-тина изменяется однонаправлено и снижается в течение 30 мин с 1392±78.9 мм рт. ст./мин у интактных животных до 220.8±86.4 мм рт. ст./мин в опытной группе. При введении смеси пчелиного яда и мелиттина с гепарином скорость сокращения изолированного сердца крысы остаётся на исходном уровне (таблица).
Аналогичная картина наблюдается при оценке скорости расслабления изолированного
т
р
йн
Исходно
10 15 20 25 30
Время от введения, мин
0
5
Рис. 2. Влияние пчелиного яда, мелиттина и их смесей с гепарином на развиваемое давление (Рмакс) в левом желудочке изолированного сердца крысы: 1 - пчелиный яд, без гепарина; 2 - пчелиный яд, с гепарином; 3 - мелиттин, без гепарина; 4 - мелиттин, с гепарином; * - различия между исходными и экспериментальными данными статистически значимы (р < 0.05)
Таблица
Влияние мелиттина, пчелиного яда и их смесей с гепарином на скорость сокращения (+йР/^) изолированного сердца крысы
Время от введения, мин Скорость сокращения, мм рт. ст./мин
Пчелиный яд Мелиттин
без гепарина с гепарином без гепарина с гепарином
Исходно 1392±78.9 1404±73.1 1298±123.0 1463±96.5
1 616.7±75.5* 1358±92.8 985.8±118.6 1506±129.0
2 587.5±83.3* 1388±70.6 609.2±54.3* 1383±101.1
3 550.0±94.6* 1388±70.6 512.5±74.6* 1217±91.7
5 258.3±29.3* 1390±74.2 465.0±91.4* 1254±89.6
8 219.7±13.9* 1383±68.2 458.9±84.3* 1248±101.2
10 275.9±27.4* 1371±64.0 446.5±52.1* 1232±96.7
15 254.2±25.3* 1368±92.4 440.7±90.0* 1246±86.4
20 252.2±28.7* 1370±89.9 423.3±63.9* 1252±69.8
30 220.8±86.4* 1377±68.6 420.1±61.0* 2149±79.3
* Различия между исходными и экспериментальными данными статистически значимы (р < 0.05).
сердца при введении пчелиного яда, мелиттина и их смеси с гепарином.
Гепарин, вероятно, при определенных состояниях может оказывать большое влияние на работу сердца. Об этом свидетельствует большое количество тучных клеток в миокарде, эндокарде и эпикарде, проходят гепарин-зависи-мые процессы, как, например, рост и диффе-ренцировка эндотелиальных клеток под влиянием факторов роста, что имеет важное значение в регенерации и восстановлении процессов в сердце. В наших экспериментах в условиях относительной нормы гепарин практически не влиял на сократительную активность миокарда.
Мелиттин влияет на клеточные процессы преимущественно не через рецепторы, а через образование ионных каналов. Полагают, что большинство эффектов пчелиного яда обусловлены действием именно этого пептида.
Действие пчелиного яда in vivo в различных дозах на сердечно-сосудистую систему неоднозначно. Как правило, наблюдается брадикардия с изменениями ЭКГ и гипотензия. Урежение сердечных сокращений сопровождается нарушениями ритма: возникают аритмия и экстраси-столия. В то же время, пчелиный яд способен оказывать антиаритмическое действие, в том числе при моделировании кальциевой и аконитовой аритмий. При введении малых доз яда может наблюдаться противоположный эффект: учащается ритм сердцебиений, увеличивается сердечный выброс. Эти изменения характерны также при введении не цельного пчелиного яда, а его основного компонента мелиттина.
В наших экспериментах и пчелиный яд, и мелиттин в условиях отностельной нормы снижали сократительную активность миокарда без восстановления, угнетая Рмакс, ритмическую активность, скоростные показатели, наблюдались нарушения предсердно-желудочкового проведения, синусовые аритмии. Эти данные совпадают с литературными [12]. В первые минуты воздействия мелиттина наблюдается положительный инотропный эффект. По некоторым данным такое двуфазное действие (стимуляция - угнетение Рмакс) характерно для мелит-тина, но эффект более выражен для более низких, чем в наших экспериментах концентрациях. Считают, что подобные проявления действия пчелиного яда связаны с увеличением кальциевого тока или активацией а-адрено-рецепторов [13]. Тот факт, что гепарин блокировал угнетение сердечной деятельности, а также рост контрактуры, индуцируемые пчелиным ядом и мелиттином, но не влиял на положительный инотропный эффект пептида, позво-
ляет отдать предпочтение точке зрения об опосредованном проявлении эффекта. Возможно, гепарин, образуя комплексы с мелиттином-мономером, препятствует образованию тетрамеров и, как следствие, уменьшает возможность образования каналов на мембране кардиомио-цитов, но не влияет на способность мелиттина связываться с рецепторами.
Таким образом, пчелиный яд и мелиттин снижают сократительную активность миокарда без восстановления, угнетают Рмакс, ритмическую активность, скоростные показатели. Введение смеси пчелиный яд - гепарин и мелиттин - гепарин в весовом соотношении 1:0.5 предупреждает изменения сердечной деятельности, вызванные исследуемыми зоотоксинами.
Список литературы
1. Habermann E. Melittin - stuctura and activity. Natural toxins: Oxford and New York, 1980. 181 р.
2. Dawson C.R., Drake A.F. Helliwell J. The interaction of bee melittin with lipid bilayer membranes // Biochimica et Biophysica Acta (BBA). 1978. V. 510. N. 1. P. 75-86.
3. Najjam S. Gibbs R. V., Gordon M.Y. Characterization of human recombinant interleukin 2 binding to heparin and heparan sulfate using an ELISA approach // Cytocine. 1997. V. 9. N. 12. P. 1013-1022.
4. Громова И.А., Молотковский Ю.Г., Бергельсон Л.Д. Изучение взаимодействия мелиттина с многокомпонентными смесями с помощью липид-специфических флуоресцентных зондов // Биол. мембраны. 1990. № 9. С. 986-1000.
5. Katsu T., Sanchika K., Jamanaka H. Mechanism of cellular membrane damage induced by melittin and mastoparan // Jap. J. Med. Sci. and Biol. 1990. V. 43. N. 6. P. 259-260.
6. Ohki S., Marcus E., Sukumaran D.K., Arnold K. Interaction of melittin with lipid membranes // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1194. N. 2. P. 223-232.
7. Adler S., Eng B. Reversal of inhibition of rat glomerular epithelial cell growth by growth factors // Am. J. Pathol. 1990. V. 136. N. 3. P. 557-563.
8. Fallen E.T., Elliott W.G., Gorlin R. Apparatus for study of ventricular function and metabolism in the isolated rat // J. Appl. Physiol. 1967. V. 22. N. 4. P. 836-839.
9. Гацура В.В. Энергетический обмен миокарда при острой ишемии и его фармакологическая коррекция // Успехи физиол. наук. 1981. Т. 12. № 1. С. 97-117.
10. Хомутов А.Е., Звонкова М.Б., Пурсанов К.А. и др. Молекулярное взаимодействие гепарина с пчелиным ядом // Вестник ННГУ. 2009. № 6. С. 106-112.
11. Ашмарин И.П. Пептиды сильного и быстрого действия // Патол. физиология. 1988. № 3. С. 3-8.
12. Nabil Z.I., Hussein A.A., Zalat S.M. Mechanism of action of honey bee venom on different types of muscles // Hum. Exp. Toxicol. 1998. V. 17. N. 3. P. 185-190.
13. Крылов В.Н. Пчелиный яд. Свойства, получение, применение. Н. Новгород: Изд-во ННГУ, 1995. 223 с.
INFLUENCE OF HEPARIN ON CARDIOTROPIC EFFECTS OF MELITTIN AND APITOXIN M.B. Zvonkova, K.A. Pursanov, A.E. Khomutov
In the experiments on sexually mature male rats, the influence of heparin on cardiotropic effects of apitoxin and melittin has been studied on the isolated rat heart. Apitoxin and melittin have been shown to decrease the heart rate, the maximum pressure in the left ventricle, the speed of contraction and relaxation. Heparin injected in the mixture with apitoxin and melittin blocks their cardiotropic effects.
Keywords: apitoxin, melittin, heparin, isolated heart.
