CC BY
26
УДК 663. 52/54 (470.67)
ВЛИЯНИЕ ГЕОТЕРМАЛЬНЫХ ВОД РАЗНОГО СОСТАВА НА МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММА S. CEREVISIAE Y-503
© 2011г. С.Ц. Котенко, Э.А. Халилова, Э.А. Исламмагомедова
Прикаспийский институт биологических ресурсов Caspian Institute of Biological Resources
Дагестанского научного центра РАН, of Dagestan Scientific Centre RAS,
ул. М. Гаджиева, 45, г. Махачкала, Р. Дагестан, 367025, M. Gadzhiev St., 45, Makhachkala, 367025,
pibrdncran@mail.ru pibrdncran@mail.ru
Изучены морфофизиологические свойства штамма Saccharomyces cerevisiae Y-503 на этапах получения этанола с использованием геотермальных вод фенольного и нефенольного класса в составе среды культивирования. Обнаружена корреляция между увеличением популяции дрожжей и улучшенной биохимической активностью за счет накопления важных для спиртового процесса свободных аминокислот: фенилаланина, серина, изолейцина, лейцина, пролина, цистеина. Предполагается, что благоприятное влияние подземных вод разного происхождения на морфофизиологические свойства штамма и интенсификацию биосинтеза этанола по сравнению с традиционной технологией обусловлено возможностью изменения метаболизма дрожжей на основе влияния биологически активных веществ геотермальных вод.
Ключевые слова: питательная среда, геотермальные воды, дрожжи, этанол-морфология, физиология.
The morphophisiological properties of culture Saccharomyces cerevisiae Y-503 at the stage of getting ethanol by using geothermal water of phenol and non-phenol class amounting to cultivation sphere is studied. The correlation between increasing of yeast population and improved biochemical activity due to heaping up important for spirit processes of free amino acid: phenylalanine, serine, isoleucine, leucine, proline, cystein is revealed. It is supposed that the favorable influence of underground water of different origin for the morphophisiological properties of culture and intensification of ethanol biosynthesis in comparison with traditional technology determined by the possibility of yeast metabolism changes on the basis of influence of the biologically active su bstance of geothermal water.
Keywords: nutrient medium, geothermal water, yeast, ethanol, morphology, physiology.
Ранее была разработана технология активного биосинтеза этанола с использованием геотермальной воды нефенольного класса, которая позволила увеличить выход спирта в сбраживаемой среде со значительным снижением весьма нежелательных примесных соединений по сравнению с традиционной технологией [1-3]. Дрожжевые клетки обладают способностью производить перестройку внутриклеточной ферментной системы и метаболических путей при изменении состава питательной среды. В условиях культивирования на различных средах с изменением скорости роста дрожжей существенно меняются их морфофизиологические свойства.
Осуществлены исследования, позволившие определить жизнедеятельность штамма 5". cerevisiae Y-503 при использовании в составе мелассной питательной среды геотермальной воды фенольного класса с минерализацией 2,2 г/л. Выявлена возможность регуляции метаболизма дрожжей на основе влияния биологически активных веществ подземной воды в составе среды культивирования, где также обнаружена интенсификация синтеза этанола [4].
Цель настоящей работы - изучение влияния питательных сред с использованием геотермальных вод различного состава на морфофизиологические свойства дрожжевой клетки в процессе биосинтеза этанола.
Объекты исследования - штамм 8ассИаготусе&' се-revisiae Y-503 (А.с. СССР № 1284998) из дрожжевой коллекции Прикаспийского института биологических ресурсов, геотермальные воды фенольного класса Кизлярского месторождения из скважины №7-Т [4] и нефенольного класса из скважины № 26 Махачкалинского месторождения [2]. Дебит подземной воды из
скважины №7-Т - 768 м3/сут, что почти в 2 раза превышает дебит воды из скважины № 26. Для проведения лабораторных испытаний технологического процесса синтеза этанола штамм Y-503 предварительно адаптировали многократными пересевами к периодически обновляемым мелассным питательным средам с геотермальной водой (МПСГВ) фенольного, нефе-нольного класса и традиционной (МПС) с содержанием углеводов от 8^20 г/(100 см3) при t = 28...30 °С. Завершающий этап сбраживания осуществляли глубинным методом в лабораторной установке в периодическом режиме с циклом 120 ч. Опытные питательные среды готовили следующим образом: к мелассе добавляли неразбавленную геотермальную воду фе-нольного или нефенольного класса определенного состава до содержания углеводов 20 г/(100 см3), 2,58 г/л гидроортофосфата аммония, концентрированную серную кислоту для достижения рН 5. В контроле содержание гидроортофосфата составляло 1,53 г/л, сернокислого аммония - 4,6. Стерильную питательную среду разливали по 1,35 л в сосуды вместимостью 3 л, засевали вегетативной культурой указанного штамма в количестве 150 мл из дрожжевой суспензии последней стадии адаптации на МПС. На отдельных этапах исследований контроль за функциональной морфологией дрожжевой культуры (общее количество клеток, форма, величина, характер почкования) осуществлялся с использованием лабораторного микроскопа СЭС 21 OLIMPUS. Содержание в популяции жизнеспособных особей фиксировали в камере Го-ряева, окраску проводили метиленовой синью. Компьютерное изображение клеток дрожжей осуществляли с использованием цифрового окуляра 5 МПС («Op-
tic Plot»), установленного на микроскопе. Изображение фиксировали в видеоблоке системы с выводом на графический дисплей компьютера Pentium 4 с программным обеспечением Leica УМ - 1000 emerge Manager по Windows.
Спиртовое брожение предусматривает довольно длительное пребывание дрожжей в субстрате для наиболее полного его сбраживания. В течение этого времени клетка в полной мере испытывает на себе воздействие всех негативных факторов, формирующихся в среде. Часть клеток, разрушаясь, выделяет в среду избыточное количество литических ферментов, которые повреждают здоровые функционирующие дрожжи с высвобождением новых порций ферментов этой группы. Кроме того, в среде появляется большое количество продуктов незавершенного метаболизма, и как защитная реакция - клетка выбрасывает их в среду. Большинство таких продуктов токсичны и еще больше искажают обменные процессы в клетке, что в конечном итоге влияет на химический состав брожения и качество этанола. Поэтому дрожжевая клетка как главный участник технологического процесса должна находиться в условиях, позволяющих ей полностью проявить свои физиологические возможности.
При проведении адаптационной работы установлено, что предпочтительнее переносить дрожжи на новую среду в позиции лаг-фазы. В этот период дрожжи быстрее адаптируются к среде, чем клетки, находящиеся в стационарной фазе.
На этапах внесения 12-часовой разводки в солодовом сусле, инокуляте и сброженном субстрате по окончании брожения были изучены морфофизиоло-гические свойства дрожжей. Для клеток штамма S. ce-revisiae Y-503 на сусло-агаре характерна овальная форма, размеры находятся в пределах 6^7*10^12 мкм. В разводке на солодовом сусле - 63 •106 кл/мл, клетки несколько увеличились в размере до 7^8*12^14 мкм, форма в основном овальная, округлых - единицы. Способность дрожжевых микроорганизмов к постоянно возрастающей скорости почкования и размножения проявляется к экспоненциальной фазе роста. Малый эффект окислительно-восстановительных реакций анаэробного обмена является основной причиной затухания, прекращения процесса почкования и размножения клеток. Проведение адаптации обеспечивает получение молодых дрожжей с повышенной физиолого-биохимической активностью и технологически устойчивых к неблагоприятным факторам на этапе получения спирта.
Обнаружено, что в процессе получения инокулята в опытных клетках, где в питательной среде присутствует геотермальная вода, наблюдается стабилизация морфологических показателей (по форме и размерам). Вместе с тем популяция опытных дрожжей наряду с крупными особями содержит и мелкие, которые в период интенсивного роста не смогли достичь присущей взрослым клеткам величины (рисунок а, б, в).
Установлено, что ресурсы углеводного питания на опытных средах востребованы на 87 и 89 % (МПСГВ фенольного и нефенольного класса) соответственно. Аналогичный показатель в контроле составлял 75 %. На
питательных средах с геотермальной водой разного состава лучше проявилась бродильная функция дрожжей по сравнению с традиционной технологией и, соответственно, синтез этанола составил 11,40, 11,70, 9,6 % объема; содержание остаточного сахара - 0,75, 0,35, 2,1 г/100 см3. Практически равное накопление спирта в первых двух образцах с использованием геотермальных вод Махачкалинского и Кизлярского месторождения можно объяснить почти одинаковой активностью и морфофизиологическими показателями штамма S. cere-visiae Y-503 в технологическом процессе.
'■ JA
nCO rvQ
а
г
б
Сг оР и
Ох)уО
* - Г
;v* гО
W£\
штж ¡ш
г *; i
п
mrt.
Морфология клеток штамма S. cerevisiae Y-503 в процессе получения инокулята на МПС с геотермальными водами фенольного (а), нефенольного (б) класса и традиционной (в). Увеличение *1000
Морфологические исследования показали, что на МПС с геотермальной водой фенольного класса насчитывалось 84,7 млн/мл клеток, имеющих округло-овальную (80-90 %) и округлую (10 %) формы; размеры: 8^9*9^10, 6^6, 7^7, 9x9 мкм; почкующихся -
35 %, мертвых - 0,05 %. В 1 мл суспензии с использованием геотермальной воды нефенольного класса определено 86,9 млн/мл клеток, овальной и округлой формы размерами 5^6,5*7,7^8, 6^7*9^10, 8*8, 9*9 мкм соответственно; почкующихся - 33,4 %, мертвых - 0,1 %. У мелких клеток отсутствовала вакуолизация и инволюционные формы. Цитоплазма опытных дрожжей с ярко очерченной оболочкой оптически плотная, содержит различные органоиды (большое количество вакуолей, липидные включения, гликоген). В контроле цитоплазма чаще светлая или умеренной плотности, в ней также видны вакуоли, гликоген. Клетки отличаются широким разнообразием форм (круглые, овальные, яйцевидные); в среднем имеют размеры 5^6*7^8, 2^2,5*6^8, 6*6, 5*5 мкм; ярко очерченную оболочку; количество клеток 57,9 млн/мл, почкующихся - 24,5 %; мертвых - 0,1 %. Очевидно, что отличительной особенностью для популяции дрожжей на средах с геотермальными водами является увеличение роста дрожжевой популяции в среднем на 48 %. При этом размеры клеток несколько больше, чем в контроле; форма приблизительно идентична.
Известно, что накопление свободных внутриклеточных аминокислот в клетке коррелирует не только с активной жизнедеятельностью дрожжей, но и интенсификацией спиртового брожения. Как видно из таблицы, общая сумма идентифицированных свободных аминокислот в биомассе дрожжей, культивируемых на питательных средах с геотермальными водами, выше в среднем на 21 % по сравнению с контролем.
Накопление некоторых свободных аминокислот
при сбраживании мелассных питательных сред дрожжами еегеш1ае У-503, мг/г
Нас интересовали именно те аминокислоты, которые оказывали существенное влияние на морфофизио-логическое состояние дрожжевой популяции. Так, фе-нилаланин, пролин, серин способствуют значительному усилению метаболизма дрожжевых клеток и создают резкий функционально-морфологический эффект. Высокая реакционная способность аргинина активизирует ряд ферментов и способствует адаптации дрожжевого организма к экстремальным условиям, детоксика-ции вредных веществ в клетке. Изолейцин, лейцин, цистеин осуществляют важную роль в процессе деления клеток, вызывая усиление гликогенеза.
Выращивание дрожжей на опытных питательных средах с использованием геотермальных вод позволяет получать клеточную массу с повышенной фи-зиолого-биохимической активностью. Кроме того, фенол (0,540 мг/л), содержащийся в геотермальной воде № 7-Т в составе опытной питательной среды, способствует ускорению процесса фосфорилирова-ния, а значит, и размножению дрожжевой клетки. В результате увеличилась скорость роста, плотность дрожжевой популяции и соответственно ускорение спиртового процесса [4]. По-видимому, наличие в геотермальных водах фенольного и нефенольного класса биологически активных веществ, необходимых для роста и развития дрожжей, таких как К, Mg, Ca, Fe, Mn, Zn, а также борная, кремниевая кислоты, гумусовые вещества, являющиеся стимуляторами физиолого-биохимических процессов в живой клетке, создают благоприятные условия для жизнедеятельности дрожжей и успешного проведения спиртового брожения.
Таким образом, установлено благоприятное влияние подземных вод разного происхождения на морфофизиологическое состояние штамма 5. cerevi-siae Y-503. Обнаружена корреляция увеличения популяции дрожжей с улучшенной биохимической активностью за счет важных для спиртового процесса свободных аминокислот и интенсификацией биосинтеза этанола.
Литература
1. Абрамов Ш.А. Новые технологии пищевых продуктов на основе использования геотермальных вод Юга России // Юг России: экология, развитие. 2008. № 2. С. 6 - 9.
2. Пат. РФ № 2329302. Способ сбраживания меласс-ного сусла / Абрамов Ш.А., Халилова Э.А. 2008. БИ № 20.
3. Исламмагомедова Э.А. Влияние минеральных веществ на физиологические функции дрожжей 8асскатотус-ез сегеу(з(ае // Хранение и переработка сельхозсырья. 2008. № 7. С. 59 - 61.
4. Котенко С.Ц., Халилова Э.А., Исламмагомедова Э.А. Использование геотермальной воды фенольного класса в технологии биосинтеза этанола // Производства спирта и ликероводочных изделий. 2010. № 3. С. 27 - 29.
Биомасса штамма S. cerevisiae Y-503,
выращенная на различных питательных средах
Аминокислоты с геотермальной водой фе-нольного класса (опыт) с геотермальной водой нефе-нольного класса (опыт) по традиционной техноло-
гии (контроль)
Аргинин 0,90 1,05 0,70
Аланин 2,80 2,78 2,70
Изолейцин 1,60 1,72 1,20
Лейцин 1,80 1,63 1,40
Фенил-аланин 1,00 1,10 0,80
Цистеин 0,10 0,10 0,10
Пролин 0,90 0,85 0,60
Серин 1,50 1,51 1,30
Сумма свободных 10,60 10,74 8,80
аминокислот
Поступила в редакцию_25 марта 2011 г.
