CC BY
45
УДК 618.2-056.7
ВЛИЯНИЕ ГЕНОТИПА МАТЕРИ И РЕБЕНКА НА ТЕЧЕНИЕ БЕРЕМЕННОСТИ И ИСХОД РОДОВ
Ш. РАМПАДАРАТ, Т.В. ГАЛИНА, В.Е. РАДЗИНСКИЙ, А.А. ОРАЗМУРАДОВ,
Н.Т. ХАХВА, Д.О. НИЯЗЛИЕВА
Кафедра акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, Медицинский факультет, 117198 Москва, Россия
А.В. ИТКЕС, Н.В. КАРАСЕВА, Е.В. КАРПОВА
Кафедра биологии и общей генетики Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, Медицинский факультет, 117198 Москва, Россия
Обследовано 39 матерей и их новорожденных с гестозом различной степени. Рассматривались осложнения беременности гестозом в сочетании с задержкой развития плода (ЗРП), гестоз без ЗРП и ЗРП без гестоза.
Цель: определение аллельного распределения гена гликопротеина GpIIIa, аллелей PL-AI и PL-AII у матерей и их новорожденных для оценки корреляции распределения аллелей гена GpIIIa и возникновения гестоза и ЗРП.
Материал: изучали ДНК периферической крови с использованием полимеразной цепной реакции.
Проведенные исследования позволили сделать вывод, что при совпадении генотипов мать—ребенок выявляется весь спектр осложнений, связанных с гестозом и ЗРП. При разных генотипах мать—ребенок — нет случаев гестоза, а только ЗРП.
На современном этапе можно обоснованно утверждать, что гестоз является осложнением беременности, связанным с нарушением характера гемодинамики в спиральных артериях миометрия.
Нарушение функций эндотелия как плацентарных сосудов, так и сосудов самой плаценты, вероятно, является следствием, а не причиной развития гестоза, патофизиологические механизмы которою еще недостаточно изучены. Таким образом, только после выявления всех механизмов и процессов, которые приводят к нарушению инвазии трофобласта, и в свою очередь, вызывают изменения функции эндотелия сосудов, появится реальная возможность для разработки методов прогнозирования, патогенетической профилактики и лечения гестоза.
Впервые наследственную теорию развития гестоза опубликовал Leon Chesley в 1978 г. Его исследования показали, что у сестер и дочерей женщин, беременность которых осложнялась гестозом, частота развития этого осложнения была больше в 2,5 раза по сравнению с ее популяционной частотой. При этом было отмечено, что у невесток этих женщин, живших в одинаковых социально-экономических условиях, увеличения частоты гестоза не наблюдалось.
По данным Hayward et al. (1992), в развитии гестоза определенное значение имеет мутация генов, расположенных в 1-й, 9-й и 18-й хромосомах. Мутация гена, расположенного на 1-й хромосоме и ответственного за регуляцию синтеза ангиотензина, может вызвать значительное усиление синтеза этого вазоактивного агента. Для оксида азота подобный ген располагается на 7-й хромосоме. Его мутации определяют существенное повышение артериального давления у пациенток. В своем исследовании Harrison et al. (1997), полагают, что нарушение строения длинного плеча 4-й хромосомы также является одной из причин развития гестоза.
Доказано, что процесс инвазии трофобласта координируется совокупностью действия цитокинов, различных факторов адгезии и роста [4, 9].
Известно, что при гестозе в процессе инвазии трофобласта не происходит адекватных мутаций клеток трофобласта в сосудах миометрия. Изучение анти-
генной активности в материнских тканях, образование цитокинов и факторов роста в месте плацентации, а также необходимых для инвазии ферментов, свидетельствует о нарушении этих процессов.
При развитии гестоза в ткани плаценты было выявлено отсутствие 1-интегрина и металлопротеина-9 клеточной матрицы. Кроме того, установлено, что у 7 пациенток, перенесших гестоз, содержание фактора роста эндотелия сосудов было достоверно снижено как в миометрии [4], так и в сосудах других органов [9]. Вероятно, снижение концентрации цитокинов обусловливает недостаточное образование металлосодержащих и сериновых протеаз, а также коллагеназ 4-го типа, что нарушает механизм инвазии и ведет к развитию гестоза [11].
В последние годы выяснено, что структура молекул адгезии клеток цитотро-фобласта, необходимых для нормального течения процесса инвазии, значительно нарушается, приводя к патологии процесса инвазии трофобласта, что, вероятно, и определяет развитие гестоза [15].
Принимая во внимание, что ведущими звеньями патогенеза гестоза являются нарушение сосудистого компонента и отклонения от нормы при формировании межклеточных контактов, в том числе — между тканями матери и плода, нами было проведено исследование распространения двух основных аллелей гликопротеина GPIIIa у беременных с гестозом.
Ген GPIIIa контролирует синтез клеточных рецепторов — интегринов (подсемейство цитоадгезинов). Интегрины — большая группа рецепторов клеточной поверхности, которые определяют адгезию клеток к клеточному матриксу путем связывания его компонентов (фибронектина, ламинина, коллагена и др.) или к поверхности других клеток путем связывания с поверхностными молекулами Ig-суперсемейства. Интегрины состоят из нековалентно связанных а- и р-субъ-единиц, каждая из этих субъединиц представлена несколькими вариантами, которые кодируются группой родственных генов. В рамках каждого варианта существуют аллельные формы субъединиц, р-субъединица типа III, подтипа а (гликопротеид Illa, или GPIIIa), представлена двумя аллельными формами: PL-AI и PL-AII [7].
Наиболее часто субъединица GPIIIa образует димер с а-субьединицей типа Пр. Интегриновый рецептор Ир/Ша, выявляемый на поверхности тромбоцитов, мегакариоцитов и некоторых других клеток, связывается с фибриногеном, вит-ронектином, тромбоспондином и др., играя, таким образом, ключевую роль в общей регуляции кровообращения, микроциркуляции, свертывания крови и др.
Частота встречаемости аллеля PL-AII для населения Европы, по данным различных авторов, составляет около 14% [10, 12], для населения Москвы нами получена такая же величина. Наличие этого аллеля связывают с нарушениями циркуляции в системе коронарных артерий (ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда) [14].
Ранее нами было проведено исследование аллеля PL-AII гена GPIIIa у 104 беременных женщин с гестозом. Все обследованные были разбиты на 3 группы: 45 женщин с «чистым» гестозом; 38 беременных с сочетанным гестозом; 21 — с признаками задержки развития плода. Проведенное исследование показало, что носительство аллеля PL-AII гена GPIIIa является фактором высокого риска формирования задержки развития плода, при беременности, возникшей на фоне предшествующей экстрагенитальной патологии (сочетанный гестоз).
При беременности, осложнившейся «чистым» гестозом, носители аллеля PL-AII гена GPIIIa также угрожаемы по формированию ЗРП.
Определение наличия в крови аллеля PL-AII гена GPIIIa может быть использовано для выделения группы риска по возникновению ЗРП, а также в качестве прогностического теста вне беременности [1].
Полученные результаты исследования позволили предположить, что на развитие осложнений во время беременности может оказать влияние не только аллель-
ное распределение гена GPIIIa у матерей, но и аллельное распределение гена GPIIIa у новорожденных, т. е. определенный интерес представляет оценка влияния отцовского фактора на возникновение гестоза и ЗРП.
По данным одних исследователей [2] изучение генетического дерева женщин, перенесших гестоз, позволило предположить, что наследование факторов, определяющих это осложнение, происходит по женской линии или является следствием мутации de-novo на самых ранних этапах развития эмбриона.
Другие исследователи показали, что частота развития гестоза у женщин моно-зиготных близнецов была неодинакова [13]. Однако признано, что генетические факторы как материнского, так и отцовского происхождения могут определять развитие этого грозного осложнения беременности. Так, проведенные в Норвегии исследования влияния мужского фактора выявили, что частота гестоза у вторых жен была в 1,8 раза больше, чем у первых [8].
Эти данные не позволяют исключить влияние наследственности по отцовской линии на частоту развития гестоза.
Для выявления этого обстоятельства нами было проведено исследование аллеля PL-AII гена GPIIIa не только у беременных с разными формами гестоза в сочетании с ЗРП, но и новорожденных от этих матерей.
Материалы и методы исследования. Исследование крови на носительство аллеля PL-AII гена GPIIIa.
Забор материала: отбирали 100 мкл периферической крови в пробирку, содержащую 25 мкл 50 мМ раствора нейтрального Na-ЭДТА («Sigma», США), и перемешивали. В таком вице кровь может храниться 15—20 суток в бытовом морозильнике (около -12° С).
Получение ДНК-матрицы. К 125 мкл смеси крови и раствора Na-ЭДТА добавляли 125 мкл раствора 0,15 М NaCl («Реахим», степень чистоты ОСЧ или ХЧ),
0,1% тритона-ХЮО («Sigma», США), перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 20 мин. Затем осаждали центрифугированием на микрофуге «Eppendorf» (Германия) 10 мин при 10 000 об/мин. Убирали супернатант. Осадок суспендировали в 200 мкл 0,1% тритона-ХЮО, полученную смесь центрифугировали 10 мин при 10 000 об/мин, супернатант убирали. Полученный осадок дважды промывали 500 мкл 10 мМ трис-HCl («Sigma», США) путем суспендирования и осаждения центрифугированием при вышеуказанных условиях. Затем ресуспен-дировали в 50 мкл 10 мМ трис-HCl и выдерживали 10 мин на кипящей водяной бане с последующим быстрым охлаждением (для денатурации ДНК и получения гомогенного раствора).
Электрофорез в агарозном геле. Электрофорез ДНК проводили на аппарате «Bio-Kad» в 0,8% агарозном геле («Sigma», США) в трис-ацетатном буфере «Реахим» (степень чистоты ОСЧ или ХЧ) с бромистым этидием («Sigma», США) при напряженности поля 20 мА и 150 V. Краска для нанесения образцов содержала 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола и 50% глицерина в воде (все — «Sigma», США).
Полимеразная цепная реакция. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием амплификатора ДНК многоканального MC 2 («Терцик», Россия).
В работе использовали синтезированные в лаборатории биоорганической химии РУДН ДНК — матрицы и праймеры со структурой GP3L-1459 (5’) gga ctt etc ttt ggg ctc ctg и GP3L-1728 (5’) cac ctg ctt cag gtc tet cc: праймеры — 10 мкМ (1,5 o.e./мл), буфер (lOx) — стандартный, 15 мМ MgCh, смесь dNTP — по 2,5 мМ каждого dNTP, ДНК-матрица — 20 нг/мкл, термостабильная полимераза —
0,5 ед./мкл.
Для каждой пробы использовались:
1. Праймер GP3L-1459 — 1 мкл.
2. Праймер GP3L-1728 — 1 мкл.
3. Буфер 10 (х) — 2,5 мкл.
4. Смесь нуклеотидфосфатов — 2 мкл.
5. ДНК-матрица — 1 мкл.
6. Термостабильная полимераза — 1 мкл.
7. Вода — до объема смеси — 25 мкл.
Программа амплификации состояла из 35 циклов при следующих условиях для каждого из них:
— 94° С — 40 сек;
— 60° С — 30 сек;
— 72° С - 90 сек.
После окончания 20-го цикла добавляли в каждую пробирку по 0,5 мкл термостабильной полимеразы. Амплифицируемый фрагмент имел длину 270 нуклеотидных пар.
После амплификации проводили переосаждение для рестрикции. В каждую пробу добавляли по 3 объема этилового спирта («Реахим») и оставляли на 12 ч при температуре 20° С.
Обработка ДНК рестрикционной экзонуклеазой. Содержимое пробы ПЦР (25 мкл) смешивали с 60 мкл воды, добавляли 10 мкл буфера 10х для рестриктазы Mspl («Promega») и 5 мкл стандартного раствора Mspl («Promega», США). Смесь инкубировали 1,5 ч при температуре 37° С. Затем к пробе добавляли 9 мкл 5М NaCI и 300 мкл этанола. Инкубировали 12 ч при температуре 12° С, центрифугировали 10 мин при 10 000 об./мин, удаляли супернатант и подсушивали осадок
около 20 мин на воздухе при комнатной температуре. Пробу растворяли в 15 мкл буфера для нанесения на акриламвдный гель.
Электрофорез в полиакриламидном геле. Разделение фрагментов проводили в 10%-ном полиакриламидном геле, который готовили на трисборатном буфере («Реахим»). Электрофорез проводили при 20 мА и 250V в течение 1 ч. Краска для нанесения образцов содержала 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксилен-цианола и 50% глицерина в воде. В качестве маркера использовали плазмиду pUC 18, обработанную рестриктазой Mspl (размер фрагментов от 501 до 34 нуклеотидных пар). Размер фрагмента ДНК до рестрикционного расщепления составлял в длину 270 нуклеотидных пар, после расщепления фрагмент, соответствующий аллелю PL-AI, — 212 нуклеотидных пар, а соответствующий аллелю PL-AII, — 164 нуклеотидных пар. Гель окрашивали бромистым этидием или серебром («Sigma», США).
Окраска полиакриламидного геля серебром. Полиакриламидный гель промывали водой. Помещали его в 40%-ный раствор этилового спирта на 12 ч (если гель был окрашен бромистым этидием). Затем помещали гель в 7,5%-ный раствор уксусной кислоты на 30 мин (до исчезновения краски). Промывали водой 2— 3 раза. Выдерживали гель 30 мин в растворе нитрата серебра. На 100 мл раствора — 150 мг AgN03 и 150 мкл формальдегида («Реахим»). Затем промывали гель холодной водой (4° С). Проявляли гель в растворе тиосульфата натрия («Реахим») при температуре 4° С до появления полос. На 100 мл раствора — 3 г ИагСОз («Реахим»), 300 мкл формальдегида и 20 мкл раствора тиосульфата натрия (10 мг/мл). Реакцию останавливали холодным раствором 7,5%-ной уксусной кислоты (4° С). Окраску фиксировали в 40%-ном этиловом спирте (все — «Реахим»).
Нами было обследовано 39 женщин и их новорожденных на носительство аллеля PL-AI, PL-AII гена GPIIIa. У всех обследованных беременность была осложнена гестозом и ЗРП.
Из 39 беременных страдали «чистым» гестозом 12 женщин, из них у 9 женщин гсстоз сочетался с ЗРП; у 4 женщин имелся «сочетанный» гестоз, из них у 2 — в сочетании с ЗРП. У 23 женщин была диагностирована ЗРП, явлений гестоза не было.
Всем 39 беременным и их новорожденным было проведено исследование крови на носительство аллеля PL-AI, PL-AII гена GPIIIa. В зависимости от генотипа матерей все женщины были подразделены на две группы: I-я группа
включала в себя матерей с генотипом А1А1, И-я группа включала в себя генотип матерей А1А2 и А2А2 (носительницы аллеля РЬ-А1, РЬ-АИ гена ОРШа).
После определения генотипа новорожденных был проведен анализ частоты гестоза («сочетанного» и «чистого» в сочетании с ЗРП и без него) и ЗРП. Беременных с генотипом А1А1 было 27, а носительниц аллеля РЬ-АН (гомозигота и гетерозигота) — 12. Обнаружено, что при совпадении генотипа А1А1 у 25 из 27 наблюдаемых новорожденных и их матерей беременность осложнялась различными формами гестоза и ЗРП.
При наличии аллеля РЬ-АН у новорожденных в этой же группе обследуемых (носительниц генотипа А1А1) гестоз не наблюдался ни в одном случае, ЗРП была только у 2 женщин (табл. 1) — у матерей, носительниц генотипа А1А2 и А2А2 (12 женщин). При наличии генотипа А1А1 у новорожденных (5 детей), во всех случаях у беременных была ЗРП без гестоза. Наличие генотипа А2А2 у новорожденных (2 детей), во всех случаях была ЗРП без гестоза. Наличие аллеля А1А2 отмечено у новорожденных от матерей с «чистым» гестозом и ЗРП.
Таблица 1
Генотип новорожденных в группе матерей с генотипом А1А1
Группы Количество детей с данным генотипом
А1А1 А1А2
Чистый гестоз с ЗРП 7 0
Чистый гестоз без ЗРП 2 0
Сочетанный гестоз с ЗРП 2 0
Сочетанный гестоз без ЗРП 2 0
ЗРП без гестоза 12 2
Всего (п=27): 25 2
Обнаружено, что при наличии разных генотипов у матерей и их новорожденных во всех случаях имелось ЗРП без гестоза. При совпадении аллеля РЬ-А1, РЬ-АП гена ОРШа наблюдается «чистый» гестоз (табл. 2).
Таблица 2
Генотип новорожденных в группе матерей с генотипом А1А2
Группы Количество детей с данным генотипом
А1А1 А1А2
Чистый гестоз с ЗРП 0 2 0
Чистый гестоз без ЗРП 0 1 0
Сочетанный гестоз с ЗРП 0 0 0
Сочетанный гестоз без ЗРП 0 0 0
ЗРП без гестоза 5 2 2
Всего (п=12): 5 5 2
Из анамнеза в группе обследуемых выявлено, что вегетативно-сосудистая дистония наблюдалась у 4; хроническая артериальная гипертензия — у 4; миома матки — у 1 (только у женщин, имеющих одинаковый генотип со своим ребенком). Всего у 1 женщины с разным генотипом мать—ребенок отмечена вегета-тивно-сосудистая дистония, другие заболевания в этой группе не выявлены. В группе с одинаковым генотипом патология околоплодной среды была у 11, а во
второй группе (с разным генотипом) — у 7 женщин. Преждевременное излитие околоплодных вод было у 6 беременных, которые имели одинаковые генотипы со своими детьми, и лишь у 1 женщины, имевшей разные генотипы. Следовательно, отмечались 7 случаев преждевременных родов у женщин с одинаковым генотипом и только 1 — с разными. Изменения плаценты отмечались у 9 женщин в парах с разным генотипом и в 2 раза чаще — с одинаковым.
При анализе полученных результатов выявлено, что одинаковые генотипы у матери и ребенка отмечаются во всех клинических группах, а разные генотипы у матери и новорожденного — только в одной группе, где наблюдалась ЗРП без гестоза (табл. 3).
Таблица 3
Соотношение генотипов A1A1, А1А2, (А2А2) у матерей и новорожденных
Группы Одинаковый генотип мать—ребенок Разные генотипы мать—ребенок
Чистый гестоз с ЗРП 7 0
Чистый гестоз без ЗРП 3 (4) 0
Сочетанный гестоз с ЗРП 2 0
Сочетанный гестоз без ЗРП 2 0
ЗРП без гестоза 14 (15) 9
Всего (п=39): 30 9
Несмотря на небольшое количество наблюдений, представляется возможным предположить, что развитие патологии беременности, в частности гестоза и ЗРП, может быть обусловлено как генотипом матери по гликопротеину GPIIIa, так и генотипом отца.
Предварительные результаты позволяют сделать два основных заключения:
1. При совпадении генотипов мать—ребенок выявляется весь спектр осложнений, связанных с гестозом и ЗРП: «чистый» и сочетанный гестоз, «чистый» и сочетанный гестоз без ЗРП, а также ЗРП без гестоза.
2. При разных генотипах матери и ребенка не было случаев гестоза, но имела место ЗРП как следствие декомпенсированной плацентарной недостаточности.
ЛИТЕРАТУРА
1. Хотайт Г.Я., Галина Т.В., Радзинский В.Е. Носительство аллеля PL-AII гена GPIIIa и
его связь с задержкой роста плода и гестозом // Вестник РУДН, сер. «Медицина», 2001, № 1, с. 27-30.
2. Amgrimsson R, Bjomsson К, Geirsson R Analysis of different inheritance patterns in pree-
clampsion/eclampsia syndrome I I Hypertension Pregnancy, 1995, 14, p. 27—38.
3. Chesley L.C. Hypetensive disorders in Pregnancy. — New York: Appleton-Century-crafts, 1978.
4. Cooper J.C., Sharkey A.M., Chamock-Jones D.S. Palmer C.R., Smith S.K. VEGF mRNA Levels
in placentae from pregnancies complicated by preeclampsia // Br. J. Obstet. Gynaecol, 1996,
103, p. 1191-1196.
5. Harisson G.A, Humphrey K.E., Jones N. et al. A genomewide linkage study of preeclampsia/eclampsia reveals evidence for a candidate region 4 g // Am. J. Hum. Genet., 1997, 60, p. 1158-1167.
6. Hayward C., Livingstone J., Holloway S. et al. An exclusion map for pre-eclampsia: assuming
an autosomal recessive inheritance // Am. J. Hum. Genet., 1992, p. 749—57.
7. Humphries M.J. // Biochem. Soc. Symp., 1999, vol. 65, p. 63—78.
8. Lie RT., Rasmussen S., Brunborg H., Gjessing H.K., Lie-Nielsen E., Irgens L.M. Fetal and
maternal contributions to risk of Preeclampsia; population based study // BMI, 1998, 316, p. 1343-1347.
9. Lyall F., Greer IA., Boswell F., Fleming R Suppression of serum vascular endothelial growth
factor immunoreactivity in normal pregnancy and in preeclampsia // Br. J. Gynaecol, 1997,
104, p. 223-228.
10. Ridker P.M., Hennekens C.H., Schmitz C., Stampfer M.J. // Lancet, 1979, vol. 349, p. 385—388.
11. Shimonowitz S., Hurwitz A et al. Cytokine-mediated regulation of type IV collagenase expression and production in human-trophoblastic cells // J. Chin endocrinol Metal, 1996, 81, p. 3091.
12. Simsek S. Faber N.M., Blecker P.M., Vlekke A.B., Huiskes E., Goldschmeding R, Von dem Borne A.E. // Blood, 1993, vol. 81, p. 835—840.
13. Thornton J.G., Onwude J.L. Preeclampsia: discordance among identical twins // BMJ, 1991, 303. P. 241-242.
14. Weiss L., Valenzuella J.P., Salvatierra A.M., Ortiz M.E., Croxatto H.B. // Hum. Reprod, 1998, 13, № 10, p. 2916-2920.
15. Zhou Y., Damsky C.H., Fisher S.J. Preeclampsia is associated with failure of human cytotro-phoblasts to mimic a vascular adhesion phenotype. One cause of defective endovascular invasion in this syndrome // J. Clin. Invest, 1997, 99, № 6, p. 2152—2164.
16. Zhou Y., Fisher S., Janatpour M. et al. Human cytotrophoblasts adapt a vascular phenotype as they differentiate. A strategy for Successful endovascular invasion // J. Chin. Invest, 1997 (a), 99, p. 2139-2151.
INFLUENCE OF FATHER’S GENOTYPE DURING PREGNANCY AND BIRTH OUTCOME
Sh. RAMPADARUT, T.V. GALINA, V.E. RADZINSKY,
A.A. ORAZMURADOV, N.T. KHAKHVA, D.O. NIYAZLIEVA
Department of obstetrics and gynaecology with the course of perinatology Russian University of Peoples’ Friendship Miklukho-Maklaya sir., 8, Medical Faculty, 117198 Moscow, Russia
A.V. ITKES, N.V. KARASEVA, E.V. KARPOVA
Department of biology and genetics Russian University of Peoples’ Friendship Miklukho-Maklaya str., 8, Medical Faculty, 117198 Moscow, Russia
39 mothers with EPH-gestosis and their newborns were examined. Complications during pregnancy due to EPH-gestosis and IUGR, EPH-gestosis only, IGUR only.
Objeative: Study of alleles PL-AI and PL-AII of gene GP Ilia distribution among the newborns, i.e., our specific interest is to reveal the influence of the male factors in the development of EPH-gestosis and IUGR.
Study method: We studied the DNA of peripheral blood by polymerise chain reaction.
We make two conclusions from our; work, when the genotype of mother and child coincide, there is a tendency of complicated pregnancy (EPH-gestosis and IUGR). When the genotypes of the mother and the child are different, there are no cases of EPH-gestosis, only IUGR.
