CC BY
8
УДК 543.552+612.111
Мягкова И.Н., Горончаровская И.В., Царькова Т.Г., Соколова А.А., Евсеев А.К.
ВЛИЯНИЕ ГЕМОЛИЗА НА ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕРЕНИЯ В СУСПЕНЗИИ ЭРИТРОЦИТОВ
Мягкова Инна Николаевна, студентка 4 курса факультета технологии неорганических веществ и высокотемпературных материалов;
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Горончаровская Ирина Викторовна, к.х.н., старший научный сотрудник Отделения общей реанимации, e-mail: goririna22@,gmaiLcom;
ГБУЗ «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского ДЗМ», Москва, Россия 129090, Москва, Б. Сухаревская площадь, д.3
Царькова Татьяна Григорьевна, к.х.н., профессор кафедры технологии неорганических веществ и электрохимических процессов;
Соколова Анна Андреевна, студентка 4 курса факультета технологии неорганических веществ и высокотемпературных материалов;
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Евсеев Анатолий Константинович, д.х.н., ведущий научный сотрудник Отделения общей реанимации ГБУЗ «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского ДЗМ», Москва, Россия 129090, Москва, Б. Сухаревская площадь, д.3
В настоящей работе исследовано влияние свободного гемоглобина на электрохимические измерения в суспензии эритроцитов. При проведении поляризационных измерений на стеклоуглеродном электроде в растворе свободного гемоглобина было обнаружено появление волны электроокисления с максимумом при потенциале около 800 мВ (Ag/AgCl). Установлено, что присутствие свободного гемоглобина в суспензии эритроцитов в широком диапазоне концентраций не оказывает влияния на результаты электрохимических измерений. Ключевые слова: гемоглобин, стеклоуглеродный электрод, эритроциты, вольтамперометрия
INFLUENCE OF HEMOLYSIS ON ELECTROCHEMICAL MEASUREMENTS IN ERYTHROCYTES SUSPENSION
Myagkova I.N., Goroncharovskaya I.V.*, Tsarkova T.G., Sokolova A.A., Evseev A.K.* D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia *N.V. Sklifosovsky Research Institute of Emergency Medicine, Moscow, Russia
In present work the influence of free hemoglobin on electrochemical measurements in erythrocytes suspension was investigated. The appearance of an electrooxidation wave on polarization curves on glassy carbon electrode in a free hemoglobin solution with a maximum at a potential of about 800 mV (Ag/AgCl) was observed. It was established that the presence of free hemoglobin in erythrocytes suspension in a wide range of concentrations does not affect the electrochemical measurement results.
Keywords: hemoglobin, glassy carbon electrode, erythrocytes, voltammetry
Введение
Электрохимические исследования процессов, протекающих при контакте клеток крови с чужеродными электропроводными материалами, позволили выявить электрохимическую активность эритроцитов на платиновом [1] и оптически прозрачном !ТО электродах [2]. Результаты этих исследований могут быть использованы в качестве основы для разработки электрохимических методов оценки травмирующего действия электропроводных материалов по отношению к клеткам крови, а также для определения функциональной полноценности клеток крови.
Известно, что на точность биохимических измерений в биологических средах способен
оказывать влияние гемолиз эритроцитов, который может быть вызван как естественным нарушением целостности мембраны клеток, вследствие протекания в организме патологических процессов, так и внешним воздействием на клетки (неправильный забор крови, транспортировка и хранение образца) [3]. Разрушение сопровождается разрывом мембраны и выходом гемоглобина в окружающую клетку среду. Выявление влияния свободного гемоглобина на электрохимические измерения в биологических средах, в частности, в суспензии эритроцитов является актуальной задачей.
Поиск новых методов определения гемоглобина, альтернативных спектрофотометрическим методам, привел к появлению множества исследований,
посвященных изучению электрохимического поведения гемоглобина [4]. Гемоглобин представляет собой высокомолекулярный белок, состоящий из небелковой части, гема, и белковой части - четырех полипептидных цепей, и имеет различные функциональные группы в своем составе, способные подвергаться окислению или восстановлению. Считается, что электрохимические превращения железа (Fe(II)) в составе гема преимущественно обусловливают
электрохимические свойства гемоглобина в целом [4]. Поэтому электрохимическое окисление или восстановление гемоглобина на
немодифицированных электродах затруднено, вследствие медленного процесса переноса электронов, который может быть связан как с ориентацией молекулы гемоглобина на поверхности электрода, так и с адсорбцией на поверхности электрода белков и блокированием части рабочей поверхности электрода [5].
Поэтому в настоящее время большинство методов электрохимического определения гемоглобина основано на иммобилизации гемоглобина на поверхности электрода, использовании редокс медиаторов, или на использовании модифицированных и композитных электродов [4]. Таким образом, можно заключить, что гемоглобин не должен проявлять электрохимическую активность на классических не модифицированных электродах и влиять на электрохимические измерения в суспензиях эритроцитов.
Целью данной работы являлось исследование влияния свободного гемоглобина на электрохимические измерения суспензии
эритроцитов.
Методика исследования
В качестве объекта исследования использовали суспензию эритроцитов, полученную из цельной крови практически здоровых людей. Суспензию клеток троекратно отмывали путем
центрифугирования с физиологическим раствором при 1500g и 4°C в течение 10 минут в центрифуге CR 3.12 (Jouan, Франция).
Раствор свободного гемоглобина получали путем гипотонического лизиса отмытых эритроцитов в растворе 0,01 М натрий-фосфатного буфера. Остатки мембран клеток удаляли с помощью центрифугирования при 20000g и 4°С в центрифуге Microfuge® 22R Centrifuge (Beckman Coulter, США). Полученный раствор свободного гемоглобина с концентрацией 27 г/л разбавляли физиологическим раствором (0,15M NaCl) до концентраций 0,337, 0,675, 1,35, 3,375, 6,75 и 13,5 г/л. Для исследования влияния гемолиза на электрохимические измерения в суспензии эритроцитов, суспензию клеток с концентрацией 8-1012 кл./л разбавляли растворами свободного гемоглобина в соотношении 1:1.
Поляризационные измерения проводили помощью потенциостата IPC-Pro L (ЗАО «Кронас»,
Россия) в трехэлектродной электрохимической ячейке, где в качестве рабочего электрода использовали стеклоуглерод, расположенный на дне ячейки. В качестве электрода сравнения выступала серебряная проволока, вспомогательного электрода -Т1/Р сетка. Измерения проводили в потенциодинамическом режиме в диапазоне потенциалов от 0 до 1100 мВ со скоростью развертки потенциала 10 мВ/с.
Результаты и обсуждение
Поляризационные измерения в растворе свободного гемоглобина на стеклоуглеродном электроде показали, что на анодной кривой присутствует волна окисления с пиком при потенциале около 800 мВ (Рис. 1). Было выявлено, что высота пика окисления в растворе свободного гемоглобина линейно зависит от концентрации гемоглобина во всем диапазоне исследуемых концентраций.
20 -■-1-'-"-1
îoo мо 700 еоо »о юоо
F., мК
Рис. 1. Поляризационные кривые в растворе свободного гемоглобина в 0,15М №01: 1 - 0,15М №01, 2 - 0,337 г/л, 3 - 0,675 г/л, 4 - 1,35 г/л, 5 - 3,375 г/л, 6 - 6,75 г/л, 7 - 13,5 г/л
Вероятно, волна окисления в растворе гемоглобина может быть связана с электроокислением функциональных групп белковой части молекулы гемоглобина.
Таким образом, поскольку в растворе свободного гемоглобина были обнаружены волны окисления, можно предположить, что присутствие свободного гемоглобина в суспензии клеток должно оказывать влияние на поляризационные измерения. Однако поляризационные измерения в суспензии эритроцитов в присутствии свободного гемоглобина с конечными концентрациями от 0,337 г/л до 3,375 г/л показали, что свободный гемоглобин практически не оказывает влияния на измерения в клетках (Рис. 2).
160
20 -1-.-1-1-■—
ЯРО «0 7» £00 «С 1000
к м К
Рис. 2. Поляризационные кривые в суспензии эритроцитов в 0,15М в присутствии свободного гемоглобина: 1 - 0,15М КаС1, 2 - 0 г/л, 3 - 0,337 г/л, 4 -0,675 г/л, 5 - 1,35 г/л, 6 - 3,375 г/л, 7 - 6,75 г/л
При концентрации свободного гемоглобина 6,75 г/л в суспензии эритроцитов происходило незначительное увеличение пика окисления (на 7% относительно величины пика окисления в эритроцитах в отсутствие свободного гемоглобина).
Таким образом, можно сделать вывод о том, что присутствие свободного гемоглобина не мешает электрохимическим исследованиям в суспензии эритроцитов на стеклоуглеродном электроде вплоть до концентрации свободного гемоглобина порядка 3,5 г/л. Однако, как правило, у пациентов с различными патологиями концентрация свободного гемоглобина в плазме крови не превышает значений 1 г/л, за исключением пациентов, находящихся на процедуре экстракорпоральной мембранной оксигенации или искусственного кровообращения,
когда уровень гемолиза может превышать эту
величину [6].
Список литературы
1. Tzivadze A.Yu., Khubutiya M.Sh., Goroncharovskaya I.V. [et al.] Electron transport and morphological changes in the electrode/erythrocyte system // Mend. Commun. -2017. - V. 27(2). - PP.183-185
2. Цивадзе А.Ю., Хубутия М.Ш., Евсеев А.К. и др. Электрохимическая активность и морфология эритроцитов человека на оптически прозрачном ITO электроде // ДАН. Физическая Химия. -2017. - Т.477. - №2. - С.190-193
3. Lippi G., Blanckaert N., Bonini P. [et al.] Haemolysis: an overview of the leading cause of unsuitable
specimens in clinical laboratories// Clin. Chem. Lab. Med. - 2008. - V. 46. - № 6. - PP.764-772.
4. Hussain K.K., Moon J.M., Park D.S., Shim Y.B. Electrochemical detection of hemoglobin: A review // Electroanalysis. - 2017. - V. 29. - PP. 21902199
5. Zhang L., Jiang X., Wang E., Dong S. Attachment of gold nanoparticles to glassy carbon electrode and its application for the direct electrochemistry and electrocatalytic behavior of hemoglobin // Biosens. Bioelectron. - 2005. - V. 21. - PP. 337345
6. Neal J.R., Quintana E., Pike R.B. [et al.] Using daily plasma-free hemoglobin levels for diagnosis of critical pump thrombus in patients undergoing ECMO or VAD support // J. Extra. Corpor. Technol. - 2015. - V. 47. - PP. 103-108
