CC BY
46
УДК 616:612.017.1
ВЛИЯНИЕ ГАЛЕКТИНА-3 НА АПОПТОЗ АКТИВИРОВАННЫХ IN VITRO СD4+-ЛИМФОЦИТОВ
О.А. Васильева, А.В. Исаева, Н.В. Рязанцева
Сибирский государственный медицинский университет,
г. Томск E-mail: vasiljeva-24@yandex.ru
Одним из быстро развивающихся направлений науки является гликобиология, изучающая лектин-углеводные взаимодействия. В качестве перспективных регуляторов клеточного гомеостаза в настоящее время рассматриваются эндогенные гликансвязываю-щие белки семейства лектинов - галектины. Галектин-3 является многофункциональным белком, участвующим в регуляции жизненного цикла клеток, однако остаются малоизученными его проапоптотические эффекты в отношении СБ4+-лимфоцитов. Целью работы явилось изучение влияния галектина-3 на апоптоз СБ4+-лимфоцитов in vitro. Мононуклеарные лейкоциты здоровых доноров активировали с помощью антител к CD3 и CD28 и культивировали с добавлением рекомбинантного галектина-3. Активность апоптоза CD4+-лимфоцитов определяли методом проточной цитофлуориметрии по выходу фосфатидилсерина на внешнюю поверхность цитоплазматической мембраны, увеличению проницаемости для витального красителя 7-аминоактиномицина D (7AAD) и снижению потенциала митохондрий. Добавление галектина-3 в диапазоне доз от 1,0 до 2,5 мкг/мл приводило к значительному повышению содержания Annexin+7AAD+-CD4+-лимфоцитов. При этом достоверно увеличивалось количество лимфоцитов со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий. Установлено, что галектин-3 оказывает дозозависимое проапоптотическое действие на CD4+-лимфоциты in vitro, характеризующееся увеличением количества клеток с деполяризованной митохондриальной мембраной.
Ключевые слова:
Галектин-3, лимфоциты, апоптоз, митохондриальный потенциал.
Введение
Развитие и функционирование многоклеточных биологических систем зависят от сложных взаимодействий между клетками, формирующими морфофункциональные межсистемные связи в организме. В этих взаимодействиях трудно переоценить роль апоптоза как процесса, определяющего альтруистическое поведение индивидуальных клеток в пользу организма [1].
Высокую актуальность приобрела проблема целенаправленного регулирования программированной гибели клеток с применением средств активации или инактивации молекулярных мишеней при различных патологических процессах.
Перспективными агентами, регулирующими жизненный цикл клетки, являются низкомолекулярные белки семейства лектинов - галектины. К настоящему времени в клетках млекопитающих идентифицированы 15 представителей данного семейства [2].
Галектин-3 относится к галектинам «химерного» типа, который состоит из одного С-концевого углеводсвязывающего домена и одного К-концевого регуляторного домена, содержащего повторяющиеся коллагеноподобные участки, и обладает высокой подвижностью [3].
Васильева Ольга Александровна, канд. мед. наук, ассистент кафедры молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики СибГМУ, г. Томск. E-mail: vasiljeva-24@yandex.ru Область научных интересов: молекулярная медицина, диф-ференцировка Т-лимфоцитов, галектины, апоптоз. Исаева Анна Владимировна, аспирант кафедры патофизиологии СибГМУ, г. Томск. E-mail: seneann@mail.ru Область научных интересов: механизмы опухолевой трансформации, цитогенетика, внутриклеточный сигналинг. Рязанцева Наталья Владимировна, д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики СибГМУ, г. Томск. E-mail: nv_ryazan@mail.ru Область научных интересов: внутриклеточный сигналинг, регуляция апоптоза, трансляционная медицина.
Галектин-3 секретируется клетками лимфоузлов, тимуса, селезенки, а также лимфоцитами, макрофагами, дендритными и опухолевыми клетками [4, 5]. Известно, что галектин-3 способен взаимодействовать с РНК и РНК-связывающими белками, участвуя в процессе сплайсинга, а также связываться с белками Bcl-2, регулируя апоптоз [6].
Галектин-3 является единственным представителем семейства, который способен запускать апоптоз по внеклеточному и митохондриальному путям, более того, показано, что данный лектин может обладать как про-, так и антиапоптотической активностью [7].
Исследования, посвященные изучению галектина-3, в основном направлены на оценку взаимосвязи наличия галектина-3 и степени злокачественной трансформации клетки. Однако литературные данные свидетельствуют о том, что галектин-3, как и другие представители этого семейства, может влиять на иммунный ответ и тем самым способствовать уходу опухолевых клеток из-под иммунологического надзора. Один из механизмов, позволяющий трансформированным клеткам быть незамеченными иммунной системой, заключается в индукции апоптоза лимфоцитов, находящихся в зоне контакта.
Цель работы: оценить влияние галектина-3 на апоптоз CD4+-лимфоцитов in vitro.
Материалы и методы исследования
В исследовании приняли участие 16 практически здоровых доноров от 18 до 33 лет, средний возраст составил 23 ±5 лет. Материалом для исследования служила периферическая кровь, взятая утром натощак из локтевой вены в количестве 20 мл в вакуумные пробирки с антикоагулянтом К3-ЭДТА. Для исследования лимфоциты выделяли из крови методом градиентного центрифугирования. Количество выделенных клеток стандартизировали до 2,0 x107мл, разбавляя полной питательной средой, состоящей из 90%-й RPMI-1640 (ЗАО «Вектор», Россия), 10%-й инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ООО «Биолот», Россия), 0,3 мг/мл L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.
Выделенные лимфоциты разделяли на несколько культур, культивирование которых проводили в специализированных 48 луночных стерильных планшетах с крышкой (BD Falcon , США). Для создания in vitro условий, близких к естественным, использовали моноклональные активирующие антитела - анти-CD3/анти-CD28 (BD Pharmingen , США), добавляя их в культуру клеток в концентрациях 1,0 и 2,0 мкг/мл соответственно. Способность рекомбинантного галектина-3 (RnDSystems, США) вызывать апоптоз лимфоцитов оценивали в диапазоне концентраций от 0,5 до 2,5 мкг/мл. Галектин-3 вводили в культуральную среду для мононуклеарн-ных лейкоцитов, и клетки инкубировали при 37 °С в атмосфере 5 % СО2 в течение 18 ч. Контрольную группу составили клетки, культивированные в отсутствие галектина-3. Активность апоптоза CD4+-лимфоцитов определяли по выходу фосфатидилсерина на внешнюю поверхность цитоплазматической мембраны и увеличению проницаемости для витального красителя 7-аминоактиномицина D (7AAD). Для этого клетки окрашивали анти-СБ4-ФИТЦ антителами (ООО «Сорбент», Россия), аннексином-V, меченным фикоэритрином (eBioscience, США), и 7AAD (RnDSystems, США) согласно протоколам фирм-производителей. Регистрировали число CD4+-лимфоцитов, связавших двойную метку (Annexin7AAD), и число жизнеспособных клеток (Annexin-7AAD) на проточном цитофлуориметре FACSCanto II (BD, США). Для оценки процента клеток со сниженным митохондриальным потенциалом использовали набор DePsipher™ Kit (Trevigen, Inc., USA). Клетки в количестве 1*106 отмывали от культуральной среды фосфатно-солевым буфером и добавляли реакционный буфер, содержащий 5 мкг/мл DePsipher (JC1), инкубировали при 37 °С, 5 % CO2 20 минут. Распределение лимфоцитов по каналам флуоресценции FL1 (JC-мономеры) и FL2 (JC-агрегаты) анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCanto II (BD, США). Принцип метода основан на том, что флюорохром JC-1 (5,5',6,6'-тетрахлоро-1,1',3,3'-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианин йодид) способен существовать в двух различных состояниях: агрегатах и мономерах. JC-1-мономер быстро проникает через митохондриальную мембрану живой клетки, в результате чего внутри митохондрии формируются JC-1-агрегаты, характеризующиеся красным спектральным свечением, которое измеряется на FL-2 канале проточного цитометра. При деполяризации митохондриальной мембраны, являющейся ранним признаком апоптоза, JC-1 не накапливается внутри митохондрии и
находится в цитоплазме в виде мономерной формы, которая характеризуется зеленым спектральным свечением, что измеряется на FL-1-канале проточного цитометра.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 6.0. Оценку нормальности распределения полученных результатов проводили с использованием критерия Шапиро Вилка. Достоверность различий (Р < 0,05) оценивали с помощью непараметрического критерия Вилкоксона для зависимых выборок. Данные представлены в виде медианы (Ме), верхнего и нижнего квартилей (Q25-Q75).
Результаты и обсуждение
В работе было исследовано in vitro влияние галектина-3 на апоптоз CD4+-лимфоцитов, активированных с помощью антител к CD3 и CD28, имитирующих взаимодействие Т-лимфоцитов с антигенпредставляющими клетками (анти-СD3 связываются с Т-клеточным рецептором, анти-СD28 связываются с гликопротеином CD28 на Т-лимфоцитах). В результате тестирования различных доз рекомбинантного галектина-3 (от 0,5 до 2,5 мкг/мл) было установлено, что в дозе 0,5 мкг/мл изучаемый лектин не вызывает апоптоз лимфоцитов. Однако при добавлении рекомбинантного галектина-3 в диапазоне концентраций от 1,0 до 2,5 мкг/мл регистрировали статистически достоверное дозозависимое увеличение количества аннексинV/7AAD-положительных лимфоцитов (p < 0,05) (рис. 1).
Концентрация рекомбинантного галектина-3, мкг/мл -Д— Annexin+7AAD+ —■■ - Annexin-7AAD-
Рис. 1. Количество апоптотически измененных (Annexin+7AAD+) и жизнеспособных CD4+-лимфоцитов (Annexm-7AAD-), активированных антителами к CD3 и СD28, в зависимости от концентрации рекомбинантного галектина-3 в культуральной среде: * - р < 0,05 по сравнению с аналогичными показателями в интактной культуре лимфоцитов; # - р < 0,05 по сравнению с аналогичными показателями, полученными при добавлении галектина-3 в дозе 1,0 мкг/мл; А - p < 0,05 по сравнению с аналогичными показателями, полученными при добавлении галектина-3 в дозе 2,0 мкг/мл
Проапоптотические концентрации галектина-3, в которых отмечалось значимое увеличение клеток в состоянии апоптоза, в дальнейшем тестировались при изучении влияния галек-тина-3 на изменение митохондриального потенциала лимфоцитов. Согласно данным литературы, вероятным механизмом реализации программированной клеточной гибели, индуцирован-
ной галектинами, является митохондриальный путь. Данный вариант запуска программированной клеточной гибели включает изменения в электронном транспорте, снижение митохондри-ального трансмембранного потенциала [8], изменения клеточного редокс-баланса [9], выход индукторов смерти (цитохром с [10], 8тас/Б1АБЬО [11], АШ [12], эндонуклеаза G) и взаимодействие про- и антиапоптотических белков семейства Вс1-2 [13, 14]. Универсальным признаком данного пути гибели клетки является снижение трансмембранного потенциала митохондрий, образованного градиентом протонов Н+, за счет активации специфических каналов во внешней митохондриальной мембране [15]. В результате окрашивания клеток, проведенного с помощью митохондриального зонда JC-1, нами было установлено, что в проапоптотических дозах галектин-3 приводит к деполяризации митохондриальной мембраны. Добавление в среду для культивирования лимфоцитов рекомбинантного галектина-3 в дозе 1 мкг/мл сопровождалось увеличением в 2,4 раза количества клеток со сниженным митохондриальным потенциалом, при увеличении концентрации галектина-3 до 1,5 и 2,0 мкг/мл регистрировали повышение количества лимфоцитов, содержащих .ТС-мономеры в 3,3 и 4,6 раз соответственно (табл. 1).
Таблица 1. Количество лимфоцитов, содержащих JC-мономеры/агрегаты при добавлении проапоптотических доз рекомбинантного галектина-3, Ме ^25^75)
Показатель Контрольная группа Доза рекомбинантного галектина-3, мкг/мл
1,0 1,5 2,0
Количество клеток, содержащих .ТС-мономеры, % 12,55 (11,10-14,10) 29,95* (26,45-31,30) 41,40* (33,30-46,15) 58,10* (47,42-63,20)
Количество клеток, содержащих .ГС-агрегаты, % 79,98 (72,40-87,00) 68,45* (64,30-72,40) 56,95* (52,10-63,80) 40,25* (34,20-53,40)
Примечание: «*» - статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,05).
Программированная клеточная гибель является необходимым механизмом контроля иммунного ответа на различных стадиях лимфопоэза [16]. При этом апоптоз активированных СБ4-лимфоцитов под действием галектина-3 может иметь как физиологическое, так и патогенетическое значение. С одной стороны, таким способом может осуществляться ауторегуляция, направленная на предотвращение избыточной активации иммунных реакций и защиту здоровых тканей от иммуно-опосредованного повреждения. С другой стороны, гибель лимфоцитов под действием галектинов, секретируемых опухолевыми клетками, способствует опухолевой прогрессии в результате формирующейся иммуносупрессии. Способность секретировать галек-тин-3 показана для клеток колоректального рака, предстательной и щитовидной железы, мела-номы и новообразований других локализаций [17]. При этом галектин-3 является не только прогностическим маркером и важным фактором злокачественного потенциала опухолей, но и обладает выраженным проапоптотическим действием на лимфоциты, осуществляющие иммунологический контроль.
Выводы
В результате исследования влияния рекомбинантного галектина-3 на реализацию программированной гибели лимфоцитов установлено, что галектин-3 оказывает дозозависимое проапоптотическое действие на CD4 -лимфоциты in vitro, характеризующееся увеличением количества клеток с деполяризованной митохондриальной мембраной. Учитывая, что галектин-3 в больших количествах способен секретироваться опухолевыми клетками и индуцировать апоптоз Т-лимфоцитов, то данный белок может рассматриваться в качестве перспективной терапевтической мишени при опухолевых заболеваниях.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации (№ НШ-4184.2014.7).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Фармакологическое регулирование программированной гибели клеток / Под ред. В.А. Черешнева. - СПб.: Наука, 2011. - 255 с.
2. Рапопорт Е.М., Почечуева Т.В., Курмышкина О.В. и др. Твердофазные системы для исследования углеводной специфичности галектинов // Биохимия. - 2010. - Т. 75. - № 3. - С. 380-390.
3. Рапопорт Е.М., Курмышкина О.В., Бовин Н.В. Галектины млекопитающих: структура, углеводная специфичность и функции / // Биохимия. - 2008. - Т. 73. - № 4. - С. 483-497.
4. Васильева О.А., Якушина В.Д., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. Возможности использования галектина-3 в лабораторной диагностике (мини обзор). Клинико-лабораторный консилиум.38, 12-16.
5. Васильева О.А., Якушина В.Д., Рязанцева Н.В. и др. Регуляция экспрессии генов транскрипционных факторов дифференцировки Т-лимфоцитов CD4+ галектином-3 in vitro // Молекулярная биология. - 2013. -Т. 47, № 6. - С. 1004-1010.
6. Антонова С. С., Юшков П. В. Галектин-3 как представитель семейства лектинов: роль в норме и при патологии // Молекулярная медицина. - 2004. - № 1. - С. 60-64.
7. Stillman B.N., Hsu D. K, Pang M. et al. Galectin-3 and Galectin-1 Bind Distinct Cell Surface Glycoprotein Receptors to Induce T Cell Death // The Journal of Immunology. - 2006. - V. 176. - P. 778-789.
8. Green D.R., Evan G. I. A matter of life and death // Cancer Cell. - 2002. - N 1. - P. 19-30.
9. Katoh I., Tomimori Y., Ikawa Y., Kurata S. Dimerization and processing of procaspase-9 by redox stress in mitochondria // JBC. - 2004. - V. 279. - P. 15515-15523.
10. Bianchi C., Fato R., Angelin A. et al. Yessotoxin, a shellfish biotoxin, is a potent inducer of the permeability transition in isolated mitochondria and intact cells // Biophys Acta. - 2004. - V. 1656. - P. 139-147.
11. Wu G., Chai J., Suber T.L. et al. Structural basis of IAP recognition by Smac/DIABLO // Nature. - 2000. - V.408. - P. 1008-1012.
12. Joza N., Susin S. A., Daugas E. Essential role of the mitochondrial apoptosis-inducing factor in programmed cell death // Nature. - 2001. - V. 410. - P. 549-554.
13. Roucou X., Montessuit S., Antonsson B. et al. Bax oligomerization in mitochondrial membranes requires tBid (caspase-8-cleaved Bid) and a mitochondrial protein / // Biochem. J. - 2002. - V. 368. - P. 915-921.
14. Cory S., Adams J.M. The Bcl-2 family: regulators of the cellular life-or-death switch // Nat. Rev. Cancer. - 2002. - V. 2. - P. 647-656.
15. Galluzzi L., Zamzami N., de La Motte Rouge T. et al. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis // Apoptosis. - 2007. - V. 12 (5). - P. 803-813.
16. Saveleva O.E., Litvinova L.S., Anishchenko E.S. et al. The role of transcription factors in cyto-kine-mediated apoptosis of lymphocytes // International Journal of Biology. - 2012. - V. 4 (1). -P.129-137.
17. Radosavljevic G., Volarevic V., Jovanovic I. The roles of Galectin-3 in autoimmunity and tumor progression // Immunol Res. - 2012. - Р. 100-110.
Поступила 6.02.2015 г.
