CC BY
53
УДК: 616-006.04: 577.352:(615+544.7)
ВПЛИВ ФУЛЕРЕНІВ С60 НА ВИЖИВАНІСТЬ КЛІТИН MCF-7 РАКУ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ ЗА ТРИВАЛОЇ ІНКУБАЦІЇ
1Київський національний університет імені Тараса Шевченка 2Відділення біотехнічних проблем діагностики
Інституту проблем кріобіології та кріомедицини НАН України, Харків 3Національний інститут раку, Київ, Україна Е-mail: igrynyuk@yahoo.com
Досліджено вплив пристінних фулеренів С60 (10-5 М) на виживаність клітин MCF-7 раку молочної залози за тривалої інкубації без заміни культурального середовища. Встановлено, що на початковому етапі інкубації після внесення фулеренів С60 у середовище культивування відбувається збільшення кількості клітин у S-фазі, однак у подальшому спостерігається затримка клітин у фазі G2/M, втрата здатності до формування відростків та зниження вмісту життєздатних клітин у популяції. За дії фулеренів С60 у субпопуляції, що виживає через 6 діб, збільшується вміст клітин у S-фазі.
Ключові слова: фулерени С60, клітини MCF-7 раку молочної залози.
1.1. Гринюк1 О. М. Перепелиціна2 С. В. Прилуцька1 Л. В. Гарманчук1 Н. М. Храновська3 О. П. Матишевська1 М. В. Сидоренко2
На сьогодні активно вивчаються можливості застосування модуляторів виживання пухлинних клітин з метою пригнічення їх проліферації. Здатність до проліферації, метастазування та міграції злоякісно трансформованих клітин значною мірою залежить від їхніх адгезивних властивостей та участі позаклітиного матриксу в регуляції клітинного циклу.
Раніше нами було виявлено, що можливими модифікаторами адгезивного потенціалу пухлинних клітин МСЕ-7 можуть бути фулерени С60 [1]. Завдяки малим розмірам та гідрофобності фулерени С60 здатні взаємодіяти з біологічними молекулами, вбудовуватись у мембрани та виявляти біологічні ефекти [2]. Вплив фулеренів С60 на клітинні мембрани здійснюється різними шляхами — адсорбуванням на поверхні, вбудовуванням у ліпідний бішар та/або зв’язуванням із мембранними протеїнами [2-4]. Існують дані щодо впливу фулеренів С60 на взаємодію епітеліальних клітин з елементами позаклітинного матриксу [5], експресію адгезивного протеїну ІСАМ-І в ендотеліальних клітинах [6], проведення регуляторних сигналів у клітинах гепатоми [7].
Одним із підходів до пошуку сполук, здатних впливати на показники життєздатності пухлинних клітин, зокрема клітин MCF-7 аденокарциноми молочної залози, є тривале інкубування без заміни культурального середовища (модель «unfed culture») [8, 9]. Клітини MCF-7 характеризуються високим клоногенним і метастатичним потенціалом та здатністю до прогресії за умов нестачі живильних субстратів. Метою роботи було оцінити вплив фулеренів С60 на виживаність, розподіл за фазами клітинного циклу та морфологічний стан клітин MCF-7 у динаміці їх тривалої інкубації без заміни культурального середовища.
Матеріали і методи
Клітинна лінія та умови культивування. Дослідження виконано на клітинній лінії MCF-7 (рак молочної залози людини), наданій доктором І. Гутом (Людвіговський раковий інститут, Лондон). Клітини (180 ± 6 тис/мл) висаджували у 24-лункові планшети та інкубували в середовищі RPMI-1640 (Sigma, США) з додаванням 15% ЕТС (Sigma, США) і 40 мкг/мл гентаміцину
за стандартних умов, в атмосфері 100% вологості та 5% СО2. Через 24 год адаптивного періоду до клітин додавали фулерени С60 (кінцева концентрація 10-5 М) та інкубували упродовж іще 5 діб без заміни культурального середовища. Клітини в контролі інкубували без внесення фулеренів С60.
Стабільні водні колоїдні розчини пристінних фулеренів С60 (72 мкг/мл, чистота >99,5%) було виготовлено в хімічній лабораторії Технічного університету Ільменау (Німеччина) [3] й люб’язно надано професором П. Шарффом.
Оцінювання кількості життєздатних клітин упродовж інкубаційного періоду здійснювали з використанням стандартного тесту виключення барвника трипанового синього. Загальну кількість клітин у суспензії визначали після їх відкріплення від субстрату з використанням розчину Версена [10]. Підрахунок кількості клітин виконували в камері Горяєва.
Аналіз розподілу клітин за фазами мітотичного циклу здійснювали з використанням обладнаного аргоновим лазером (^збуд = 488 нм, ^ем1с = 585/40 нм) протокового цитофлюориметра (Becton Dickinson, США). Відкріплені від субстрату клітини відмивали у середовищі RPMI 1640 та оцінювали (10 тис. клітин) за показниками світлорозсіювання з метою виключення деб-рису. Після додавання розчину, що містив йодистий пропідій (10 мкг/мл), 0,1%-й тритон Х-100 та РНК-азу А (2,5 мкг/мл), проби аналізували із застосуванням програми Mod Fit LT 3.0 (BDIS, USA), як описано в [11].
Морфологічні показники. Для оцінювання морфологічного стану клітини (180 ± 6 тис/мл) висаджували на предметні скельця, які вміщували в 6-лункові планшети. Після інкубації клітини фіксували на скельцях упродовж 30 хв при кімнатній температурі з використанням суміші спирт-формаль-дегід (1:3), промивали 0,9%-м NaCl, профарбовували розчином азур-еозину та гематок-силін-еозину (1:1) упродовж 10-20 хв. Фотографування препаратів клітин проводили застосовуючи цифрову фотокамеру Digital Still Camera з об’єктивом Carl Zeiss Vario-Sonar (32-кратне збільшення).
Статистичну обробку результатів здійснювали за критерієм Стьюдента.
Результати та обговорення
Зображена на рис. 1 крива 1 демонструє кінетику виживаності клітин MCF-7 у контролі в досліджуваний термін інкубації. Упро-
довж трьох діб після висаджування кількість клітин у популяції значно збільшується, це узгоджується з тривалістю клітинного циклу клітин MCF-7, який коливається у межах 33-75 год залежно від умов культивування [12]. У подальший термін інкубації (3-4 доби) спостерігається уповільнення росту клітин, про що свідчить також зменшення кількості клітин у S-фазі та збільшенення — у С2-фазі (рис. 2, Б). Після чотирьох діб культивування клітини гинуть через нестачу поживних речовин у культуральному середовищі.
Доба культивування
Рис. 1. Виживаність клітин MCF-7 упродовж культивування у контролі (1) та після додавання фулеренів С60 (10-5 М) (2)
*Р < 0,05 порівняно з контролем, n = 6
Фулерени С60 впливають на виживаність клітин MCF-7 та їх розподіл за фазами клітинного циклу. Так, на початковому етапі інкубації після внесення фулеренів С60 у середовище спостерігається прискорення росту клітин (рис. 1) та збільшення кількості клітин, які перебувають на стадії репліка-тивного синтезу ДНК (рис. 2, А). Проте у подальший термін інкубації виявляється цитотоксичний ефект фулеренів С60 — через 3 доби після внесення фулеренів С60 у середовище культивування кількість живих клітин знижується на 30% порівняно з контролем (рис. 1). Нами встановлено також, що в цей термін інкубації після внесення фулеренів С60 у популяції підвищується вміст мертвих клітин (36 ± 4 тис/мл) порівняно з контролем (22 ± 3 тис/мл).
Виявлені наслідки дії фулеренів С60 можуть бути пов’язані зі зміненим проходженням клітин MCF-7 через мітотичний цикл. Дані, отримані через 2 доби після внесення С60 у культуральне середовище, вказують на
Рис. 2. Розподіл клітин MCF-7 за фазами клітиного циклу через 1 (А), 2 (Б), та 5 (В) діб після внесення фулеренів С60 у культуральне середовище.
Контроль — клітини, інкубовані за відсутності С60; *Р < 0,05 порівняно з контролем, n =5
те, що входження клітин у S-фазу пригнічується, а клітини, що завершили синтез ДНК і вступили в G2/M, зазнають затримки у цій фазі. Так, вміст в G^M-фазі клітин, інкубованих із С60, удвічі перевищує показник у контролі (рис. 2, Б). Слід зазначити, що блокування клітинного циклу у фазі G2/M з подальшою індукцією загибелі клітин є характерним виявом дії протипухлинних препаратів [13, 14, 15].
Необхідною умовою проліферації in vitro клітин MCF-7 є формування фокусів адгезії,
яке залежить від експресії специфічних мембранних адгезивних протеїнів. На третю добу культивування у популяції контрольних клітин виявляються розпластані на субстраті клітини, що формують видовжені відростки (позначено стрілками на рис. 3, А). Під час інкубації у присутності фулеренів С60 клітини стають округлішими і не утворюють відростків (рис. 3, Б). Такі результати морфологічного аналізу узгоджуються з раніше отриманими нами даними щодо зниження показника адгезії до субстрату клітин МСЕ-7 через 2 доби після інкубації з фулеренами С60 [1] і демонструють взаємозв’язок між зміною адгезивних властивостей клітин МСЕ-7 та їх проходженням через клітинний цикл за дії фулеренів С60.
ТУ ** Ж' 41 * /.
ж
Mb4 Сч 4 p
дУі Д - ■ Ш КГ^Жі л jNi шр > А
*
Ш
\
Б
Рис. 3. Мікрофотографії клітин МЄР-7 через 3 доби культивування у контролі (А) та за умови внесення фулеренів С60 (Б)
Кількість клітин, що вижили через 6 діб культивування, є незначним — 95 ± 11 тис/мл, а вміст мертвих становить 145 ± 15 тис/мл. Клітини, що вижили, характеризуються значним проліферативним потенціалом, оскільки 51% перебуває у S-фазі (рис. 2, Б).
Після внесення фулеренів С60 вміст мертвих клітин у цей термін підвищується до 215 ± 18 тис/мл. Водночас за дії фулеренів С60 спостерігається підвищення кількості клітин у S-фазі. Виявлений ефект фулеренів С60 може бути використаний для прискорення переходу О0/О1 ^ S клітин МСЕ-7 у кло-ногенній субпопуляції, що виживає за умов нестачі поживних речовин у мікрооточенні, з метою подальшого цільового впливу на цю субпопуляцію протипухлинних агентів.
Механізм дії фулеренів С60 ще не з’ясовано. Він може бути реалізованим на декількох рівнях впливу — на елементи позаклітинного матриксу, на структурно-функціональний стан плазматичної мембрани або ж на механізми проведення регуляторних сигналів шляхом активації/інактивації цик-лінзалежних кіназ чи інших внутрішньоклітинних медіаторів прогресії клітинного циклу [6, 7].
ЛІТЕРАТУРА
1. Гарманчук Л. В., Перепелиціна О. М., Гринюк 1.1. та ін. Фулерени С60 змінюють адгезивні властивості клітин раку молочної залози MCF-7 // Доп. НАНУ. — 2009. — №4. — С. 164-167.
2. Foley S., Crowley C., Smaihi M. et al. Cellular localization of a water-soluble fullerene derivative // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2002. — V. 294. — P. 116-119.
3. Prylutska S. V., Grynyuk 1.I, Matyshevska O. P. et al. Biological effects of C60 fullerenes in vitro and in a model system // Mol. Cryst. Lig. Cryst. — 2007. — V. 468. — P. 265-274.
4. Higgins M. J., Polcik M,, Fukuma T. et al. Structured water layers adjacent to biological membranes // Biophys. J. — 2006. — V. 91 (7). — P. 2532-42.
5. Straface E., Natalini B., Monti D. et al. C3-fullero-tris-methanodicarboxylic acid protects epithelial cells from radiation-induced anoikia by influencing cell adhesion ability // FEBS Lett. — 1999. — V. 454 (3). — P. 335-40.
6. Gelderman M. P., Simakova O., Clogston J. D. et al. Adverse effects of fullerenes on endothelial cells: fullerenol C60(OH)24 induced tissue factor and ICAM-I membrane expression and apopto-sis in vitro// Int. J. Nanomed. — 2008. — V. 3(1). — P. 59-68.
7. Huang Y. L, Shen C. R, Luh T. Y et al. Blockage of apoptotic signaling of transforming growth factor-beta in human hepatoma cells by car-boxyfullerene // Eur. J. Biochem. — 1998. — V. 254 (1). — P. 38-43.
8. Sheridan J. W., Bishop C. J., Simmons R. J. Biophysical and morphological correlates of kinetic change and death in a starved human
Таким чином, отримані дані свідчать про вплив фулеренів С60 на показники життєздатності клітин MCF-7 за умов культивування без заміни культурального середовища. На початковому етапі інкубації після внесення фулеренів С60 у середовище культивування спостерігається прискорення росту клітин та збільшення кількості клітин у S-фазі. Однак у подальшому відбувається затримка клітин у фазі G2/M, втрата здатності до формування відростків та зниження вмісту життєздатних клітин MCF-7 у популяції. За дії фулеренів у субпопуляції, що виживає упродовж тривалої інкубації, збільшується вміст клітин у S-фазі, що є важливим для пошуку шляхів підвищення ефективності дії протипухлинних препаратів.
Роботу виконано за підтримки Національної академії наук України в рамках програми «Наноструктурні системи, наномате-ріали, нанотехнології», договір № 127/08-Н.
melanoma cell line // J. Cell Sci. — 1981. —
V 49. — P. 119-137.
9. Pyaskovskaya O. N., Kolesnik D. L., Kolobov A. V. et al. Analysis of growth kinetics and proliferative heterogeneity of lewis lung carcinoma cells growing as unfed culture // Exp. Oncol. — 2008. — N4. — Р. 269-275.
10. Garmanchuk L. V., Pyaskovskaya O. N., Ya-nish Yu. V. et al. Influence of aconitine-containing herbal extract BC1 on proliferative and electrokinetic characteristics of endothelial cells // Ibid. — 2005. — V. 27 (4). — P. 262-266.
11. Кульчиков А. Е, Моложавая О. С., Скачкова О. В. и др. Сравнительное изучение иммунокорригирующего действия нейропептидных препаратов при острой экспериментальной цереброваскулярной патологии // Цитоки-ны и воспаление. — 2009. — №3. — С. 18-23.
12. Cos S, Sanchez-Barcelo E. J. Melatonin inhibition of MCF-7 human breast-cancer cells growth: influence of cell proliferation rate // Cancer Lett. — 1995. — V. 93 (2). — Р. 207-212.
13. Alhasan S. A., Pietrasczkiwicz H, Alonso M. D. et. al. Genistein-induced cell cycle arrest and apoptosis in a head and neck squamous cell carcinoma cell line // Nutr. Cancer. — 1999. — V. 34. — P. 12-19.
14. Lee T. K., Lau T. C., Ng I. O. Doxorubicin-induced apoptosis and chemosensitivity in hepatoma cell lines // Canc. Chemoth. Pharm. — 2002. — V. 49. — P. 78-86.
15. Tanaka Y., Fujiwara K., Tanaka H. et al. Paclitaxel inhibits expression of heat shock protein 27 in ovarian and uterine cancer cells // Int. J. Gynecol. Canc. — 2004. — V. 14. — Р. 616-620.
ВЛИЯНИЕ ФУЛЛЕРЕНОВ С60 НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ КЛЕТОК
MCF-7 РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОЙ ИНКУБАЦИИ
И. И. Гринюк1 Е. М. Перепелицина2 С. В. Прилуцкая1 Л. В. Гарманчук1
Н. Н. Храновская3 О. П. Матишевская1 М. В. Сидоренко2
1Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко 2Отделение биотехнических проблем диагностики Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков Национальный институт рака, Киев
E-mail: igrynyuk@yahoo.com
Изучено влияние изначальных фуллеренов С60 (10-5 М) на выживаемость клеток линии MCF-7 рака молочной железы при длительном культивировании без замены культуральной среды. Показано, что на начальном этапе инкубации после внесения фуллеренов С60 в среду культивирования происходит увеличение количества клеток в S-фазе. При дальнейшем культивировании наблюдается задержка клеток в фазе G2/M, потеря способности к формированию отростков и снижение содержания жизнеспособных клеток в популяции. При действии фуллеренов С60 в субпопуляции, выжившей через 6 суток, увеличивается содержание клеток в S-фазе.
Ключевые слова: фуллерены С60, клетки MCF-7 рака молочной железы.
INFLUENCE OF FULLERENES C60 ON THE SURVIVABILITY OF BREAST CANCER CELL LINE MCF-7 DURING LONG-TERM INCUBATION
I.I. Grynyuk1 O. M. Perepelytsina2
S. V. Prylutska1 L. V. Garmanchuk1 N. N. Khranovska3 O. P. Matyshevska1 M. V. Sydorenko2
1Kyiv National Taras Shevchenko University 2Institute for Problem of Cryobiology and Cryomedicine of National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv 3Kyiv National Institute of Cancer
E-mail: igrynyuk@yahoo.com
Effects of pristine fullerenes C6G on breast cancer cells MCF-T survivability during longterm cultivation were studied. Treatment with fullerenes C60 (10-5 М) resulted in increasing of the number of cells in G2/M phase, changes in cells morphology, decreasing of the number of survival cells and their synchronization in S-phase.
Key words: fullerenes C6G, breast cancer cells MCF.
