CC BY
10
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальная медицина
ORiGiNAL RESEARCH
i Experimental medicine
© Коллектив авторов, 2022 УДК 611.018
DOI - https://doi.org/10.14300/mnnc.2022.17017 ISSN - 2073-8137
ВЛИЯНИЕ ФОТОПЕРИОДА И ЭКЗОГЕННОГО МЕЛАТОНИНА НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ И АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ СЕЛЕЗЕНКИ
Е. М. Лузикова, Л. В. Оганесян, О. А. Ефремова,
А. В. Московский, Д. О. Сумбаев, А. Р. Абузаров, В. Е. Сергеева
Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова, Чебоксары, Российская Федерация
THE EFFECT OF PHOTOPERIOD AND EXOGENOUS MELATONIN ON PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF SPLEEN LYMPHOCYTES
Luzikova E. M., Oganesian L. V., Efremova O. A.,
Moskovskii A. V., Sumbaev D. O., Abuzarov A. R., Sergeeva V. E.
I. N. Ulyanov Chuvash State University, Cheboksary, Russian Federation
Было изучено действие мелатонина на пролиферацию (Ю-67+) и апоптоз (Саspаsа-3+) клеток селезенки мышей, содержавшихся в условиях естественного фотопериода и в условиях отсутствия фотопериода (при постоянном затемнении). Исследование показало, что процессы апоптоза и пролиферации являются фотозависимыми: стимуляция пролиферации и апоптоза лимфоцитов мелатонином возможна при естественном фотопериоде. Введение мелатонина при отсутствии фотопериода, напротив, снижает апоптоз и пролиферацию лимфоцитов и клеток стромы селезенки как в красной, так и в белой пульпе, что является проявлением адаптогенного действия мелатонина.
Ключевые слова: селезенка, мелатонин, фотопериод, пролиферация, апоптоз
The effect of melatonin on the proliferation (Ki-67+) and apoptosis (Caspasa-3+) of spleen cells of mice kept experimentally under natural photoperiod conditions and in the absence of photoperiod (with constant darkening) was studied. Our studies have shown that the processes of apoptosis and proliferation are photo dependent: stimulation of proliferation and apoptosis of lymphocytes by melatonin is possible with a natural photoperiod. The introduction of melatonin in the absence of a photoperiod, on the contrary, reduces apoptosis and proliferation of lymphocytes and cells of the spleen stroma both in the red and in the white pulp, which is a manifestation of the adaptogenic effect of melatonin.
Keywords: spleen, melatonin, photoperiod, proliferation, apoptosis
Для цитирования: Лузикова Е. М., Оганесян Л. В., Ефремова О. А., Московский А. В., Сумбаев Д. О., Абузаров А. Р., Сергеева В. Е. ВЛИЯНИЕ ФОТОПЕРИОДА И ЭКЗОГЕННОГО МЕЛАТОНИНА НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ И АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ СЕЛЕЗЕНКИ. Медицинский вестник Северного Кавказа. 2022;17(1):64-67. DOI - https://doi.org/10.14300/mnnc.2022.17017
For citation: Luzikova E. M., Oganesian L. V., Efremova O. A., Moskovskii A. V., Sumbaev D. O., Abuzarov A. R., Sergeeva V. E. THE EFFECT OF PHOTOPERIOD AND EXOGENOUS MELATONIN ON PROLIFERATION AND APOPTOSIS OF SPLEEN LYMPHOCYTES. Medical News of North Caucasus. 2022;17(1):64-67. DOI - https://doi.org/10.14300/mnnc.2022.17017 (In Russ.)
БП - белая пульпа КП - красная пульпа
Биологические процессы идут с разной степенью интенсивности днем и ночью, при этом свет является важнейшим синхронизирующим и адаптирующим внутреннее время «биологических часов» с внешними воздействиями фактором [1]. Основным посредником этих процессов в организме считается гормон мелатонин [2].
Ритмичность синтеза мелатонина шишковидной железой объясняет его хронобиологическое действие на организм, включая эндокринные и неэндокринные ритмы. Другие функции мелатонина, включая его антиоксидантные и противовоспалительные
Ю-67 - ядерный белок, представляющий основную часть ядерного матрикса и экспрессируемый на всем протяжении митотического цикла, кроме G0-периода
свойства, его геномное действие и его способность модулировать митохондриальный гомеостаз связаны с окислительно-восстановительным статусом клеток и тканей [3, 4].
Нарушение циркадных ритмов влияет на развитие опухолей: мужчины, трудящиеся в ночные смены, чаще остальных становятся подвержены риску развития рака предстательной железы [5, 6], женщины -рака молочной железы [7, 8], что может быть связано с изменениями в специфическом звене антибластом-ной резистентности, поскольку показаны отличия в воздействии мелатонина на показатели клеточного
МЕДИЦИНСКИМ ВЕСТНИК СЕВЕРНОГО КАВКАЗА
2022. Т. 17. № 1
MEDICAL NEWS OF NORTH CAUCASUS
2022. Vol. 17. Iss. 1
иммунитета при нормальном и непрерывном освещении [9-11]. Известно, что мелатонин подавляет Fas-опосредованную активацию каспазы-3 в лимфоцитах [12, 13] и стимулирует их возвращение в митотиче-ский цикл. Однако в изученной нами литературе мало исследований, посвященных влиянию сдвига фотопериода в темновую часть на иммунные органы.
Цель исследования - изучить влияние экзогенного мелатонина на пролиферацию и апоптоз клеток селезёнки мышей, содержавшихся в разных условиях освещения.
Материал и методы. Работа выполнена на нелинейных лабораторных мышах (п=60) в возрасте трех недель и массой 8-9 г. Животные были разделены на 4 группы по 20 особей (табл.), содержащихся в разных условиях освещения с питьевым режимом, в состав которого входил (4 мг/л) либо не входил мелатонин.
Таблица
Условия проведения эксперимента
Естественные Условия
условия освещения затемнения
Показатель Группы экспериментальных мышей
I II III IV
Длительность, 28 28 28 28
сутки
Количество 20 20 20 20
животных
Продолжительность светового 8-9 8-9 - -
дня, ч
Освещенность 50-150 50-150
утром, лк
Освещенность до 500 до 500
пасмурным днем, лк 0-0,5 0-0,5
Освещенность до 1000 до 1000
ясным днем, лк
Освещенность 100-200 100-200
вечером,лк
Концентрация мелатонина 0 4 0 4
в воде, мг/л
ный метод («Dako», LSAB+Kit,HRP, Дания), в качестве красящего соединения применяли раствор диами-нобензидина («Dako», Liguid DAB+, Дания), докраска ядер осуществлялось гематоксилином. Подсчет клеток был произведен с использованием программы SigmaScan Pro5 (США) и микроскопа Carl Zeiss Axio Scope A1 (Германия) при увеличении 400. Выводы о содержании вещества в клетках делались путем измерения его оптической плотности в 100 клетках по каждому животному с помощью программы SigmaScan Pro5. Статистическая обработка производилась с использованием программы Statists 17 (США).
Результаты и обсуждение. Установлено, что Ki-67-позитивные клетки - активно пролиферирующие клетки, в селезёнке контрольных животных I группы располагаются в красной и белой пульпе. В лимфоид-ных узелках селезёнки эти клетки встречаются единично. В КП процессы пролиферации идут активнее, что характеризует миелопоэз у мышевидных грызунов.
В условиях естественного фотопериода мелатонин увеличивает количество митотически делящихся (Ki-67-позитивных) клеток в КП в 5,2 раза (II группа) (p<0,001) (рис. 1). Затемнение в течение 4 недель также увеличивает интенсивность пролиферации клеток стромы КП в 3,6 раза (III группа) (p<0,0001). Вероятно, во II группе наблюдается синергизм действия экзогенного и эндогенного мелатонина (вырабатываемого в ночное время) [2, 4], поэтому пролиферирующих клеток больше в 1,5 раза, чем в III группе. Вместе с тем мелатонин, введенный животным, находившимся в условиях отсутствия фотопериода в течение 4 недель (IV группа), снижает количество пролиферирующих клеток в 8,4 раза по отношению к данным, полученным во II группе (p<0,005).
1600 1400 1200 1000
Селезенка у животных извлекалась после удушающего действия диоксида углерода на 28-е сутки эксперимента во второй половине дня (15:00-17:00) и фиксировалась в 10 % формалине с последующей заливкой в парафин для общегистологических и иммунологических методов исследования. Для демаскировки антигенов: предметные стекла помещали в емкость с буферными растворами рН 6,0 или рН 9,0 (ЭДТА) на 20-25 минут при температуре 95 °С. Емкости со стеклами охлаждали в течение 20 минут до комнатной температуры, промывали дистиллированной водой в 2 смены по 5 минут. Срезы обрабатывали 3 % раствором перекиси водорода в течение 30 минут, промывали дистиллированной водой - 2 смены по 5 минут.
Для выявления клеток, находящихся в фазе исполнения апоптоза, срезы толщиной до 5 мкм подвергали иммуногистохимическому окрашиванию по стандартной методике с моноклональными антителами к каспазе-3 («Novocastra», разведение 1:100). Для иммуногистохимического выявления ядерного белка пролиферирующих клеток использовали непрямой метод связывания моноклональных антител мышей с антигеном Ю-67 ^^-Ю67-ММ1, 1:200, Novocastra). Для визуализации продуктов иммунной реакции использовали стрептавидин-биотиновый пероксидаз-
А —
3+ //Л
III
Ki67+
Б —
Рис. 1. Влияние фотопериода и мелатонина на Ki-67-позитивные и каспаза-3-позитивные клетки красной (А) и белой (Б) пульпы селезенки мышей разных экспериментальных групп: I - группа в условиях
естественного фотопериода; II - группа в условиях естественного фотопериода с введением мелатонина; III - группа в условиях затемнения; IV - группа в условиях затемнения с введением мелатонина
400
V
3+
150
III
IV
3+ Wi
3+
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальная медицина
original research
■ Experimental medicine
В БП селезенки наблюдается аналогичная тенденция: количество Ki-67-позитивных клеток увеличивается в ответ на 4-недельное содержание в темноте (в 2,7 раза) (p<0,001), в ответ на ежедневное введение мелатонина в условиях естественного фотопериода (в 5,2 раза) (p<0,001) и снижается в ответ на ежедневное введение мелатонина животным, содержавшимся в темноте (в 6 раз) (p<0,001).
В результате проведенных исследований было установлено, что индексы пролиферативной активности как в КП (65±8,3 %), так и в БП (45±5,6 %; p<0,001) селезенки мышей, содержавшихся в естественных условиях освещения, достаточно высоки, что объясняется активными процессами миелопоэза и лимфо-поэза в селезенке мышей. В условиях отсутствия фотопериода индекс пролиферативной активности не претерпевает значимых изменений в КП (63±6,7 %; p<0,0001), но резко снижается в БП (8±3 %; p<0,0001).
Мелатонин, вводимый в естественных условиях освещения, приводит к увеличению индекса пролиферативной активности в КП (76±11 %; p<0,o0l), а при отсутствии фотопериода пролиферация мела-тонином снижается и в КП, и в БП (59±8 %; p<0,001, 5±1,5 %; p<0,001 соответственно).
Иммуноцитохимическая реакция на caspase-3 (L-18) проведена для выявления цитоплазматическо-го белка, играющего важную роль в дифференциров-ке тканей, регенерации и развитии нервной системы. Каспаза-3 наиболее часто активируется при апопто-зе, что позволяет использовать этот фермент как индикатор запрограммированной клеточной гибели.
В селезенке контрольных животных каспаза-3-позитивные клетки встречаются единично, однако отсутствие фотопериода вызывает увеличение количества этих клеток в 8 раз (p<0,001). Мелатонин, введенный в таких условиях, оказал протективное действие, снизив количество исследуемых клеток в 2 раза, в то время как его добавление в условиях естественной смены дня и ночи привело к увеличению количества каспаза-3-позитивных клеток в 5 раз (p<0,0001) (рис. 2).
Наиболее существенные изменения наблюдались в БП селезенки, где введение мелатонина в условиях
Рис. 2. Влияние экзогенного мелатонина на Ki-67- и каспаза-3-позитивные клетки КП (а) и БП (б) селезенки мышей разных экспериментальных групп (I - IV). Ув. х400
естественного фотопериода приводит к увеличению количества каспаза-3-позитивных клеток в 25 раз (p<0,005). Введение мелатонина в отсутствие фотопериода не приводит к значимым изменениям количества каспаза-3-позитивных клеток, что коррелирует со снижением количества Ki-67-позитивных клеток (рис. 2).
Исходя из того, что мелатонин подавляет Fas-опосредованную активацию каспазы-3 в лимфоцитах [12, 13] и стимулирует их возвращение в митотиче-ский цикл, мы предполагали получить обратные корреляционные связи между количеством каспаза-3- и Ki-67-позитивных клеток в экспериментальных группах животных, получавших мелатонин. Однако нами выявлены сильные прямые корреляционные связи между количеством каспаза-3- и Ki-67-позитивных клеток селезенки во II и IV экспериментальных группах. Это можно объяснить созависимостью процессов апоптоза и пролиферации. Установлено, что апоптотические клетки в определенных условиях могут продуцировать и секретировать митогенные сигналы, а усиление скученности клеток на единицу площади индуцирует апоптотическую гибель клеток [14, 15].
Во II и III экспериментальных группах животных определено увеличение количества Ki-67-позитивных клеток по сравнению с I контрольной группой. Если активация пролиферации лимфоцитов и стромаль-ных клеток во II экспериментальной группе объясняется влиянием экзогенного и эндогенного мелатони-нов, то аналогичная стимуляция, наблюдаемая в III группе, объясняется более длительным действием эндогенного мелатонина [2, 4]. Литературные данные об ингибирующем действии световой депривации на канцерогенез [16], вероятно, объясняются усиленным синтезом мелатонина и соотносятся с данными о способности мелатонина подавлять клеточную пролиферацию [17].
Неожиданные результаты мы получили в IV экспериментальной группе, где животные содержались в темноте и получали мелатонин: активность процессов пролиферации снижалась как в красной, так и в БП. Параллельно мы наблюдали снижение интенсивности апоптоза в лимфоидных узелках и строме селезенки путем снижения экспрессии каспазы-3. Известно, что мелатонин модулирует пролиферацию посредством активации апоптоза и вовлечения важнейших, включая каспазазависимых, регуляторов клеточного цикла [13]. В нашем эксперименте темновые условия в течение 4 недель приводят к усилению экспрессии каспаза-3, но экзогенный ме-латонин, введенный в темновых условиях, подавляет экспрессию каспазы-3, вероятно, посредством стимуляции экспрессии рецепторов мелатонина и/или механизмов без их вовлечения [18, 19].
Заключение. Исследования показали, что процессы апоптоза и пролиферации являются фотозависимыми - стимуляция пролиферации и апоптоза лимфоцитов мелатонином возможна при естественном фотопериоде. Введение мелатонина при отсутствии фотопериода, напротив, снижает апоптоз и пролиферацию лимфоцитов и клеток стромы селезенки как в красной, так и в белой пульпе, что является проявлением адаптогенного действия мелатонина.
МЕДИЦИНСКИЙ ВЕСТНИК СЕВЕРНОГО КАВКАЗА
2022. Т. 17. № 1
MEDiCAL NEWS OF NORTH CAUCASUS
2022. Vol. 17. Iss. 1
Информированное согласие. При проведении экспериментов соблюдались требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского Сообщества (89/609/ЕЕС) об использовании животных для экспериментальных исследований, при наличии
Литература/References
1. Duffy J. F., Wright K. P. Jr. Entrainment of the human cir-cadian system by light. J. Biol. Rhythms. 2005;20(4):326-338. https://doi.org/10.1177/0748730405277983
2. Reiter R. J., Rosales-Corral S., Sharma R. Circadian disruption, melatonin rhythm perturbations and their contributions to chaotic physiology. Adv. Med. Sci. 2020;65(2):394-402. https://doi.org/10.1016/j.advms.2020.07.001
3. Arushanyan E., Shchetinin E. Pineal hormone melatonin as universal modulator of any pathological processes. Medical News of North Caucasus. 2014;9(2):187-198. https://doi.org/10.14300/mnnc.2014.09054
4. Reiter R. J., Tan D. X., Galano A. Melatonin: exceeding expectations. Physiology. 2014;29(5):325-333. https://doi.org/10.1152/physiol.00011.2014
5. Mancio J., Leal C., Ferreira M., Norton P., Lunet N. Does the association of prostate cancer with night-shift work differ according to rotating vs. fixed schedule? A systematic review and meta-analysis. Prostate Cancer Prostatic Dis. 2018;21(3):337-344.
https://doi.org/10.1038/s41391-018-0040-2
6. Barul C., Richard H., Parent M. E. Night-Shift Work and Risk of Prostate Cancer: Results From a Canadian Case-Control Study, the Prostate Cancer and Environment Study. Am. J. Epidemiol. 2019;188(10):1801-1811. https://doi.org/10.1093/aje/kwz167
7. Copertaro A., Bracci M. Working against the biological clock: a review for the Occupational Physician. Ind. Health. 2019;57(5):557-569.
https://doi.org/10.2486/indhealth.2018-0173
8. Pham T. T., Lee E. S., Kong S. Y., Kim J., Kim S. Y. [et al.]. Night-shift work, circadian and melatonin pathway related genes and their interaction on breast cancer risk: evidence from a case-control study in Korean women. Sci. Rep. 2019;9(1):10982.
https://doi.org/10.1038/s41598-019-47480-2
9. Litvinenko G. I., Shurlygina A. V., Gritsyk O. B., Mel'niko-va E. V., Tenditnik M. V. [et al.] Effects of Melatonin on Morphological and Functional Parameters of the Pineal Gland and Organs of Immune System in Rats During Natural Light Cycle and Constant Illumination. Bull. Exp. Biol. Med. 2015;159(1):62-65. https://doi.org/10.1007/s10517-015-3061-z
10. Markus R. P., Sousa K. S., da Silveira Cruz-Machado S., Fernandes P. A., Ferreira Z. S. Possible Role of Pineal and Extra-Pineal Melatonin in Surveillance, Immunity, and First-Line Defense. Int. J. Mol. Sci. 2021;22(22):12143. https://doi.org/10.3390/ijms222212143
11. Singh A., Singh R., Tripathi M. K. Photoperiodic manipulation modulates the innate and cell mediated immune functions in the fresh water snake, Natrix piscator. Sci. Rep. 2020;10(1):14722.
https://doi.org/10.1038/s41598-020-71777-2
положительного заключения этического комитета ФГБОУ ВО «Чувашский государственный университет им. И. Н. Ульянова» от 01.03.2013.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
12. Sánchez-Bretaño A., Baba K., Janjua U., Piano I., Gar-gini C., Tosini G. Melatonin partially protects 661W cells from H(2)O(2)-induced death by inhibiting Fas/FasL-caspase-3. Mol. Vis. 2017;23:844-852.
13. Sharma S., Sarkar J., Haldar C., Sinha S. Melatonin Reverses Fas, E2F-1 and Endoplasmic Reticulum Stress Mediated Apoptosis and Dysregulation of Autophagy Induced by the Herbicide Atrazine in Murine Splenocytes. PLoS One. 2014;9(9):e108602. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0108602
14. Sun Y., Liu W. Z., Liu T., Feng X., Yang N., Zhou H. F. Signaling pathway of MAPK/ERK in cell proliferation, differentiation, migration, senescence and apoptosis. J. Recept. Signal Transduct. Res. 2015;35(6):600-604. https://doi.org/10.3109/10799893.2015.1030412
15. Маркова Е. В., Савкин И. В., Аникеева О. С., Козлов В. А. Пролиферация и апоптоз лимфоцитов у экспериментальных животных после многократной трансплантации клеток иммунной системы, проведенной в ювенильный период развития. Бюллетень сибирской медицины. 2019;18(2):119-126. [Markova E. V., Anikee-va O. S., Savkin I. V., Kozlov V. A. Proliferation and apop-tosis of experimental animal's lymphocytes after multiple transplantation of immune cells from opposite behavioral types of donors carried out in the juvenile period. Bul-leten Sibirskoj Medicini. - Bulletin of Siberian Medicine. 2019;18(2):119-126. (In Russ.)]. https://doi.org/10.20538/1682-0363-2019-2-119-126
16. Giudice A., Crispo A., Grimaldi M., Polo A., Bimonte S. [et al.]. The Effect of Light Exposure at Night (LAN) on Carcinogenesis via Decreased Nocturnal Melatonin Synthesis. Molecules. 2018;23(6):1308. https://doi.org/10.3390/molecules23061308
17. Champney T. H., Prado J., Youngblood T., Appel K., Mc-Murray D. N. Immune responsiveness of splenocytes after chronic daily melatonin administration in male Syrian hamsters. Immunol. Lett. 1997;58(2):95-100. https://doi.org/10.1016/s0165-2478(97)00039-4
18. Ahmad R., Haldar C. Photoperiodic regulation of MT1 and MT2 melatonin receptor expression in spleen and thymus of a tropical rodent Funambulus pennanti during reproductively active and inactive phases. Chronobiol. Int. 2010;27(3):446-462.
https://doi.org/10.3109/07420521003666408
19. Estaras M., Peña F. J., Tapia J. A., Fernandez-Bermejo M., Mateos J. M. [et al.]. Melatonin modulates proliferation of pancreatic stellate cells through caspase-3 activation and changes in cyclin A and D expression. J. Physiol. Biochem. 2020;76(2):345-355. https://doi.org/10.1007/s13105-020-00740-6
Поступила 01.12.2020
Сведения об авторах:
Лузикова Елена Михайловна, кандидат биологических наук, доцент кафедры общей и клинической морфологии и судебной медицины; тел.: 892785307704; e-mail: nema76@mail.ru
Оганесян Леон Вазгенович, студент;
тел.: 89530157841; e-mail: oganesovan@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-5331-3412
Ефремова Ольга Александровна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры; тел.: 89373739113; e-mail: oefremova13@rambler.ru
Московский Александр Владимирович, доктор медицинских наук, профессор кафедры ортопедической стоматологии и ортодонтии; тел.: 89093026795; e-mail: moskov_av@mail.ru
Сумбаев Дмитрий Олегович, студент; тел.: 89379538665; e-mail: dem0n21n4k@gmail.com
Абузаров Айрат Рафаилович, студент; тел.: 89274313697; e-mail: abuzarov.airat@mail.ru
Сергеева Валентина Ефремовна, доктор биологических наук, профессор кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии; тел.: 89093016259; e-mail: valentina-sergeeva@yandex.ru
