CC BY
20
3. Хоман, Элизабет Джейн. Техническое руководство по производству молока: доение и период лактации / Элизабет Джейн Хоман, Ваттио Мишел; Междунар. ин-т по исслед. и развитию молочного животноводства им. Бабкока. - 1996. - 113 с.
4. Blowey, R.W. (Roger William). Mastitis control in dairy herds I R. Blowey, P. Edmondson. - 2nd ed, p. cm., 2010. - P. 266.
5. Diseases of the teats and udder I L.W. George [et al.] I In Rebhun's Diseases of dairy cattle. Second edition I Thomas J. Divers, Simon F. Peek II Copyright © 2008, Elsevier Inc.
6. Staphylococcus aureus leucocidin, a virulence factor in bovine mastitis I A.Younis [et al.] II J. Dairy Research, 2005. - Vol. 72. - P. 188-194.
7. Isolation of L-form variants after antibiotic treatment in Staphylococcus aureus bovine mastitis I P.M. Sears [et al.] II J Amer Vet Med Assoc 1987. - Vol. 191. - P. 681-684.
8. Гейдрих, Г. Маститы сельскохозяйственных животных и борьба с ними I Г. Гейдрих, В. Ренк. - М.: Колос, 1968. - 376 с.
УДК 636:612.015.31
ВЛИЯНИЕ ФИТОЛЕКТИНОВ НА КИШЕЧНЫЙ ТРАНСПОРТ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ В УСЛОВИЯХ IN VITRO
Ю.К. КОВАЛЕНОК УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» г. Витебск, Республика Беларусь, 210026
(Поступила в редакцию 18.04.2013)
Введение. Работой многих исследователей показано [5, 6], что корма растительного происхождения, используемые в животноводстве, содержат природные компоненты, не выполняющие в организме никаких продуктивных функций и препятствующие оптимальному обмену веществ, способные привести к развитию различных болезней, главным образом обменного типа, уровень которых в современном скотоводстве неуклонно растет [1, 2, 4]. Такие компоненты корма называются антипитательными веществами [5]. Более того, многие из них способны избирательно снижать усвоение отдельных компонентов рациона без выраженного проявления общей токсичности и развития клинически выраженных расстройств, существенно снижая рентабельность отрасли.
К настоящему времени сформирован определенный научный задел [3, 5, б] в части формирования представлений о классификации и следовых эффектах высоких доз антипитательных веществ в растительных кормах, используемых для животных.
Большой интерес современных ученых из стран Европейского союза, из США, Японии и др. привлекает особая группа белков - лекти-нов. Эти белки, не относящиеся к классу иммунных, способны к обратимому связыванию с углеводной частью гликоконьъюгатов без нарушения ковалентной структуры гликозильных лигандов.
Уместно также отметить и тот факт, что работ, указывающих на возможную этиологическую роль лектинов в возникновении болезней сравнительно не много, они главным образом сопряжены с медицинскими исследованиями и в основном зарубежного типа [8, 15, 16].
Что же касается ветеринарии, то в доступных нам источниках информации возможная причинная роль соединений данного класса в возникновении болезней животных представлена весьма ограничено. Так, известно о летальной роли в основном рицина, который при скармливании вызывает у животных дегенеративные изменения во внутренних органах [15, 16]. Также японскими учеными сообщалось о том, что лектины бобовых вызывают возникновение железодефицит-ной анемии [15].
Цель работы - принимая во внимание наличие коррелятивных зависимостей (r=0,5-0,8) между активностью лектинов в кормах и широтой распространения микроэлементозов крупного рогатого скота, изучить влияние соединения данного класса на всасывание минеральных веществ кишкой животных в условиях модельного эксперимента.
Материал и методика исследований. Исследования, положенные в основу настоящей работы, выполнены в УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» при техническом сотрудничестве РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по земледелию» (Республика Беларусь).
Методологию работы определили подходы системного анализа, сравнений и аналогий, обобщений, натурного наблюдения, экспертных оценок и др.
Для реализации цели посредством разработанного нами [6] устройства в условиях in vitro изучалась всасываемость минеральных веществ кишкой крупного рогатого скота. В опытах были задействованы фрагменты тощей кишки бычков, которые инкубировались в солевых растворах Си, Zn, Co и Fe. В данные растворы вносился меченый перок-сидазой хрена лектин кукурузы в концентрации 50 мг/л - 2-я и 3-я группы, также в состав 3-й группы проб дополнительно к названным компонентам вводился N-ацетил-Э-глюкозоамин в концентрации 10 мг/л. Согласно литературным данным [13], именно к N-ацетил-Б-глюкозоамину проявляет высокую специфичность лектин кукурузы, связывая данное соединение в своих активных центрах, соответственно ослабляет или, при достаточном количестве, теряет свою активность. Лектин кукурузы получали из молодых проростков кукурузы методом аффинной хроматографии по протоколу [13].
Более того, опыты данного кластера исследований позволили судить о количественных характеристиках транспортных способностей кишечной стенки крупного рогатого скота для микроэлементов при наличии определенной концентрации в инкубационном растворе фи-толектинов и сахаров.
Биометрический анализ данных выполнен с помощью статистических пакетов SAS 9.2, STATISTICA 9 и SPSS-19.
Результаты исследований и их обсуждение. Анализируя характер изменений, произошедших в исследуемых субстратах после экспозиции устройства (таблица), можно отметить ничтожно малую (0,51,3 %) степень сквозного движения испытуемых веществ из мукозного в серозный раствор.
Показатели кишечного транспорта некоторых микроэлементов (мг/кг) в присутствии лектинов кукурузы и \-ацс I и. |-1)-|. поко юамина (М±ш, Р, п=36)
Исследуемый субстрат Группа проб
1 | 2 | 3
Опыт № 1 (испытуемое вещество - меди сульфат)
КР 4,94±0,418 5,07±0,624 5,15±0,507
СР 0,039±0,0042 0,012±0,00137 0,028±0,0025
МР 3,26±0,359 4,42±0,396* 3,90±0,484*
КК 4,17±0,343 4,23±0,413 4,40±0,450
ОК 11,6±1,47 7,74±0,984** 10,3±0,941
Опыт № 2 (испытуемое вещество - цинка сулы >ат)
КР 56,8±7,13 58,2±5,06 60,1±7,02
СР 0,49±0,057 0,26±0,025* 0,40±0,040
МР 38,1±3,71 49,8±4,11** 47,5±5,16**
КК 22,3±2,93 23,0±2,92 23,6±3,01
ОК 82,1±10,94 51,3±5,21*** 66,8±8,22**
Опыт № 3 (испытуемое вещество - кобальта сульфат)
КР 0,093±0,0088 0,095±0,0091 0,098±0,0125
СР 0,0088±0,00101 0,0049±0,00052* 0,0067±0,00083*
МР 0,078±0,0096 0,092±0,0081* 0,091±0,009*
КК 0,0176±0,00161 0,0182±0,00235 0,0184±0,00245
ОК 0,0387±0,00331 0,024±0,00225** 0,0339±0,00354
Опыт № 4 (испытуемое вещество - железа лактат)
КР 196±22,5 198±22,4 208±26,0
СР 0,179±0,0227 0,168±0,0148 0,189±0,0248
МР 142±12,7 176±18,6* 181±21,9*
КК 24,4±3,23 24,9±2,32 25,7±2,37
ОК 67,7±5,77 60,8±7,76 67,3±7,31
Примечание: 1. Группа проб: 1-я (контроль) - 0,9%-ный №0 + соответствующий микроэлемент; 2-я - тоже, что и в 1-й + лектин кукурузы; 3-я - тоже, что и во 2-й + ^ацетил^-глюкозоамин.
2. КР - контрольный раствор (исходный испытуемый раствор препарата); СР - серозный раствор (раствор со стороны серозной оболочки после экспозиции устройства); МР - мукозный раствор (раствор со стороны слизистой оболочки после экспозиции устройства); КК - контрольная кишка (участок тощей кишки в начале проведения исследований), ОК - опытная кишка (участок тощей после его инкубации).
3. Р<0,05; Р<0,01; Р<0,001 - результаты проверки гипотезы о равенстве межгрупповых средних в сравнении с соответствующими значениями 1 -й группы посредством оценки значения параметрического F-критерия Фишера и непараметрических критериев Ван дер Вардена, Краскала-Валлиса и медианного критерия.
Данную закономерность мы отмечали в ходе изучения функциональной работоспособности устройства. В обычных условиях при физиологичном кишечном кровоснабжении всасываемые вещества непосредственно поступают в кровь и лимфу сети капилляров, располагающейся под кишечным эпителием. Резонно полагать, что отсутствие крово- и лимфотока на пути транспортируемых веществ приводит к кумуляции в кишечной стенке (гипотетически в мышечной или серозной оболочке) при его транспорте через нее.
Что же касается результатов исследования концентрации испытуемых элементов в мукозном растворе и кишечной стенке после ее инку-
бации, то получены выраженные межгрупповые различия. Так, данные таблицы демонстрируют, что в опыте № 1 включение в инкубационную смесь лектина (2-я группа) статистически значимо (Р<0,05) на 35,5 % снизило убыль меди из мукозного раствора (в сравнении с 1-й группой), что логически сопоставимо с более низким (Р<0,01) по сравнению с контролем итоговым уровнем элемента в кишечной стенке. Показательны также и значения, полученные в 3-й группе - дополнительное включение в инкубационную смесь М-ацетил-Б-глюкозоамина, являющегося специфическим углеводом, связывающимся лектином кукурузы, привело к тому, что отмечавшиеся закономерности нарушения кишечного транспорта во 2-й группе, несколько нивелировались. Уровень убыли меди из мукозного раствора хотя и был на 19,6 % ниже (Р<0,05) такового в контроле, однако на 11,7 % был большим, нежели во 2-й группе, что отразилось на итоговом содержании (95 % ДИ от 8,46 до 12,1 мг/кг) обсуждаемого элемента в кишечной стенке. Данное обстоятельство, на наш взгляд, указывает на причинную роль лектина в нарушении всасывания меди и некоторое изменение данных этиотроп-ных микроэлементозам предпосылок при предварительной инкубации лектина с углеводом, специфичным для используемого лектина.
В серии исследований № 2, где в качестве испытуемого вещества выступал сульфат цинка, логистика констатированных изменений сходна с описанной выше, однако количественные выражения, указывающие на нарушения трансэпителиального транспорта цинка, несколько иные.
Так, внесение в инкубационный раствор специфического лектину углевода не оказало статистически значимого влияния на убыль обсуждаемого элемента из мукозного раствора, который во 2-й и 3 -й группах варьировал в диапазоне 47,5-49,8 мг/кг и в среднем на 27,6 % был ниже (Р<0,01) такового значения в контроле. Вместе с тем необходимо отметить, что итоговый уровень цинка в кишечной стенке после ее инкубации имел статистически значимые (Р<0,01; Р<0,001) различия у опытных групп как по отношению к контролю (в среднем 28 %), так и между группами проб 2, 3.
При изучении кишечного транспорта кобальта (в составе сульфата данного элемента) нами отмечено, что на его транспорт наличие в модели эксперимента лектина оказывает весьма незначительное влияние. Так, присутствие в модели белков обсуждаемого типа уменьшает уровень Со в мукозном растворе в среднем на 17,3 %, что в сравнении с предыдущими испытуемыми элементами ниже примерно на 10,318 %. Вместе с тем внесение М-ацетил-Б-глюкозоамина в инкубационную смесь (3-я группа) практически восстанавливает поглощение кобальта кишечной стенкой до контрольного уровня, в то время как в 2-й группе уровень кобальта на 37,9 % был ниже (Р<0,01) такового в контроле.
Данные таблицы показывают, что конечный уровень железа в кишке после ее инкубации по всем трем группам проб балансировал в диапазоне 60,8-67,7 мг/кг и при межгрупповом сравнении посредством
использования как параметрических, так и непараметрических методов исследования различий не установлено, что может являться свидетельством отсутствия значимого влияния лектинов на транспорт железа через стенку кишки.
Заключение. Анализируя полученные результаты биохимических исследований in vitro можно прийти к предположению о том, что лек-тины действуют на транспорт микроэлементов путем связывания функциональных сайтов трансмембранного транспорта элементов апикальной мембраны энтероцитов. Данное умозаключение созвучно известным литературным данным о негативном воздействии лектинов на кишечник [9], в частности о том, что лектин легко конъюгирует с гликокаликсом микроворсинок и вызывает структурные изменения кишки [14], оказывает ингибирующий эффект на пептидазную и диса-харидазную активность энтероцитов. Известно также, что негативное влияние лектинов нивелируется нагреванием [10] или добавлением соответствующего лектину сахара [12], последнее нами подтверждено экспериментально.
Исходя из известного научного факта, что лектины связывают сахара - вне зависимости от того, это свободный сахар или связанный (в случае экспериментов, проводившихся нами - входящий в состав гли-кокаликса энтероцитов) - допустим вывод о том, что связывание лек-тина с сахарами энетероцитов является обязательным условием нарушения транспорта, хотя это и справедливо не для всех микроэлементов - весьма незначительный эффект сахара имели на кобальт, что, видимо, объясняется специфическими функциями и механизмами всасываемости данного элемента в организме.
Таким образом, лектины кукурузы в условиях модельного эксперимента in vitro предположительно сорбируясь гликокаликсом энтероцитов избирательно снижают (Р<0,01; Р<0,001) всасываемость кишкой крупного рогатого скота Си (33,2 %), Zn (37,5 %), и Co (38 %), не оказывая значимого влияния на трансэпителиальный транспорт железа. Полученные результаты проведенных экспериментов позволяют предположить возможную этиологическую роль лектинов в возникновении гипомикроэлементозов у животных, хотя для убедительных доказательств эксперименты должны быть продолжены.
ЛИТЕРАТУРА
1. Коваленок, Ю.К. Микроэлементозы крупного рогатого скота и свиней в Республике Беларусь: монография / Ю.К. Коваленок. - Витебск: ВГАВМ, 2013. - 196 с.
2. Кучинский, М.П. Биоэлементы - фактор здоровья и продуктивности животных: монография / М.П. Кучинский. - Минск: Бизнесофсет, 2007. - 372 с.
3. Луцик, А.Д. Лектины: биологические свойства и применение в иммунологии / А.Д. Луцик // Биохимия человека и животных: - 1985. - Вып. 9. - С. 63-76.
4. Обмен микроэлементов и микроэлементозы животных: монография / А.П. Курдеко [и др.]. - Горки: БГСХА, 2009. - 139 с.
5. Пономаренко, Ю. А. Питательные и антипитательные вещества в кормах: монография / Ю.А. Пономаренко; М-во сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь. - Минск: Экоперспектива, 2007. - 948 с.
6. Устройство для изучения всасываемости веществ кишечником животных: пат. 111427 Российская Федерация. МПК A61D 99/00 / Ю.К. Коваленок, Г.Г. Щербаков, А.А. Груздков, Л.В. Громова, А.В. Богомольцев; заявитель Коваленок Юрий Казимирович (BY). - № 2011131486/13; заявл. 28.07.11; опубл. 20.12.2011 // Бюллетень. - № 35. - 2 с.
7. Bunzel, M. Chemical Characterization of Klason Lignin Preparations from Plant-Based Foods / M. Bunzel, A. SchuBler, G. Tchetseubu Saha // J Agric Food Chem. - 2011. -Dec 14; 59 (23). - P. 12506-12513.
8. Effects of denaturation and amino acid modification on fluorescence spectrum and he-magglutinating activity of Hericium erinaceum Lectin / M. Gong [et al.] // Acta Biochim Bio-phys Sin (Shanghai). - 2004. - Vol. 36. - №2. 5. - Р. 343-350.
9. Goldstein, I.J. Isolation, physicochemical characterization, and carbohydrate-binding specificity of lectins / I. J. Goldstein, R. D. Porez // The Lectins: Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine / I.E. Liener, N. Sharon, I.J. Goldstein. - Orlando: Academic Press, 1986. - Р. 33-243.
10. Higuchi, M. Growth inhibition and small intestinal lesions in rats after feeding with isolated winged bean lectin / M. Higuchi, I. Tsuchiya, K. Iwai // Agrie. Biol. Chem. - 1984. -Vol. 48. - № 3. - Р. 695-701.
11. Lectin-mediated drug delivery: influence of mucin on cytoadhesion of plant lectins in vitro / M. Wirth [et al.] // J. Control Release. - 2002. - Vol. 79. - P. 183-191.
12. Lorenzsonn, V. In vivo responses of rat intestinal epithelium to intraluminal dietary lectins / V. Lorenzsonn, W. A. Olsen // Gastroenterology. - 1982. - Vol. 82. - Р. 838-848.
13. Maize-Glucosidase-aggregating Factor Is a Polyspecific Jacalin-related Chimeric Lec-tin, and Its Lectin Domain Is Responsible for -Glucosidase Aggregation / Farooqahmed S. Kittur [et al.] // Journal of biological chemistry. - 2007. - Vol. 282. - № 10. - Р. 72997311.
14. Oliveira, A.C. Lesions of intestinal epithelium by ingestion of bean lectins in rats / A.C. Oliveira, B.C. Vidal, V.C. Sgarbier // J. Nutr. Sci. Vitaminol. - 1989. - Vol. 35. - № 4. -Р. 315-322.
15. Soybean protein isolate and soybean lectin inhibit iron absorption in rats / Hisayasu Sanae [et al.] // J. Nutr. - 1992. - Vol. 122. - P. 1190-1196.
16. The interaction between plant lectins and the small intestinal epithelium: a primary cause of intestinal disturbance / M. J. Kik [et al.] // Vet Q. - 1989. - Apr. 11 (2). - P. 108-115.
УДК 619:616.391
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФИТОЛЕКТИНОВ С МЕМБРАНАМИ ЭНТЕРОЦИТОВ ТОЩЕЙ КИШКИ КАК ЭТИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКТОР ГИПОМИКРОЭЛЕМЕНТОЗОВ
Ю.К. КОВАЛЕНОК УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» г. Витебск, Республика Беларусь, 210026
(Поступила в редакцию 18.04.2013)
Введение. Для успешного решения актуальных вопросов производства животноводческой продукции необходимы глубокие исследования в области биохимии и, в частности, молекулярной биологии. Прогресс и достижения в этой области науки тесно связаны с развитием новых методов исследований [1-3]. Одним из них является изучение особого класса белков - лектинов. Эти белки являются одним из эволюционно выработанных растениями защитных факторов, позволяющих растительному организму противостоять различного рода не-
