CC BY
54
2005 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. Сеп.З. Вып. 2
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.1
Н. А. Кирчихина, А. А. Князева^ В. В. Емельянов, Т. В. Чиркова
ВЛИЯНИЕ ФИТОГОРМОНОВ НА ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В ПРОРОСТКАХ ПШЕНИЦЫ И РИСА В ПОСТ-АНОКСИЧЕСКИЙ ПЕРИОД.
Устойчивость растений к недостатку или полному отсутствию кислорода (гипоксии и аноксии соответственно) определяется не только способностью выживать при данных неблагоприятных воздействиях, но и возможностью быстрого восстановления обмена при возвращении в условия нормальной аэрации (в пост-аноксический период), когда растения могут подвергнуться опасности дополнительного повреждения. Эти нарушения связаны с образованием активных форм кислорода. В нормальных условиях существования растений образование активных форм кислорода - обычный метаболический процесс. Патологиче-' ские последствия возникают лишь при их чрезмерном накоплении, что характерно для раз-1 личных стрессовых воздействий. Для противостояния повреждающему действию свободных радикалов все аэробные организмы используют комплекс антиоксидантной защитной системы, который включает как низкомолекулярные компоненты (аскорбиновая кислота, глутатион, токоферол, каротиноиды), так и ферментативные (супероксиддисмутаза, катала-за, пероксидазы). ' ,
Однако в условиях стресса эти защитные механизмы не могут в полной мере обеспечивать обезвреживание АФК, что ведет к их накоплению особенно у неустойчивых растений. Активные радикалы способны взаимодействовать со многими типами макромолекул -с нуклеиновыми кислотами, белками. Особенно сильно активируются при возобновлении доступа кислорода процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), ведущие к деградации жирных кислот мембранных фосфолипидов. Следствием этого является нарушение целостности клеточных мембран и увеличение их проницаемости. Установлено, что чувствитель- ч ные к кислородному дефициту растения отличаются меньшей стабильностью мембран, чем устойчивые к данному воздействию растения. Поэтому процессы, отражающие структурную целостность и функциональную активность мембран, рассматриваются в качестве одного из критериев устойчивости растений [7].'О стабильности мембран можно судить по интенсивности выхода электролитов из растительных тканей, а также по накоплению продуктов распада жирнокислотных компонентов липидов мембран, например, диеновых и триеновых конъюгатов жирных кислот как промежуточных продуктов распада и малонового диальдегида (МДА) как одного из конечных продуктов ПОЛ [8]. ,
Как. известно, важную роль в регуляции приспособления растений к неблагоприятным воздействиям играют гормоны. Имеющиеся в литературе сведения, указывают на то, что обработка растений некоторыми фитогормонами, в первую очередь абсцизовой (АБК) и индолилуксусной кислотами (ИУК) повышала устойчивость к ряду неблагоприятных воздействий [15]. Относительно же роли гормонов в регуляции адаптации растений к недостатку кислорода и последующей реаэрации данные литературы единичны. Поэтому цель
© Н. А. Кирчихина, А. А. Князева, В. В. Емельянов, Т. В. Чиркова, 2005
данной работы состояла в выявлении действия ряда фитогормонов (абсцизовая, индолил-уксусная и салициловая кислоты, кинетин, гибберелловая кислота и' метилжасмонат) на способность растений адаптироваться к окислительному стрессу в пост-аноксический период. В частности был исследован эффект обработки проростков пшеницы и риса несколькими фитогормонами на процесс перекисного окисления липидов.
Материалы и методы исследования. В качестве объектов исследования использовали 7-дневные проростки пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Ленинградка и 10-дневные проростки риса (Oryza sativa L.) сорта Лиман, различающиеся по устойчивости к недостатку кислорода. Растения выращивали на 0,2 моль/л модифицированном растворе Кнопа при нормальной аэрации, освещении 80 Вт/м2 и температуре 20-22 °С. Перед проращиванием семена поверхностно стерилизовали 5%-ным раствором NaCIO в течение 10 мин, после чего промывали дистиллированной водой.
Часть растений использовали для анализа в качестве исходного Материала, а оставшуюся -разделяли на опытные и контрольные варианты. Перед постановкой в экспериментальные условия корни растений для стерилизации 5 мин выдерживали в 0,01%-ном растворе NaCIO, после чего растения несколько раз промывали дистиллированной водой. Корни растений опытных вариантов помещали в стаканы с питательным раствором, в который'добавляли растворы гормонов (конечная концентрация составляла 100 мкМ), и выдерживали в темноте при комнатной температуре. Через сутки корни предобработанных растений промывали дистиллированной водой и помещали в стаканы со свежеприготовленным питательным раствором. Часть предобработанных растений на протяжении всего экспериментального периода содержали в условиях нормальной аэрации, а оставшиеся растения подвергали анаэробному воздействию. Для создания анаэробных условий растения заключали в камеры объемом 3 л, через которые 1,5 ч пропускали газообразный азот (содержание кислорода < 0,01%; АОЗТ «Лентехгаз», С.-Петербург), затем камеры герметично закрывали и ставилй в темноту для предотвращения образования кислорода на свету. Экспозиция в атмосфере азота составляла 72 ч, после чёго следовал краткосрочный период реаэрации (5 мин). В качестве контроля служили растения, не обработанные фитогормонами и находящиеся i? условиях нормальной аэрации весь период опыта. Уровень перекисного окисления липидов в период пост-аноксии оценивался по содержанию ТБК-реактивных продуктов в пересчете на малоновы^ диальдегид по методу Рубина Б. А.. Мерзляка M. Н. [5] в нашей модификации. Навеску корней гомогенизировали с кварцевым песком и 10 мл охлажденной 0,1%-ой трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Пробу количественно переносили на воронку с фильтром и фильтровали в мерную пробирку. Объем фильтрата доводился 0,1%-ной ТХУ до 10 мл, из которых отбирали.4 мл и переносили в пробирки с 0,5 мл воды и 2,5 мл 0,5%-ной 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) приготовленной на 20%-ной ТХУ. Содержимое пробирок тщательно перемешивали и пробирки ставили на кипящую водяную баню на 30 мин. Затем пробы остужали, переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали 20 мин при 8000 оборотов в минуту. После центрифугирования проводили измерение оптической плотности супернатанта на СФ-46 при длине волны 532 нм. Содержание МДА рассчитывали, исходя из значения коэффициента микромолярной экстинкции (0,155 мкМ/см2), и выражали в мкМ на 1 г сырой массы.
Все опыты проводили в 3-8-кратной повторности. Для расчета и статистической обработки данных использовали программу MS Excel 97. При оценке достоверности различий использовали критерий Стьюдента при 5%-ном уровне значимости.
Результаты исследований и их обсуждение. На рисунке представлены данные о влиянии фитогормонов на содержание малонового диапьдегида в корнях проростков пшеницы и риса в условиях нормальной аэрации и в пост-анЬксический период.
Можно видеть, что уровень МДА в корнях необработанных гормонами проростков пшеницы и риса в условиях нормальной аэрации практически не отличается. Обработка растений абсцизовой и индолилуксусной Кислотами приводила к небольшому возрастанию уровня МДА в корнях проростков и пшеницы и риса, причем эффект АБК был сильнее у обоих растений. Возможно, такое действие этих гормонов на корни исследуемых нами растений при аэрации связано с их способностью стимулировать синтез этилена [4, 16, 17]. А этилен, как избестно, вызывает синтез липоксигеназы - фермента, участвующего в распаде липидов и генерации свободных радикалов.
Пшеница
2 с.
<
С=1 2
Аэрация
Аноксия + реаэрация
а б в г б е ж
а б в г д е ж
Влияние обработки фитогормонами на содержание МДА в корнях проростков пшеницы и риса в условиях аэрации и при реаэрации в пост-аноксический период.
а - необработанные растения, 6 - обработка АБК, в - обработка ИУК, г - обработка СК, д - обработка МЖ, е - обработка ГК, ж - обработка кинетином.
В корнях проростков пшеницы салициловая кислота (СК) и метилжасмонат (МЖ) несколько увеличивали содержания МДА, при экспозиции в воздушной среде, но их эффект был незначительным. В корнях же проростков риса действие МЖ было аналогичным действию СК на растения пшеницы, а эффекта СК не наблюдалось.
Не было обнаружено влияния обработки гибберелловой кислотой (ГК) и кинетином на продукцию МДА в корнях исследуемых растений при аэрации.
Под влиянием аноксии и последующей кратковременной реаэрации происходил рез-. кий рост уровня МДА в корнях проростков пшеницы (в 5 раз). В корнях же проростков риса аналогичное воздействие вызывало менее'интенсивное возрастание содержания МДА (в 1,7 раза), что можно объяснить лучшей способностью растений риса по сравнению с растениями пшеницы преодолевать последствия обоих воздействий - аноксии и окислительного стресса при возобновлении аэрации. :
Предшествующая аноксии обработка растений пшеницы абсцизовой кислотой приводила к снижению уровня МДА в период реаэрации почти в 2 раза по сравнению с анаэробным вариантом. На корнях проростков риса действие АБК не обнаруживалось. Ранее
было показано, что обработка.экзогенной АБК тормозит ростовые процессы в условиях дефицита кислорода, причем в большей мере у неустойчивого растения [19, 21, 22, 26]. Однако роль ее не ограничивается влиянием только на ростовые процессы. Очень важно значение АБК в индукции синтеза стрессовых и, в частности, аноксических стрессовых белков;, к которым относятся и белки антиоксидантной защиты: СОД, каталаза, пероксидаза [14]. Показано, например, что обработка АБК растений, подвергнутых водному дефициту, увеличивала активность указанных ферментов антиоксидантной защиты, и снижала образование .малонового диальдегида [15].
. Обработка индолилуксусной кислотой также вела к уменьшению концентрации МДА в корнях проростков пшеницы (на 12%), хотя воздействие ИУК было менее явным по сравнению с АБК. В корнях проростков риса действие ИУК не проявлялось. Торможение ПОЛ у пшеницы связано, возможно, с индукцией экспрессии генов каталазы, которая показана для незрелых и прорастающих зародышей кукурузы [18].
Эффект салициловой кислоты в корнях проростков пшеницы был сходным с действием АБК - обработка этим гормоном снижала образование МДА в 1,6 раза. Однако интенсивность воздействия CK на растения пшеницы была несколько ниже, чем у АБК. В корнях проростков риса та же концентрация CK не снижала, а стимулировала образование МДА. Общеизвестно, что CK способствует окислительному взрыву при патогенезе, ингибируя каталазу и вызывая, тем самым, накопление АФК. В силу этого CK должна активировать окислительные процессы и ПОЛ. Интерес к роли CK при абиотическом воздействии стал проявляться лишь в последние годы. Положительный эффект CK по снижению концентрации МДА у пшеницы, полученный нами при возвращении растений в аэробные условия, согласуется с данными других исследователей, показавших аналогичное действие CK на уровень ПОЛ при воздействии засоления и^еплового шока [1, 10]. Стимулирующее образование МДА, действие обработки CK в корнях проростков риса, вероятно, можно объяснить высоким эндогенным содержанием этого гормона, о чем имеются сведения в литературе [25].
Действие метилжасмоната характеризовалось небольшим (на 16%) снижением уровня, МДА в корнях проростков пшеницы и стимуляцией его образования в корнях проростков риса.
Гибберелловая кислота и кинетин не оказывали значительного влияния на процессы пероксидации в корнях обоих исследованных растений в пост-аноксический период.
Обращает на себя внимание то обстоятельство, что обработка растений использованными гормонами приводила к снижёнию уровня ПОЛ только у растений пшеницы, тогда как на уровень пероксидации в растениях риса гормоны либо не оказывали никакого воздействия, либо даже усиливали его. Известно, что пшеница, в отличие от риса не способна выдерживать длительные периоды кислородной недостаточности, поэтому, вероятно, она не обладает и хорошо развитой собственной системой защиты от последующего окислительного стресса. У риса же в процессе эволюции возникли более совершенные механизмы Приспособления не только к кислородной Недостаточности, но и к удалению появляющихся при реаэрации активных форм кислорода. Так, в работах нашей группы показано, что устойчивые к гипоксии растения (овес, рис, Iris pseudacorus L.) имеют более эффективную систему антиоксидантов, чем неустойчивые (пшеница и /. germanica L.) [3, 6, 8, 13].
Кроме того, нами ранее было показано, что гормональный статус растений пшеницы и риса во время аноксии различается. Исходное содержание АБК было почти вдвое выше в проростках риса, чем у пшеницы [2]. И уже в первые часы действия аноксии происходило накопление этого гормона, причем в большей степени у чувствительного растения. В тканях устойчивого растения происходило значительное увеличение уровня ИУК, которая становилась преобладающим гормоном (из трех рассмотренных) в условиях аноксии. У неустойчивого растения доминирующим в этих условиях гормоном являлась АБК. Возможно, именно с разницей в эндогенном содержании фитогормонов связано полученное нами раз-
личие в ответах растений пшеницы и риса на обработку фитогормонами. В силу того, что исходный уровень АБК был ниже у растений пшеницы дополнительное введение этого стрессового гормона запускало ряд адаптационных процессов, в том числе тормозила и процессы ПОЛ. В растениях риса эндогенное содержание АБК, по всей видимости, было достаточным для индукции этих механизмов, и введение экзогенного гормона оказывалось неэффективным. Весьма любопытно, что у устойчивых к различным стрессорам растений меньшие концентрации стрессовых гормонов вызывают более сильный адаптационный ответ, что было неоднократно продемонстрировано на примере этилена [12, 20, 23, 24]. По-видимому, устойчивые растения обладают большей чувствительностью к этим гормонам, и искусственное превышение их концентрации оказывает ингибирующее действие на развитие адаптационных механизмов. Особенно сильно эта тенденция прослеживается при действии салициловой кислоты и метилжасмоната на проростки риса. Как уже указывалось ранее, рис отличается высоким эндогенным содержанием СК [25]. К тому же обработка растений.СК стимулировала в них накопление АБК и ИУК [11]. В результате этого введение экзогенной СК приводило к наиболее сильному дисбалансу соотношения гормонов, способствуя, тем самым стимуляции ПОЛ в корнях проростков риса. Определение эндогенного содержания СК в наших объектах могло бы быть полезным для подтверждения этого предположения.
Таким образом, именно для пшеницы - растения неустойчивого как к аноксии, так и к окислительному пост-аноксическому стрессу экзогенное введение таких стрессовых фи-тогормонов как АБК и салициловая кислота сыграло наиболее положительную роль в торможении процессов ПОЛ.
Summary ' %
Kirchikhina N. A., Knyazeva A. A., Yemelyanov У V., Chirkova Т. V. The effect of plant hormones on lipid peroxidation in wheat and rice seedlings under post-anoxia stress.
The effect of a number of plant^ormones on lipid peroxidation is investigated in wheat and rice roots during a reoxygenation period after the anoxic treatment. Peroxidation is studied as the production of thiobar-bituric acid-reactive substances (TBARS). Hormonal treatment decreased levels of TBARS only in roots of anoxia intolerant wheat, moreover, abscisic acid (ABA), indole-3-acetic acid (IAA), salicylic acid (SA) and methyl jasmonate (MeJA) are particularly effective. In the roots of anoxia tolerant rice these hormones either didn't change the peroxidation level or even increase it. Obtained hormonal efFect is likely to be connected with alteration of endogenous levels of considered hormones under oxygen deprivation stress and to be dependent on the difference of wheat and rice tissue sensitivity to these hormones.
Литература
1. Бурханова Э. А., ФединаА. Б., Кулаева О. И. Сравнительное изучение влияния салициловой кислоты и (2'-5')-олигоаденилатов на синтез белка в листьях табака при тепловом шоке // Физиология растений. 1999. Т, 46. С. 16-22. 2. Емельянов В. В., Кирчихина Н. А., Ласточкин В. В., Чиркова Т. В. Гормональный баланс проростков пшеницы и риса в условиях аноксии // Физиология растений. 2003. Т. 50, №6. С. 922-929. 3. Ласточкин В. В., Емельянов В. В., Чиркова Т. В. Активность пероксидазы в проростках пшеницы и риса в связи с воздействием аноксии // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2000. Вып. 3 (№ 19). С. 59-64. 4. Полевой В. В. Фитогормоны. Л, 1982. 5. Рубин Б. А., Мерзляк М. Н, Юфе-рова С. Г. Окисление липидных компонентов в изолированных хлоропластах под действием света. Субстраты и продукты переокисления липидов // Физиология растений. 1976, Т. 23. С. 254-261. 6. Чиркова Т. В., Блохина О. Б. Влияние аноксии на уровень эндогенного перекисного окисления липидов в корнях растений, различающихся по устойчивости к недостатку кислорода // Вестн. Ленингр. ун-та. Сер. 3. 1991. Вып. 4 (№ 21). С. 85-90. 7. Чиркова Т. В., Жукова Т. М, Гончарова Н. Н., Белоно-гова В. А. Определение степени проницаемости мембран как способ диагностики растений на устойчивость к недостатку кислорода // Физиол. и биохим. культурн. растений. 1991. Т. 23, № 1. С. 68-74. 8. Чиркова Т. В., Новицкая Л. О., Блохина О. Б. Перекисное окисление липидов и активность антиок-
сидантных систем при аноксии у растений с разной устойчивостью к недостатку кислорода // Физиология растений. 1998. Т. 45, № 1. С. 65-73. 9. Чиркова Т. В. Физиологические основы устойчивости растений.; СПб., 2002. 10. Шатрова Ф. М., Безрукова М. В. Индукция салициловой кислотой устойчивости пшеницы к засолению среды // Известия РАН. Сер. Биол. 1997. №2. С. 149-153. 11. Шатрова Ф. М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция. Уфа, 2001. 12.BangaM., Slaa Е. J., Bloom С. W. P. M, l'oesenek L. А. С. J. Ethylene biosynthesis and accumulation under drained and submerged conditions. A comparative study of two Rumex species. // Plant Physiol. 1996. Vol. 112, N 1. P. 229-237. 13. Blokhina О. В., Virolainen E., Fagerstedt К. V., HoikkalaA., Wahála K., Chirkova Т. V. Antioxidant status of anoxia-tolerant and intolerant plant species under anoxia and reaeration // Physiol. Plant. 2000. Vol. 109. P. 396-403. 14. Campalans A., Messeguer R„ Goday A. etal. Plant responses to drought, from ABA signal transduction events to the action of the induced proteins // PJant Physiol. Biochem. 1999. Vol. 37, N 5. P. 327-340. 15. ChowdhuryS. /?., Choudhuh M. A. Effects of CaCI, and ABA on changes in H202 metabolism in two jute species under water deficit stress.-// J. of Plant Physiology. 1989. Vol. 135. P. 179-183. 16. Fluhr., MattooA. K. Ethylene - biosynthesis-and perception // CRC Crit. Rev. Plant Sci. 1996. N 15. P. 479-523. 17. Grossmann K., Hansen H. Ethylene-triggered abscisic acid: A principle in plant growth regulation? // Physiol. Plant. 2001. N 113. P. 9-14. 18. Guaní., ScandaliosJ. G. Catalase gene expression in response to auxin-mediated developmental signals // Physiol. Plant. 2002. Vol. 114. P. 288-295. 19. HortonR. F. The effect of ethylene and other regulators on coleoptilesgrowth of rice under anoxia // Plant Sci. 1991. Vol. 79. P. 685-689. 20. Kende Я, van der Knaap £, Cho H. T. Deep-water rice: a model piant to study stem elongation /'/ Piant Physiol. 1998. Vol.118. P. 1105-1110. 21. Lee Т. M., Lur #., Shieng Y., Chu C. Levels of abscisic acid in anoxia- or ethylene-treated rice (Oryza sativa L,) seedlings // Plant Sci. 1994. Vol. .95. P. 125-131. 22. MapelliS., BertaniA. Endogenous phytohor-mones and germination of rice under anoxia: indoleacetic acid and abscisic acid // Interacting stresses on plants in a changing climate / Ed. by M. B. Jackson, C. R. Black. NATO ASI Series. 1993. Vol. 116. P. 353-363. 23.RijndersJ. G. H. M., Yang Y. Y, Kamiya Y. et al. 'Ethylene enhances gibberellin levels and petiole sensivity in flooding-tolerant Rumex palustris byt not in flooding-tolerant R. acetosa H Planta. Í997. Vol. 203, N 1. P. 20-25. 24. Sauter M. Rice in deer water: «How to take heed against a sea of troübles» // Naturwissenschaften. 2000. Vol. 87, N 7. P. 289-303. 25. Silverman P., Seskar M, Kanter D. eral. Salicylic acid in rice. Biosynthesis, conjugation, and possible role // Plant Physiol. 1995. . Vol. 108. P. 633-639. lb. Summers J. £., Jackson M. B. Anaerobic promotion of stem extension in Potamogeton pectinatus. Roles of carbon dioxide, acidification and hormones // Physiol. Plant. 1996. Vol. 96. N 4. P. 615-622.
Статья поступила в редакцию 10 февраля 2005 г.
