CC BY
27
dynamics, conditions of functioning of neuromuscular and locomotor systems of spine and extremities, favourable alterations in biochemical state and in systems of adaptation in patients with dorsopathies with accompanying osteoarthrosis.
Key words: dorsopathies, osteoarthrosis, impulsive magnetic field
УДК 612.172.2; 611.664
ВЛИЯНИЕ ЭНДОМЕТРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК НА ХРОНИЧЕСКОЕ ИШЕМИЧЕСКОЕ ПОВРЕЖДЕНИЕ МИОКАРДА
Д.С. СТАНКОВ*, Д.В. ИВАНОВ*, А.А. ХАДАРЦЕВ**,
Т.И. СУББОТИНА**
Клеточные технологии - многообещающая возможность для лиц с хроническим повреждением миокарда, которое может возникать вследствие хронической ишемизации тканей, поражением вирусами, токсинами, аутоиммунными процессами. Ключевые слова: ишемия миокарда, стволовые клетки
Наши данные о свойствах стволовых клеток эндометрия, характеризующиеся фенотипами CD11b-, CD14-, CD34-, CD45-, CD44+, CD79+, CD90+, CD105+, можно отнести к клеткам с преобладанием свойств мезенхимальных стволовых клеток (МСК). После введения в ишемизированный миокард МСК, полученные из костного мозга, могут дифференцироваться в разные клеточные линии: в эндотелиальные клетки и кардиомиоциты, улучшая функцию левого желудочка (ЛЖ). Мало данных о возможностях МСК из менструальной крови для лечения ишемизированного ИМ [1-4].
Материалы и методы. Работа выполнена на крысах линии CD (Sprague-Dawley). Возраст к моменту моделирования инфаркта миокарда (ИМ) составлял 8±1 недель. Вес 225±25 г. Число животных - 50. В группы отобраны особи без признаков отклонений внешнего вида, так, чтобы индивидуальное значение массы не отклонялось от значения в группе более чем на ±10%. Все процедуры с животными рассмотрены и утверждены Институтской комиссией по уходу и использованию их на предмет соответствия этическим принципам. Условия содержания соответствовали стандартам The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (ILAR publication, 1996, National Academy Press, 1996).
Приготовление клеточного трансплантата. Стволовые клетки эндометрия, индуцированные в кардиогенном направлении (СКЭ-К) снимают с чашек с помощью растворов Версена и 0.05% трипсина-ЭДТА, с помощью автоматической пипетки (200-1000 мкл.) клеточную суспензию переносят в центрифужную пробирку (15 мл). С помощью серологической пипетки (10 мл) к клеточной суспензии добавляют 10 мл раствора Хэнкса. Пробирку помещают в центрифугу и осаждают клетки в течение 8 мин. при g=100 см2/с. Выделенные СКЭ-К клетки ресуспендировали в 1 мл физраствора. В аликвоте считали число клеток в автоматическом счетчике «Countess™» фирмы Invitrogen (США). Полученное число клеток разводили до концентрации 5 млн кл/мл физраствора. Суспензии клеток для введения фасовались в промаркированные пробирки и хранились при t=5±3°C<3 ч.
Мечение клеток флуоресцентной меткой. Перед введением животным СКЭ-К клетки предварительно метились красной флуоресцентной мембранной меткой PKH26 (Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit, Sigma). Для этого клеточную суспензию промывали раствором цефазолина в Хэнксе (1 мг/мл), центрифугировали (10 мин, 1100 об/мин, +4°С), промывали раствором цефазолина в Хэнксе, центрифугировали (5 мин, 1100 об/мин, +25°С), к осадку добавляли 0.5 мл растворителя С. К 0.5 мл приготовленного раствора PKH26 (2 мкл стока PKH26 в 0.5 мл растворителя С) добавляли 0.5 мл полученной суспензии клеток, перемешивали и инкубировали, встряхивая, 2-3 мин при +25°С. Реакцию останавливали добавлением 1 мл 1% раствора БСА и инкубировали 1 мин. Суспензию разводили 2 мл раствора цефазолина в Хэнксе и центрифугировали 10 мин при 1100 об/мин. Клеточный осадок переносили в другую пробирку и дважды промывали 10-15 мл раствора цефазолина в Хэнксе с последующим центрифугированием (10 мин, 1100 об/мин). Осадок разводили в 1 мл физраствора. В аликвоте считали число клеток и разводили до уровня 5 млн кл/мл физраствора.
Моделирование ИМ. Операция по моделированию трансмурального ИМ передней стенки и верхушки ЛЖ вы-
Государственное унитарное предприятие Тульской области «Науч-др-исследовательский институт новых медицинских технологий» Медицинский институт Тульский государственный университет
полнялась по общепринятой методике. Под наркозом (кета-мин+ксилазин, 80-100 мг/кг+10 мг/кг, внутримышечно) при искусственной вентиляции легких торакотомическим доступом лигировали левую нисходящую коронарную артерию ниже на 3 мм ушка левого предсердия. Наличие ИМ контролировали визуально и с помощью ЭКГ. Сразу после операции животным внутримышечно вводили противовоспалительный препарат пролонгированного действия «Дексафорт» однократно в дозировке 0.2 мл/кг. В течение 5 дней после операции животным вводили антибиотик «Линкомицин» (2 раза в день, в дозировке 6 мл/кг, внутримышечно). Для регистрации системного артериального давления (АД) животным имплантировался катетер в левую сонную артерию. Операции выполнялись под наркозом (кетамин+ксилазин, 80-100 мг/кг+10 мг/кг, внутримышечно). Катетер подсоединялся к электроманометрическому датчику DTXTM Plus TNF-R, Becton Dickinson. Для регистрации давления крови в ЛЖ сердца и определения индексов сократимости миокарда, для введения тестируемого клеточного трансплантата, а также для взятия проб крови в ЛЖ сердца имплантировали катетер через правую сонную артерию. Процедуры ввели под наркозом (кетамин+ксилазин, 80-100 мг/кг+10 мг/кг, внутримышечно) одновременно с имплантацией катетера в левую сонную артерию. Катетер подсоединялся к электроманомет-рическому датчику DTXTM Plus TNF-R, Becton Dickinson.
Процедура введения СКЭ-К. Клеточный трансплантат (СКЭ-К) вводили однократно через 30 суток после моделирования ИМ в полость ЛЖ через катетер в ЛЖ сразу после вживления катетера. Животное находилось в наркотизированном состоянии. Введение вели при наполненном сердце (при краткосрочном пережатии аорты) в 2 приема: сначала при 1-м пережатии не более чем на 10 с вводили половину объема, а после восстановления кровотока при 2-м пережатии аорты - вторую половину объема суспензии клеток. Пережатие аорты выполняли интраторакально металлической Г-образной палочкой, надавливая на район аорты. Пережатие аорты контролировали падением сигнала АД в сонной артерии. Объем введения для каждой особи рассчитывали по его массе (25 млн. клеток/кг, концентрация 5 млн/мл).
Толерантность к физическим нагрузкам была изучена в тесте плавания перед трансплантацией клеток и перед выведением животных из опыта. Для оценки динамической нагрузки в тесте «Плавание» животных помещали в круглую емкость, заполненную водой с температурой 23±2°С. Регистрировали длительность плавания от опускания крысы в воду до того, когда она начинала тонуть.
Регистрация ЭКГ. ЭКГ регистрировали у животных при моделировании ИМ (для подтверждения инфаркта), до введения тестируемых СКЭ-К, во время введения для выявления аритмий, и перед выведением особей из опыта (через 14 дней или 30 дней после введения). Процедуру выполняли на наркотизированных животных (кетамин + ксилазин, 80100 мг/кг + 10 мг/кг) одновременно с регистрацией системного АД и левожелудочкового давления. ЭКГ регистрировали путем системы мониторирования «HemoDynamics» v. 1.1. (ИБК РАН, Россия) при наложении электродов на правую переднюю лапу, на грудь и на правую заднюю лапу. С помощью программы «AnalyzeHemoDynamics» v.1.1. (ИБК РАН, Россия) обсчитывались параметры сигнала ЭКГ.
Регистрация системного и левожелудочкового давления крови. До трансплантации клеток и эвтаназии у наркотизированных животных регистрировали АД (через катетер в левой сонной артерии) и давление в ЛЖ сердца элек-троманометрическим датчиком DTXTM Plus TNF-R, Becton Dickinson и системы мониторинга «HemoDynamics» v.1.1. (ИБК РАН, Россия).
Гистологические исследования. Селезенку, печень и легкие животных контроля и опытной группы проводили стандартно, заливали в парафин и делали срезы толщиной 5-7 мкм на 3 разных уровнях, выбранных случайным образом. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином и микро-скопировали для выявления патологических очагов. Органы особей, которым вводили меченные PKH26 клетки, после криофиксации нарезали на криосрезы с помощью криостата HM525 MICROM и вели анализ миграции клеток в органах с помощью флуоресцентного микроскопа, считая число меченых клеток в 7-16 полях зрения. Сердца животных проводили стандартно, заливали в парафин и делали серийные поперечные срезы толщиной 5-7 мкм на 10 уровнях на протяжении от
верхушки сердца до предсердий. Препараты окрашивали пикросириусом красным для выявления рубцовой ткани.
Результаты работы. Процедура введения. Введение вели интракоронарно (при наполненном сердце во время краткосрочного пережатия аорты). Процедура введения переносилась животными тяжело; двукратное, хотя и краткосрочное, пережатие аорты вызывало у некоторых на фоне постинфарктного кардиосклероза состояние клинической смерти и требовало реанимационных мероприятий. Смертность животных была повышена в 30-32 дни исследования, что, очевидно, связано с процедурой введения.
Наблюдения и измерения в ходе исследования. После операции по моделированию ИМ (до 30-го дня исследования) погибли 15 животных из 44 (общего числа прооперированных в обеих группах). После трансвентикулярного интракоронарного введения физраствора погибли 4 животных их 16, после введения СКЭ-К - 3 животных из 15. Животные погибали сразу после процедуры введения или через 1-2 дня, что связано с тяжестью процедуры, выполняемой при двукратном пережатии аорты. У ряда особей в контроле (22-56% от общего числа животных в разные сроки) и в опытной группе (5-41%) отмечалась неустойчивая походка. Этот признак отражает чувство боли и связан, с общим состоянием особи после ИМ. У ряда особей имелись признаки больного животного: к сгорбленность и пилоэрекция. Ко дню плановой эвтаназии через 2 недели после введения неустойчивость походки была отмечена у меньшего числа животных, которым введены СКЭ-К, по сравнению с группой, которой введен растворитель (24% и 50%, соответственно), а другие признаки дистресса в опытной группе не отмечены.
Значения массы тела животных контрольной и опытной групп достоверно не отличались и составили в среднем 398 г и 374 г, соответственно, через 2 недели после введения и 438 г и 448 г - через 4 недели после введения.
Толерантность к физическим нагрузкам в тесте «Плавание». Длительность плавания животных не менялась по сравнению с исходными показателями и после введения физраствора, и после введения СКЭ-К, и не отличалась достоверно между группами, составив 15 мин и 17 мин через 2 недели после введения и 16 мин и 15 мин через 4 недели.
Параметры ЭКГ. Картины и соответственно, параметры ЭКГ как до трансплантации, так и после введения СКЭ-К (или физиологического раствора) были достаточно разнообразны: отмечались подъем сегмента 8Т, характерный для острой стадии ИМ, патологическая волна Q, уменьшение зубца Я. Отрицательного коронарного зубца Т, характерного для стадии рубцевания и отражающего зону ишемии, не наблюдалось. Через 4 недели после введения СКЭ-К отмечено уменьшение продолжительности зубца Т по сравнению с таковым до введения и значением в контроле. При субэндо-кардиальной ишемии может наблюдаться гигантский зубец Т, то уменьшение продолжительности Т в нашем исследовании можно оценивать в качестве показателя уменьшения зоны ишемии после введения клеток. Через 2 и 4 недели после введения СКЭ-К шло увеличение амплитуды зубца Р по сравнению со значением до введения (30-й день после моделирования ИМ). Через 2 недели после введения амплитуда Р была достоверно выше по сравнению с группой, которой был введен физраствор. Изменение зубца Р в картине постинфарктной ЭКГ нехарактерно, но рост зубца Р может наблюдаться при увеличении правого предсердия. В нашем исследовании это связано с развитием легочной гипертензии при постинфарктном кардиосклерозе. Сразу после введения СКЭ-К или физраствора в среднем у половины животных (56% и 55%, соответственно) отмечались разного рода аритмии, которые, скорее всего, связаны с тяжестью процедуры на фоне постинфарктного кардиосклероза - пережатия аорты для трансвентрикулярного интракоронарного введения.
Системное АД, левожелудочковое давление крови, индексы контрактильности. Через 2 и 4 недели после введения СКЭ-К отмечено достоверное увеличение ЧСС по сравнению со значением до введения; через 4 недели этот показатель был достоверно выше относительно контроля, где изменения этого показателя не было. Среднее АД было увеличенным по сравнению с его уровнем до введения через 2 и 4 недели после введения СКЭ-К (73 мм рт.ст, 88 мм рт.ст и 106 мм рт.ст), и это повышение через 2 недели после введения было достоверным относительно контроля (88 мм рт.ст и 79 мм рт.ст, соответственно), в которой достоверное увеличение срАД отмечено лишь через 4 недели. Увеличение
системного АД было ассоциировано с ростом максимального давления в ЛЖ, что отмечено через 2 и 4 недели после введения СКЭ-К (118 мм рт.ст и 136 мм рт.ст. относительно 103 мм рт.ст.) и только через 4 недели после введения физраствора (116 мм рт.ст. относительно 97 мм рт.ст.), оставаясь достоверно ниже по сравнению со значением после введения СКЭ-К (116 и 136 мм рт.ст., соответственно). Такой индекс кон-трактильности, как скорость прироста давления в ЛЖ (+dp/dt), увеличивался только после введения СКЭ-К через 2 и 4 недели (в контроле наблюдалась тенденция). Индекс контрактильности +dp/dt, отражающий скорость снижения давления в ЛЖ, увеличен по сравнению с уровнем до введения в обеих группах. Значения индексов контрактильности между группами, получавшими растворитель или СКЭ-К, достоверно не отличались. Не регистрировались исходные (до ИМ) показатели системного и левожелудочкового давления крови. Насосная функция сердца при остром ИМ угнетается, системное АД, ЧСС, давление в ЛЖ, индексы контрак-тильности после ИМ - должны падать. Наблюдаемый рост срАД, ЧСС, максимального давления в ЛЖ и индекса кон-трактильности +dp/dt после введения СКЭ-К является положительным, косвенно отражающим быстрое восстановление инотропной функции сердца по сравнению с контролем.
Результаты некропсии. У особей, погибших на ранних сроках после моделирования ИМ, отмечался обширный некроз передней стенки ЛЖ сердца. При вскрытии животных через 2 и 4 недели после введения физраствора и СКЭ-К почти у всех животных имелись рубцовые изменения сердца; выраженных макроскопических изменений других органов, а визуального изменения их размеров не наблюдалось.
Результаты гистологического анализа. Миграция флюоресцентно меченых СКЭ-К. Через 2 недели после трансплантации меченые СКЭ-К наблюдали в сердце и селезенке, а в печени и легких были единичные клетки. В сердце маркированные клетки обнаруживали лишь в рубцовой ткани ~55.5 клеток в поле зрения. В селезенке имелось в поле зрения 52.3 клеток, а в печени и легких выявляли единичные клетки - 2.9 и 1.4 клеток в поле зрения, соответственно. В миокарде и селезенке количество меченых клеток в поле зрения было достоверно больше, чем количество маркированных СКЭ-К в печени и легких. При разработанном способе введение клеток трансплантированные СКЭ-К мигрировали в миокард и селезенку. 49% обнаруженных клеток выявили в рубцовой ткани сердца, 47% клеток обнаружили в селезенке, и значительно меньше - в печени и легких (3% и 1%, соответственно). Данные результаты демонстрируют, что разработанный метод трансвентрикулярной интракоронарной трансплантации клеток является эффективным и обеспечивает доставку клеток в область повреждения.
Локализация СКЭ-К в зоне рубца указывает на их миграцию в зону повреждения при их равномерном распределении во время введения в правую и левую коронарные артерии. На гистологических препаратах сердца наблюдались три четко выраженные зоны - зона ИМ, рубец и неповрежденный миокард. Трансплантированные меченые клетки были выявлены в рубцовой ткани, при этом не входили в состав кровеносных сосудов соединительной ткани, были окружены толстыми пучками коллагеновых волокон. Меченые клетки были выявлены в других зонах, в области ИМ, в зоне неповрежденных кардиомиоцитов.
В селезенке трансплантированные клетки наблюдали только в зоне красной пульпы. В лимфоидной ткани меченых клеток выявлено не было. Через 4 недели после трансплантации меченые СКЭ-К в большом количестве обнаруживали в сердце; в селезенке, печени и легких присутствовали только единичные меченые клетки. В сердце меченые клетки локализовывались по-прежнему в зоне рубца. Их количество в среднем составило 49.5 клеток в поле зрения. В селезенке выявили большое количество меченых клеток - 28.8 клеток в поле зрения. В печени и легких наблюдали в среднем 7.6 и 3.1 клеток в поле зрения, соответственно. В миокарде и селезенке количество меченых клеток в поле зрения было достоверно больше, чем количество клеток в печени и легких. 56% обнаруженных клеток выявили в рубцовой ткани сердца, 32% клеток локализовались в селезенке, и значительно меньше - в печени и легких (9% и 3% соответственно). Трансплантированные клетки через 4 недели сохраняют свою локализацию, мигрируют только в зону рубцовой ткани и выживают; могут дифференцироваться в кардиомиоциты. При сравнении числа клеток в сердце и других органах через
2 и 4 недели после трансплантации установлено, что число клеток уменьшалось везде. Через 2 недели их количество по всем полям зрения составляло 36.6 клетки, а через 4 недели -26.3 клетки. Это связано с выцветанием метки, так как число меченых СКЭ-К уменьшалось равномерно во всех органах; но нельзя исключить элиминацию клеток иммунной системой. Через 4 недели число выявленных клеток в органах уменьшилось на 28% по сравнению с таковым через 2 недели после трансплантации. При интракоронарном введении клетки мигрируют в зону с повышенной концентрацией цитокинов и хемоатрактантов, усиливающих их миграцию в поврежденную ткань. Концентрация хемоатрактантов сохраняется и через месяц после острого ИМ, поэтому клетки локализуются в соединительной ткани, формируя рубцовую ткань. Нет данных о возможности транспланированных СКЭ-К дифференцироваться в клетки кровеносных сосудов.
Морфологические изменения постинфарктного сердца. Через 2 недели после трансплантации у всех особей, перенесших острый ИМ, в области передней и боковой стенок ЛЖ наблюдали обширные очаги рубцовой ткани. Рубцовая ткань представлена плотной неоформленной соединительной тканью с толстыми пучками коллагеновых волокон, вдоль них располагались редкие клетки веретеновидной формы. Фиброзная ткань рубца имела нечеткую границу с перифокальной зоной, пучки коллагенновых волокон вплетались между мышечными волокнами. У некоторых формировалась хроническая аневризма передней и/или левой стенки ЛЖ. В ряде случаев можно выявить еще не замещенные соединительной тканью участки некроза. По краям от аневризмы или рубца отмечали гипертрофию миокарда, у ряда животных наблюдали истончение стенки ЛЖ с дилата-цией его полости. Кардиомиоциты перифокальной зоны увеличены в размерах, часто двуядерные, гипертрофированы. Мышечные волокна окружают расширенные прослойки рыхлой волокнистой соединительной ткани с кровеносными сосудами разного калибра. Размеры рубца, толщина стенки аневризмы, дилатация полости ЛЖ варьировались.
Через 14 дней после трансплантации размер рубца в контроле составлял 7.1±4.1% и достоверно не отличался от этого показателя в группе после трансплантации клеток (5.8±3.3%). Статистически достоверных различий между группами также не наблюдали по индексу дилатации ЛЖ; в первой группе этот показатель составлял 23.4±6.7%, а во второй 20.3±5.7%. Достоверные различия были выявлены по индексу толщины стенки ЛЖ в области ИМ: 37.2±5.1% в 1-й группе и 48.9±4.7% - во 2-й. На 30 сутки после трансплантации во всех группах имелся постинфарктный кардиосклероз. Шло ремоделирование миокарда ЛЖ, проявляющееся уменьшением толщины стенки ЛЖ в области рубца и перифокаль-ной зоне. Размер рубца на этих сроках не отличался у 1 и 2-й групп (7.1±3.3% и 9.7±3.8%, соответственно). Но индекс дилатации в группе с введением клеток был выше: 33.4±6.1% против 28.4±5.9% в контроле. Достоверные различия индекса толщины стенки в области рубца сохранялись, в контроле этот показатель равен 27.0±2.8%, а в опытной - 29.5±3.1%.
Морфологические изменения печени, легких, селезенки. В селезенке, печени и легких были слабовыраженные признаки хронической сердечной недостаточности и в 1-й, и во 2-й группе. В селезенке выявляли полнокровие красной пульпы, опустошение Т- и В-зон лимфоидной ткани, расширение светлых зон герминативных центров. В печени также наблюдали признаки полнокровия в виде расширения центральных вен, синусоидных капилляров, слабовыраженные признаки жировой дистрофии некоторых гепатоцитов (мелкокапельное ожирение), анизоцитоз ядер гепатоцитов, увеличение доли стромального компонента органа, гиперплазия эпителия желчевыводящих протоков. В легких - признаки легочной гипертензии в виде гиалиноза мелких артерий. В ряде участков ткани легкого есть сидерофаги, как признак бурой индурации легких. Эти признаки рассматривались, как реактивные в рамках постинфарктного кардиосклероза, и отмечали их с одинаковой частотой и выраженностью.
Заключение по результатам гистологического анализа. СКЭ-К при интракоронарном введении эффективно доставляются в поврежденные ткани сердца: 49% трансплантированных клеток выявили в миокарде. Трансплантированные клетки можно было выявить в селезенке (47%), печени (3%) и легких (1%). Одинаковое распределение клеток при интроко-ронарном введении отмечали через 14 и 30 суток после
трансплантации. Трансплантированные клетки мигрировали и выживали в исследуемых органах в течение одного месяца. Если в селезенке, печени и легких трансплантированные клетки выявляли равномерно по всем органам, в особенности в области стромы органов, то в сердце клетки мигрировали в зону повреждения и локализовались только в области рубцовой ткани. При этом клетки имели веретеновидную форму, располагались вдоль коллагеновых волокон и не входили в состав стенок кровеносных сосудов соединительной ткани. Клетки обнаружены в близости от кардиомиоцитов перифо-кальной зоны или нормального миокарда: клетки дифференцируются в кардиомиоциты. Возможно, что клетки дифференцируются в фибробласты и формируют рубцы.
Трансплантация клеток не ведет к уменьшению размера рубца, не меняет скорость и степень ремоделирования ЛЖ. Миграция клеток в область рубца ведет к росту толщины и укреплению стенки ЛЖ в области рубца или хронической аневризмы. В печени, легких и селезенке выявлены умеренные морфологические признаки застойной сердечной недостаточности, которые можно рассматривать как реактивные, в рамках постинфарктного кардиосклероза. Других патологических признаков, очагов воспаления, очагов фиброза, образования оссификатов или опухолевых образований не было.
Заключение. Цель исследования - оценка эффективности клеточного трансплантата СКЭ-К (стволовые клетки эндометрия, индуцированные в кардиогенном направлении) при однократном введении в сердце через 30 суток после перенесенного острого ИМ у самцов крыс для экспериментального обоснования применения этих клеток при восстановительном лечении травматических и дегенеративных заболеваний миокарда. Смертность животных была одинакова в группах после введения физраствора или СКЭ-К (4 особи из 16 и 3 из 15, соответственно). Проявление внешних клинических признаков боли и дистресса у инфарктных животных отмечалось реже ко 2-й неделе после введения СКЭ-К по сравнению с контролем (24% и 50%, соответственно). Значения массы тела и толерантность к физической нагрузке животных в ходе исследования достоверно не отличались.
После введения СКЭ-К клеток по сравнению с контролем был отмечен более высокий уровень АД (через 2 недели, 88 и 79 мм рт.ст, соответственно) и ЧСС (через 4 недели, 265 и 216 уд/мин), а также более высокое значение максимального давления в ЛЖ (136 против 116 мм рт.ст.). Значения индексов контрактильности миокарда между группами, получавшими физраствор или СКЭ-К, достоверно не отличались. Скорость прироста давления в ЛЖ (+dp/dt) увеличивалась только после введения СКЭ-К по сравнению со значением до введения на 30-й день после ИМ, что является косвенным фактом восстановления инотропной функции сердца. Анализ ЭКГ показал, что через 2 недели после введения СКЭ-К клеток по сравнению с контролем увеличивалась амплитуда зубца Р, что связано с развитием легочной гипертонии, а через 4 недели шло снижение продолжительности зубца Т, что расценивается как уменьшение зоны ишемии.
Результаты данного исследования с использованием крысиной модели постинфарктного кардиосклероза показывают, что метод трансвентрикулярной интракоронарной трансплантации стволовых клеток эндометрия, индуцированных в кардиогенном направлении, является эффективным, обеспечивает доставку клеток в область повреждения. Трансплантированные клетки дифференцируются в кардиомиоци-ты, фибробласты и формировуют рубец в зоне инфарктного повреждения миокарда; при этом идет улучшение функциональных показателей сердечно-сосудистой системы. Однократное интракоронарное введение СКЭ-К клеток крысам CD в дозе 25 млн. кл/кг не вызывает патологических изменений гистоструктуры печени, легких и селезенки.
Литература
1.Beeres SL, Bax JJ, Dibbets-Schneider P. et al. Sustained effect of autologous bone marrow mononuclear cell injection in patients with refractory angina pectoris and chronic myocardial ischemia: twelve-month follow-up results. Am Heart J 152: 684-686, 2006.
2.Berry MF, Engler AJ, Woo YJ et al. Mesenchymal stem cell injection after myocardial infarction improves myocardial compliance. Am J Physiol Heart Circ Physiol 290: H2196-H2203, 2006.
3.Chen SL et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone. Am J Cardiol 94: 92-95, 2004.
4.Dai W, Hale SL, Martin BJ et al.. Allogeneic mesenchymal stem cell transplantation in postinfarcted rat myocardium: short- and long-term effects. Circulation 112: 214-223, 2005.
INFLUENCE OF ENDOMETRIAL CELLS ON A CHRONIC ISCHEMIC DAMAGE OF THE MYOCARDIUM
D.S. STANKOV, D.V. IVANOV, A.A. KHADARTSEV,
T.I. SUBBOTINA
State Unitary Enterprise of the Tula area «Scientific Research Institute of New Medical Technologies»; Medical Institute the Tula State University
At present celluar technologies - an up-and-coming therapeutic possibility for patient with chronic damage of the myocardium, which can appear in consequence of to make chronic ischemic of tissues, defeat of virus, toxins,autoimmune processes.
Key words: ischemic damage of the myocardium, stem cells
УДК 616.37-002:612 111.7
МИКРОГЕМОРЕОЛОГИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ПАНКРЕАТИТЕ
Н.М. БУРДУЛИ, С.К. ГУТНОВА*
Выявлены разнообразные изменения агрегационных свойств эритроцитов у больных хроническим панкреатитом в фазе обострения, преимущественно в сторону гиперагрегации. Патология микроциркуляции проявлялась преобладанием патологических гемодинамических типов.
Ключевые слова: хронический панкреатит, агрегация
Центральное место в патологии поджелудочной железы (ПЖ) принадлежит хроническому панкреатиту (ХП), диагностика и лечение которого представляют актуальную проблему [1, 2]. Распространенность ХП, по данным аутопсий, составляет 0,01-5,4%, в среднем - 0,3-0,4%; при этом за последние 40 лет заболеваемость выросла в ~2 раза, что связывают с растущим потреблением алкоголя и действием вредных факторов окружающей среды. Злоупотребление алкоголем - самая частая причина ХП (до 90% случаев) [3,4]. Значительная роль в развитии ХП принадлежит системным микроциркуляторным расстройствам, развитию ишемии и повышенной проницаемости клеточных мембран [5,6].
В работе Т.В. Ниловой и др. (2001 г.) отмечено, что в период обострения ХП повышается свертывающая активность крови с одновременным угнетением активности фиб-ринолиза. Повышается агрегация тромбоцитов, нарушаются реологические свойства крови, её вязкость, изменяются физико-химические свойства эритроцитов. Считается, что общими патофизиологическими механизмами микрореологи-ческих расстройств являются усиление агрегируемости эритроцитов, изменение структурирования потока крови (соотношения осевого потока кровяных клеток и пристеночного плазматического слоя, профиля скоростей, ориентация эритроцитов в потоке), что усугубляет проявления гипоксии, уменьшая качество репаративных реакций в целом [8, 9].
Исследования последних лет доказали значимость эритроцита как важнейшей биологической модели. Особенно интересным представляется исследование функциональной роли эритроцитов - их микрореологических свойств - с помощью изучения обратимой агрегации эритроцитов, которая является одним из основных процессов, определяющих способность крови к протеканию по мелким сосудам [10]. Известно, что именно в системе микроциркуляции реализуются основные функции крови: доставка кислорода и питательных веществ, удаление углекислого газа и продуктов метаболизма и т.д. Изменение реологического поведения эритроцитов может приводить к нарушению суспензионной стабильности крови, выраженным изменениям в системе микроциркуляции, развитию тканевой гипоксии, ацидоза, усугубляющих течение и тяжесть основного патологического процесса [11, 12, 13]. Данные литературы свидетельствуют, что работы по исследованию микрогемореологических нарушений при хроническом панкреатите немногочисленны. Поэтому целью нашего исследования явилось изучение агрегационной активности эритроцитов и системной микроциркуляции при хроническом панкреатите в фазе обострения.
Материал и методы. Всего обследовано 75 человек, из них - 45 больные хроническим панкреатитом (34 женщины и 11 мужчин) в возрасте от 36 до 77 лет (средний возраст -52,3±5,8 лет), продолжительностью заболевания от 1 года до 28 лет (средняя продолжительность заболевания - 7,5±2,3 года), и 30 человек составили группу здоровых. Диагноз ХП устанавливали на основании характерного болевого синдрома, признаков недостаточности внешнесекреторной функции ПЖ, лабораторных и инструментальных исследований. Агрегационные свойства эритроцитов изучались турбоди-
* Северо-Осетинская ГМА, Каф. тер. фак-та повышения квалификации и проф. переподготовки специалистов, г. Владикавказ
метрическим методом по Борну с применением анализатора агрегации гемоагрегометра АР 2110, фирмы SOLAR (Беларусь). В качестве стандартного агрегирующего агента использовали алциановый голубой 0,2 мг/мл. Определялись следующие параметры агрегации: степень агрегации - максимальный уровень светопропускания плазмы после внесения индуктора агрегации, в %; максимальная скорость агрегации - максимальное изменение светопропускания плазмы после внесения индуктора агрегации, в %/мин; время достижения максимальной скорости агрегации - время, соответствующее максимальной скорости агрегации, мин:сек.
Исследование микроциркуляции проводилось методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) на аппарате ЛАКК-02 (производство НПО «Лазма», РФ). ЛДФ-сигнал регистрировался в точке, расположенной на тыльной поверхности левого предплечья на 4 см выше лучезапястного сустава [11]. Запись ЛДФ-граммы проводили в утренние часы, в одно и то же время. Исходно производилась запись базального кровотока в течение 3 минут, затем дыхательная и окклюзионная пробы. Исходная ЛДФ-грамма подвергалась компьютерной обработке. В расчет брались следующие параметры: показатель микроциркуляции (ПМ) - характеризует величину потока эритроцитов в единицу времени в объеме ткани, среднеквадратичное отклонение параметра (а) и коэффициент вариации тканевого кровотока (Kv). Определялся индекс эффективности микроциркуляции (ИЭМ).
Проводился анализ амплитудно-частотного спектра (АЧС). Анализировались амплитуда медленных колебаний (LF), амплитуда быстрых колебаний (HF), амплитуда пульсовых колебаний (CF) путем гармоническо-частотного метода Фурье. Резерв капиллярного кровотока (РКК) регистрировался в процессе анализа результатов окклюзионной пробы (ОП) с пережатием сосудов выше места исследования манжеткой под давлением 250 мм. рт. ст. в течение 3 мин. По итогам исходной ЛДФ-граммы и ОП оценивался гемодинамический тип микроциркуляции (ГТМ), являющийся показателем итоговой оценки микроциркуляторных нарушений. Выделяли следующие ГТМ: нормоциркуляторный (НГТМ), гипере-мический (ГГТМ), спастический (СГТМ) и застойно-стазический (ЗСГТМ). Для НГТМ ПМ равен 4,5-6,0 перф. ед., РКК - 200-300%; при ГГТМ ПМ выше 6,0 перф. ед., РКК ниже 200%; при СГТМ ПМ менее 4,5 перф. ед., РКК более 300%; при ЗСГТМ ПМ меньше 4,5 перф. ед., РКК <200%.
Данные обрабатывали методом вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента: различия достоверны при р<0,05.
Результаты. При исследовании агрегационных свойств эритроцитов у больных ХП в фазе обострения до лечения выявлены разнообразные изменения как в сторону гиперагрегации, так и в сторону гипоагрегации. Гиперагрегация выявлена у 26 больных (57,7%). Все изучаемые показатели агрегационных свойств эритроцитов - степень агрегации (СтА), скорость агрегации (СкА) и время агрегации (ВА) при этом были достоверно выше, чем в группе здоровых (р<0,05), и составили (табл. 1): СтА 58,59±3,28 %, СкА 24,49±1,63 %/мин, ВА было укорочено до 7,2±0,33 мин. Показатели здоровых составили: СтА 47,9±2,9 %, СкА 16,05±3,09 %/мин, ВА 9,13±0,02 мин. Гипоагрегация регистрировалась у 10 больных (22,3 %). СтА и СкА при этом оказались снижены по сравнению с группой здоровых - СтА 27,4±3,6 % (р<0,05), СкА 9,75±1,65 %/мин (р<0,05). Нормоагрегация выявлена у 20% больных, изучаемые показатели при этом достоверно не отличались от показателей в группе здоровых (р>0.05). Анализ исходной агрегационной способности эритроцитов у больных ХП при обострении выявил преобладание гиперагрегации.
Таблица 1
Агрегационные свойства эритроцитов при ХП в фазе обострения
Показатель Группа здоровых Нормо- агрегация Гипер- агрегация Гипо- агрегация
СтА, % 47,9±2,9 48,06±5,2 58,59±3,28 ' 27,4±3,6'
СкА, 5/мин 16,05±3,09 16,54±2,65 24,49±1,63' 9,75±1,65*
ВА, мин 9,13±0,02 8,47±0,б5 7,2±0,33* 9,2±0,14
Примечание: # - р<0,05 - различия с группой здоровых
У больных ХП в фазе обострения преобладает СГТМ -у 22 больных (48,9%). ЗСГТМ встречался у 13 больных (28,9%). Регистрация СГТМ обусловлена спадом притока крови в микроциркуляторное русло за счет спазма приносящих микрососудов из-за выработки локальных вазокострик-торов, а ЗСГТМ обусловлено функциональным и структурным разрежением микроциркуляторной сети. ГГТМ - у 4 больных (8,9%). Развитие этого типа микроциркуляции объясняется притоком крови в микроциркуляторное русло,
