CC BY
29
Известия Тульского государственного университета
Естественные науки 2008. Выпуск 2. С. 238-245
ХИМИЯ
V. I К 544.6:57
Е.Ю. Чигринова, Е.Е.Бабкина, Е.Н. Иськив, В.А. Алферов,
О.Н. Понаморева, А.М. Воронин
Тульский государственный университет,
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН, г. Пущино
ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОННЫХ ЭФФЕКТОВ ЗАМЕСТИТЕЛЕЙ В МОЛЕКУЛАХ ФЕРРОЦЕНОВ НА ИХ МЕДИАТОРНЫЕ СВОЙСТВА В БИОСЕНСОРНЫХ СИСТЕМАХ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS*
Аннотация. Определены индексы эффективности медиаторов ферроце-нового ряда при электрокаталитическом окислении этанола бактериями Glu-conobacter oxydans. Проведен корреляционный анализ полученных экспериментально индексов эффективности с известными из литературы константами Тафта и Гаммета, характеризующими электронные эффекты заместителей.
Введение. В настоящее время интенсивно развивается направление по разработке новых воспроизводимых источников энергии - биотопливных элементов (БТЭ). в которых в качестве катализаторов используются целые клетки, способные взаимодействовать с искусственными акцепторами электронов, - медиаторами электронного транспорта [1]. В качестве возобновляемого сырья для БТЭ используют биоэтанол.
Эффективность работы таких БТЭ зависит от многих факторов, в том числе от эффективности взаимодействия медиаторов с ферментными системами клеток. Удобным инструментом исследований таких взаимодействий являются медиаторные микробные биосенсоры, а перспективными биокатализаторами могут стать бактерии уксуснокислые Gluconobacter oxydans, содержащие мембран локализованные ферменты, что облегчает их взаимодействие с искусственными акцепторами электронов.
*Работа была выполнена при поддержке грантов РНП 2.1.1.7789, РФФИ 08-04-90739-моб ст
В области медиаториых биосенсоров исследователи широко используют ферроцены (27%) в сочетании с ферментами. Микробные медиаторные биосенсоры представляют собой более сложную систему по сравнению с ферментными. Такие системы недостаточно исследованы, и для создания эффективных биосенсорных анализаторов и БТЭ требуется их детальное изучение.
Целью настоящей работы является выявление особенностей биоэлектро-каталитического окисления этанола целыми клетками бактерий G. oxydans в присутствии производных ферроцена с различными электронными эффектами заместителей.
Экспериментальная часть. В работе использовали бактерии G. oxydans subsp. suboxydans В-1280 (далее G. oxydans), полученные из коллекции микроорганизмов лаборатории биосенсоров ИБФМ РАН (г. Пущи-но). Электрохимические измерения проводили с помощью гальваностата-потенциостата IP С2000 с компьютерной программой регистрации и обработки данных (Кронас, Россия). Использовали двухэлектродную схему измерения (рабочий электрод - графитовый электрод, модифицированный ферроценом или его производными, с биокатализатором на поверхности, электрод сравнения - хорсеребрянный). Формирование рабочего электрода и проведение электрохимических измерений проводили по методике, описанной ранее [2]. Для формирования рабочих электродов использовали графитовую пудру (размер частиц <0,1 мм) (Fluka, Германия) и минеральное масло (Диа-М, Россия). В качестве медиаторов электронного транспорта применяли ферроцен и его производные (1,1’-диметил ферроцен, эти л ферроцен, ферроценмонокарбоновая кислота, 1 .Г-феррощчi/uiкарбоновая кислота, 1,Г-ферроцендиметанол) (Aldrich, Германия). Для удерживания биокатализатора у поверхности электрода использовали диализную мембрану (предел пропускания 14 кДа) (Roth, Германия). Измерения проводили при потенциале 350 мВ.
Результаты и их обсуждение. Отклики медиаторных микробных электродов на различные концентрации этанола получали в виде зависимости силы тока I от времени t. За ответ сенсора принимали амплитуду силы тока AI - разность между базовой и стационарной величинами тока (далее AI = I). Амплитуда силы тока в системе увеличивалась при увеличении исходной концентрации этанола. Следует отметить, что протекающий в системе ток пропорционален скорости реакции: I = nFv. где п -количество электронов; F - число Фарадея, v- скорость реакции. Таким образом, величина I опосредовано характеризует скорость биоэлектрокаталитическо-го окисления этанола на медиаторном графитовом электроде при участии ферментных систем бактерий.
Амперометрические измерения проводили при постоянных для каждого медиатора потенциалах, которые были рассчитаны ранее методом циклической вольтамперометрии [3]. Для производных ферроцена, которые применили в сочетании с бактериями С. охуйаия впервые, равновесный потенциал медиаторного биоэлектрода определяли экспериментально. Для этого были получены зависимости величин ответов биосенсоров от величины налагаемого на рабочий электрод потенциала. За равновесный потенциал электрода принимали, потенциал при котором ответ биосенсора был максимальным. Значения равновесных потенциалов медиаторных микробных электродов приведены в табл. 1.
Как видно из табл. 1, электроноакцепторные заместители (карбоксильные группы) увеличивают значение равновесного потенциала электрода, а электроннодонорные заместители (алкильные группы) уменьшают. Важно отметить, что в биосенсорных системах предпочтительнее использовать медиаторы с низкими равновесными потенциалами, что позволяет свести к минимуму протекание побочных реакций на электроде. ФЦ-ферроцен; ДМФЦ-
Таблица 1
Равновесные потенциалы медиаторных электродов с иммобилизованными бактериями С1иатоЬасЛ(т охуйапз и электронные эффекты заместителей
Медиатор Заместитель Электронные эффекты Е, мВ
Индук- ционный (!) Мезомер-ный (М)
ДМФЦ Ш-СНз + 1 — 220
ФЦ Н — — 250
ЭФ С2н5 + 1 — 300
ФДМ аьСН2ОН - 1 — 350
ФМК соон - 1 - М 350
ФДК (И- соон - 1 - м 400
1,1 ’-диметил ферроцен; Ф ДМ-1,1’- ферроцендиметано л; Э Ф-эти л ферроцен, ФМК-ферроценмонокарбоновая кислота, ФДК -1 .Г-ферроцепдикарбоновая кислота.
Были получены ответы сенсоров, модифицированных медиаторами фер-роценового ряда, при варьировании концентрации этанола в условиях избытка медиатора (рис., а) и концентрации медиатора в условиях избытка этанола (рис., б).
а б
Графическая зависимость ответа биосенсора от концентрации этанола в условиях избытка медиатора (а), от концентрации медиатора в пасте в условиях избытка этанола (б)
Для интерпретации полученных зависимостей предположили, что окисление субстрата мембранлокализованными дегидрогеназами бактериальных клеток СЫсопоЪасЬег оху(1ап8 в присутствии медиаторов переноса электронов может быть представлено как двухсубстратная ферментативная реакция, протекающая по механизму «пинг-понг». Путем обработки полученных экспериментальных данных по уравнениям типа Михаэлиса-Ментен
1 = 1 /Г/ГС! ( ПРИ << 1 — избыток медиатора ] ,
1 5'/ [о ] \ [-Мож] у
I = ----^тах — ( и ^5 _ избыток субстрата )
1 + Км/[Мох\ V И )
были вычислены значения 1тах, и Км- Рассчитанные параметры представлены в табл. 2.
В работе [2] показано, что отношение 1таж/К5' не зависит от типа электронного акцептора и характеризует бимолекулярное взаимодействие фермента с субстратом, а отношение 1таж/Км - зависит от типа электронного акцептора и характеризует взаимодействие фермента с медиатором.
Таблица 2
Параметры электрокаталитического окисления этанола бактериями С1исопоЪас1ег охуйапз в присутствии медиаторов переноса электронов
Медиа- тор Условия Iтах 5 мкА К 5, мМ Iтах ? К м, ммоль / г Iтах/КМ
ДМФЦ Этанол 60 мМ 4,0±0,6 0,30±0,05 13
ДМФЦ 2,3 ммоль / г 4,0±0,7 3,0±0,6 1,3
ЭФ Этанол 60 мМ 6,8±0,3 0,30±0,01 23
ЭФ 0,467 ммоль / г 2,8±0,4 2,7±0,3 1Д
ФЦ Этанол 60 мМ 2,1±0,3 0,06±0,01 35
ФЦ 0,5 ммоль / г 2,3±0,2 2,1±0,4 1Д
ФМК Этанол 60 мМ 2,3±0,1 0,02±0,01 115
ФМК 0,435 ммоль / г 2,2±0,2 1,8±0,1 1,2
ФДК Этанол 60 мМ 1,9±0,2 0,10±0,02 19
ФДК 0,365 ммоль / г 1,7±0,1 2,2±0,2 0,7
ФДМ Этанол 50 мМ 5,1±0,4 0,05 102
ФДМ 1,2 ммоль / г 4,6±0,5 3,7±0,4 1,3
Величины \,па.г / К,ч для всех медиаторов, кроме ФДК близки (см. табл. 1), что подтверждает принятую модель. Величина 1тах/Км - дает индекс эффективности электронного акцептора. Сравнивая величины 1тож/Км, можно заключить, что эффективность медиаторов электронного транспорта увеличивается в ряду: ДМФЦ< ФДК< ЭФ< ФЦ< ФДМ < ФМК.
Полученный ряд эффективности медиаторов связан с электронными эффектами заместителей в ферроцене: электроноакцепторные заместители повышают активность ферроценового ядра и, следовательно, индекс эффективности, а электронодонорные заместители, напротив, снижают активность и эффективность. Однако 1,Г-ферроцендикарбоновая кислота не подчиняется этому правилу. Это может быть связано, во-первых, с хорошей растворимостью этого соединения в воде, и, как следствие, значительным снижением концентрации медиатора в приэлектродном пространстве в ходе эксперимента, а, во-вторых, для соединений с сильно акцепторными группами, возможно, наблюдается отклонение от модели двухсубстратной ферментативной реакции, протекающей по механизму “пинг-понг” в условиях проведения эксперимента. Видимо, поэтому значение 1тах/для (ферроцен ди карбоновой кислоты не совпадает со значениями 1тах/Кз для других медиаторов.
Полученные значения индексов эффективности медиаторов далее использовали для проведения корреляционного анализа, в основе которого лежат количественные характеристики электронных эффектов заместителей константами Гаммета и Тафта. В табл. 3 представлены значения экспериментально полученных индексов эффективности различных медиаторов и значения констант Гаммета и Тафта, найденных в литературе, для заместителей, входящих в соответствующие соединения. Установлено, что индексы
Таблица 3
Параметры корреляционного анализа для медиаторов ферроценового ряда
Медиатор Заместитель Индекс эффектив- ности Константа Гаммета Константа Тафта
ДМФЦ сИ-СНз 13 - 0,19 [4] —
ЭФ С2н5 23 - 0,15[4] - 0,1[5]
ФЦ н 35 0[4] 0[5]
ФДМ (И-СН2ОН 102 — —
ФМК соон 115 0,45 [4] 2,1 [5]
ФДК сИ-СООН 19 — —
эффективности медиаторов ферроценового ряда зависят по линейному закону от констант, количественно характеризующих электронные эффекты заместителей, констант Гаммета и Тафта. Уравнения графической зависимости индекса эффективности медиатора (у) от констант Гамета (хх) и Тафта (х2) описываются уравнениями у 12 158Х). у 31 10x2. Коэффициент
корреляции зависимости индекса эффективности от константы Гамета (г = 0,995) больше, чем для зависимости индекса эффективности от константы Тафта (г = 0,993), что подтверждает результаты исследований, проводимых ранее [6] в рамках хронопотенциометрии с четвертичным потенциалом, при определении зависимости Ех/4 от корреляционных констант Гаммета и Тафта. Очевидно, величины константы Гаммета учитывают все взаимодействия между заместителями и ядром ферроцена, в то время как константы Тафта не учитывают уменьшение электронной плотности в атоме железа и увеличение устойчивости молекулы замещенного ферроцена в целом, обусловленные перекрыванием молекулярной или циклопентадиенил орбитали ядра ферроцена с 7г-орбиталями заместителей.
Таким образом, на основании линейных зависимостей, полученных в работе, можно предположить значения констант Гаммета и Тафта для заместителей, корреляционные константы которых не известны.
Выводы. Определены индексы эффективности для медиаторов ферро-ценового ряда с различными электронными эффектами заместителей. Установлено, что эффективность медиаторов электронного транспорта увеличивается в ряду: ДМФЦ< ФДК< ЭФ< ФЦ< ФДМ< ФМК.
Показано, что электроноакцепторные заместители повышают активность ферроценового ядра и, следовательно, индекс эффективности, а электроно-донорные заместители, напротив, снижают активность и эффективность. Однако, для соединений с сильно акцепторными группами, возможно, наблюдается отклонение от модели двухсубстратной ферментативной реакции, протекающей по механизму “пинг-понг” в условиях проведения эксперимента.
Показано, что константы эффективности медиаторов ферроценового ряда зависят по линейному закону от констант, количественно характеризующих электронные эффекты этих заместителей, констант Гаммета и Тафта. На основе этого можно провести расчет констант Гаммета и Тафта для заместителей, корреляционные константы которых не известны в литературе.
Библиографический список
1. Ikeda Т. Bioelectrocatalysis-based application of quinoproteins and quinoprotein-containing bacterial cells in biosensors and biofuel cells/ T. Ikeda, K. Kano // Biochimica et Biophysica Acta. -2003. -V. 1647. - P. 121-126.
2. Babkina E. Bioelectrocatalytic oxidation of glucose by immobilized bacteria Gluconobac-ter oxydans. Evaluation of water-insoluble mediator efficiency/ E. Babkina, E. Chigrinova, O. Ponamoreva, V. Alferov, A. Reshetilov // Electroanalysis. -2006. -V. 18. -JV® 19-20. -P. 20232029.
3. Smolander M. Mediated amperometric determination of xylose and glucose with an immobilized aldose dehydrogenase electrode/M. Smolander, H. Livio, L. Rasanen // Biosens. Bioelectron. -1992. -V. 7. -P. 637-643.
4. Днепровский A.C. Теоретические основы органической химии: учебное пособие/ A.C. Днепровский, Т. И. Темникова - Ленинград: Химия, 1991.
5. Gialih Lin. Structure-Reactivity Relationships as Probes for the Inhibition Mechanism of Cholesterol Esterase by Aryl Carbamates/ Lin Gialih, Lai Cheng-Yue, Liao Wei-Cheng, Kuo Bing-Hong, Lu Chun-Ping// Journal of the Chinese Chemical Society. - 2000. - V. 47. -P. 489 - 500.
6. George L.K. Substituent Effects in the Chronopotentiometric Oxidation of Ferrocenes/ L. K. George, William E. Mcewen, Jacob Kleinberg // Organic and biological chemistry. -1961.
Поступило 20.06.2008
