CC BY
36
УДК 577.24 + 612.67
ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ МИЛЛИМЕТРОВОГО ДИАПАЗОНА НА ЭКСПРЕССИЮ СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ ПРИ СТАРЕНИИ
1 2 И.Д. Молодцова , Д.С. Медведев, Н.С. Линькова
1 Молодцова Ирина Дмитриевна, научный сотрудник лаборатории восстановительного лечения и реабилитации Санкт-Петербургского ин-та биорегуляции и геронтологии. Тел.: 8-911-139-30-73. E-mail: irusik-m@list.ru.
2 Линькова Наталья Сергеевна, д-р биол. наук, доцент кафедры медицинской физики Санкт-Петербургского государственного политехнического ун-та. Тел.: 8-921-311-42-10. E-mail: miayy@yandex.ru.
Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Санкт-Петербургский государственный политехнический университет
Представлены собственные данные о влиянии электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на экспрессию сигнальных молекул в культуре клеток эндотелия сосудов при их старении. Низкоинтенсивное электромагнитное излучение миллиметрового диапазона в зависимости от времени воздействия может оказывать различное по выраженности и направленности влияние на экспрессию сигнальных молекул ^N08, 1-САМ-1, VEGF, CD141, эндотелин-1, ангиотензин-11, вазопрес-син) в эндотелии сосудов при его старении в культуре клеток. Вазопротекторный эффект электромагнитного излучения миллиметрового диапазона (ЭМИ ММД) с экспозицией 5 мин в старых культурах клеток выражается в стимуляции экспрессии эндотелиальной N0-синтазы ^N08). При увеличении длительности облучения с 5 до 15 мин в старых культурах клеток эндотелия ЭМИ ММД способно активировать экспрессию более широкого спектра молекул — ангиотензина-11, вазопрессина, VEGF, 1САМ-1, CD141. Полученные данные позволяют заключить, что ЭМИ ММД по-разному проявляет свои вазопротекторные свойства в зависимости от длительности воздействия. Регулируя экспозицию облучения, можно активировать экспрессию различных молекул, нарушение синтеза которых лежит в основе эндотели-альной дисфункции при старении сосудистой системы.
Ключевые слова: электромагнитное излучение миллиметрового диапазона, сосудистый эндотелий, сигнальные молекулы, пожилой возраст
EFFECT OF ELECTROMAGNETIC RADIATION
ON THE EXPRESSION OF MILLIMETER SIGNALING MOLECULES
IN CELL CULTURES OF VASCULAR ENDOTHELIUM IN AGING
I.D. Molodtsova1, D.S. Medvedev, N.S. Linkova2
1 Molodtsova Irina, Researcher, Laboratory of restorative treatment and rehabilitation of the St. Petersburg Institute of the Bioregulation and Gerontology. Tel.: 8-911-139-30-73. E-mail: irusik-m@list.ru.
2
Linkova Natalia, PhD, Associate Professor of Medical Physics, St. Petersburg State Polytechnic University. Tel.: 8-921-311-42-10. E-mail: miayy@yandex.ru.
St. Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, St. Petersburg State Polytechnic University
Own data on the effect of electromagnetic radiation of millimeter range on the expression of signaling molecules in the culture of vascular endothelial cells in their old age is presented. Effect of low intensity electromagnetic radiation of a millimeter wave, depending on the time of exposure may cause a different orientation for expression and impact on the expression of signaling molecules (eNOS, I-CAM-1, VEGF, CD141, endothelin-1, angi-otensin-II, vasopressin) in a vascular endothelium aging it in cell culture. Vasoprotective effect of electromagnetic radiation of millimeter range (EMR MMD) with an exposure of 5 minutes in the old cell cultures expressed in the stimulation of the expression of endothelial NO-synthase (eNOS). With increasing exposure time of 5 to 15 minutes in old cultures of endothelial cells EMI MMD expression is capable of activating a wider spectrum of molecules — angiotensin-II, vasopressin, VEGF, ICAM-1, CD141. The data obtained allow us to conclude that EMR MMD differently exerts its vasoprotective properties depending on the duration of exposure. Adjusting the exposure of radiation can activate the expression of various molecules, violation of the synthesis which is the basis of endothelial dysfunction in the aging cardiovascular system.
Keywords: electromagnetic radiation of millimeter range, vascular endothelium oid ang, signaling molecules
Такая возрастная патология сердечно-сосудистой системы как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, артериальная гипертензия, инфаркт миокарда и др. в первую очередь обусловлена возрастными изменениями эндотелия сосудов (СИагЬИ М., В1а/у I., Gogusev J. е! а1., 1997; Тоиу2 И.М., 2000).
Существующие в настоящее время медикаментозные и хирургические методы лечения сердечно-сосудистой патологии у лиц старшего возраста имеют множество противопоказаний и не всегда способствуют устранению причины эндо-телиальной дисфункции на молекулярно-клеточ-ном уровне. Среди методов лечения, основанных на применении физических факторов, в последние десятилетия получило широкое распространение электромагнитное излучение миллиметрового диапазона (ЭМИ ММД) или, по другой классификации, электромагнитного излучения крайне высокой частоты (ЭМИ КВЧ).
Применение низкоинтенсивного ЭМИ ММД широко вошло в медицинскую практику под названием КВЧ-терапии и показало свою эффективность в лечении ряда заболеваний.
Несмотря на большое количество клинических работ, показавших эффективность КВЧ-те-рапии при сердечно-сосудистой патологии у людей разного возраста, молекулярные механизмы действия низкоинтенсивного ЭМИ ММД на эндотелий сосудов до сих пор остаются недостаточно изученными.
Цель исследования — изучить влияние электромагнитного излучения миллиметрового диапазона на экспрессию сигнальных молекул в культуре клеток эндотелия сосудов при ее старении.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для создания культур клеток материал аорты (диаметр 0,2 см, 8 фрагментов) без патологических изменений получен от плода человека (21 неделя гестации) в НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН. Путем ферментативной диссоциации (коллагеназа) из материала аорты получена первичная культура ткани эндотелия. Выделяли первичную культуру на чашки Петри (Sarstedt), обработанные раствором фибриногена (Gibco), последующее культивирование происходило во флаконах с обработанной поверхностью (Sarstedt, 25 см ).
Для исследования аутопсийного материала аорты использовали гистологический и иммуногистохими-ческий методы исследования. Для изучения культур клеток применяли метод иммуноцитохимии. Полученные данные подвергали морфометрическому и имму-ноцитохимическому анализу.
Культивирование проводили до 3-го пассажа («молодые» культуры клеток) и до 20-го пассажа («старые» культуры клеток), в соответствии с рекомендацией Международной ассоциации исследований клеточных культур (США, Сан-Франциско, 2007).
Облучали клетки на 3-м и 20-м пассаже с помощью аппарата КВЧ-ИК-терапии «Триомед», модификация «Универсал» (ООО «Триомед», г. Санкт-Петербург), который является источником низкоинтенсивного излучения (менее 10 мкВт/см2) электромагнитных волн крайне высокочастотного и инфракрасного диапазонов для неинвазивного воздействия на участки кожного покрова человека (Рег. уд. ФСР № 2009/06554 от 17 августа 2012 г.).
Для облучения культур клеток излучатель подводили к горлышку культурального флакона и облучали в течение 5, 10 или 15 мин. В работе использовали программу модуляции № 1 по единому реестру программ производителя. Частота излучения составила 40 ГГц, частота модуляции несущей частоты
была равна 10,0 ± 0,5 Гц, длина волны — от 6,98 до 7,50 мм, средняя мощность излучения 0,01 мВт.
Все культуры были разделены на 4 группы:
1 — контроль (без облучения),
2 — облучение культуры в течение 5 мин,
3 — облучение культуры в течение 10 мин,
4 — облучение культуры в течение 15 мин.
Эндотелин-1, вазопрессин и ангиотензин-П были
выбраны нами в качестве объектов изучения, поскольку jyb принимают участие в регуляции сосудистого тонуса. Так, эндотелин-1, связываясь с эндоте-лин А-рецепторами, тормозит синтез N0 в эндотелии и вызывает сужение сосудов. Присоединившись к рецепторам В-1, эндотелин-1 вызывает расширение сосудов (тормозит образование цАМФ и усиливает синтез N0). В норме эндотелин-1 синтезируется в небольшом количестве и, реагируя с В-1-рецепто-рами, расширяет сосуды. Ангиотензин-П и вазопрессин являются антагонистами N0, способствуя вазо-констрикции.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Влияние ЭМИ ММД на экспрессию эндоте-лиальной N0-синтазы в клетках эндотелия сосудов при старении. ЭМИ ММД оказывало сходное действие на «молодые» и «старые» культуры клеток, однако направленность его эффекта зависела от длительности воздействия. В «молодых» контрольных культурах клеток площадь экспрессии eN0S составила 1,35 ± 0,16%. После 5-минутного облучения экспрессия eN0S в «молодых» культурах клеток возрастала на 32% и составила 1,98 ± 0,2%. При этом увеличение времени экспозиции до 10 и 15 мин приводило к обратному эффекту — снижению экспрессии eN0S в эндотелии сосудов при его старении соответственно на 28% (до 0,98 ± 0,08%) и 51% (до 0,67 ± 0,05%).
В «молодых» культурах эндотелиоцитов наблюдалось и увеличение оптической плотности экспрессии после 5-минутного воздействия. Уровень экспрессии увеличился на 24% и составил 0,25 ± 0,03% по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе (0,23 ± 0,03%).
В «старых» контрольных культурах клеток площадь экспрессии eN0S составила 0,64 ± 0,09%. После 5-минутного облучения экспрессия eN0S в «старых» культурах клеток возрастала на 57% и составила 1,47 ± 0,11%. При этом увеличение времени экспозиции до 15 мин приводило к обратному эффекту — снижению экспрессии eN0S в эндотелии сосудов при его старении на 33% (до 0,43 ± 0,06%).
Оптическая плотность экспрессии eN0S в «старых» культурах клеток, так же как и в «молодых», достоверно повышалась на 34% и после 5-ми-
нутного воздействия составила 0,29 ± 0,03%. При этом увеличение длительности экспозиции не оказывало статистически достоверного влияния на уровень экспрессии eN0s в «старых» культурах клеток.
Таким образом, ЭМИ ММД 5-минутной длительности может вызывать вазодилатацию, оказывая стимулирующее влияние на продукцию эндотелиальной N0-синтазы как в «молодых», так и в «старых» культурах клеток эндотелия. На это обстоятельство указывает как достоверное увеличение индекса площади на 24 и 57% соответственно, так и увеличение оптической плотности экспрессии — на 24 и 34% для «молодых» и «старых» культур клеток эндотелия.
2. Влияние ЭМИ ММД на экспрессию эндоте-лина-1 в клетках эндотелия сосудов при старении. В «молодых» контрольных культурах клеток площадь экспрессии эндотелина-1 составила 2,05 ± 0,19%. После 5-минутного облучения экспрессия эндотелина-1 в «молодых» культурах клеток возрастала на 51% и составила 4,17 ± 0,23%. При этом увеличение времени экспозиции до 10 мин также увеличивало уровень экспрессии эндотелина-1, но в меньшей степени — на 23% и составила 2,63 ± 0,1%. На протяжении всего времени экспозиции КВЧ-излучение не оказывало достоверного влияния на оптическую плотность экспрессии.
В «старых» культурах клеток ЭМИ ММД оказывало сходное с «молодыми» культурами воздействие на клетки эндотелия. После 5-минутного облучения экспрессия эндотелина-1, так же как и в «молодых» культурах клеток, возрастала на 72% и составила 3,96 ± 0,09%. При этом увеличение времени экспозиции до 10 мин также увеличивало уровень экспрессии эндотелина-1 — на 48% и составило 2,12 ± 0,16%.
Оптическая плотность экспрессии возрастала под действием 5-минутного облучения на 35%, её значение составило 0,26 ± 0,03% по сравнению с контрольным значением — 0,17 ± 0,03%. Дальнейшее увеличение длительности экспозиции не проводило к увеличению оптической плотности экспрессии эндотелина-1.
Таким образом, ЭМИ ММД длительностью от 5 до 10 мин способно в значительной степени оказывать сосудосуживающее действие, воздействуя на синтез эндотелина-1. Наиболее интенсивный уровень экспрессии эндотелина-1 как в «молодых», так и «старых» культурах клеток эндотелия наблюдается после воздействия 5-минутным КВЧ-излучением.
3. Влияние ЭМИ ММД на экспрессию ангио-тензина-11 в клетках эндотелия сосудов при старении. В «молодых» контрольных культурах клеток площадь экспрессии ангиотензина-11 составила 0,83 ± 0,05%. ЭМИ ММД длительностью 5 и 10 мин не влияло на экспрессию ангиотензина-П в «молодых» культурах клеток. Однако при повышении экспозиции до 15 мин площадь экспрессии ангиотензина-11 возрастала до 2,46 раза по сравнению с контролем и составила 2,05 ± 0,04%.
ЭМИ ММД в «молодых» культурах клеток не оказывало достоверного влияния на значение оптической плотности экспрессии ангиотензина-11.
В «старых» культурах клеток ЭМИ ММД 15-минутной длительности достоверно вызывало увеличение как площади экспрессии, так и оптической плотности экспрессии ангиотензина-11 на 65 и 37% соответственно. При этом экспозиции более короткие — 5 и 10 минутные не вызывали существенного увеличения исследуемых показателей.
Следовательно, ЭМИ ММД длительной экспозиции (15 мин) вызывает сильный сосудосуживающий эффект, воздействуя на уровень экспрессии ангиотензина-11.
4. Влияние ЭМИ ММД на экспрессию ва-зопрессина в клетках эндотелия сосудов при старении. В «молодых» контрольных культурах клеток площадь экспрессии вазопрессина составила 0,53 ± 0,06%. ЭМИ ММД длительностью 5 и 10 мин достоверно не влияло на экспрессию вазо-прессина в «молодых» культурах клеток. Однако при повышении экспозиции до 15 мин площадь экспрессии вазопрессина достоверно возрастала в 2,2 раза в «молодых» культурах. Сходный эффект наблюдался для оптической плотности экспрессии. Только увеличение времени экспозиции до 15 мин вызывало увеличение оптической плотности экспрессии на 48%, излучение меньшей длительности не вызывало этого эффекта.
В «старых» культурах клеток площадь экспрессии и оптическая плотность экспрессии, так же как и в «молодых» культурах клеток, достоверно повышали свои значения только после продолжительного воздействия — 15 мин. При этом площадь экспрессии возросла на 59% по сравнению с контролем и составила 0,52 ± 0,07%, а значение оптической плотности экспрессии увеличилось на 41% по сравнению с контрольным значением и составило 0,22 ± 0,03%.
Таким образом, ЭМИ ММД длительностью 15 мин вызывает вазоконстрикцию, реализуе-
мую через повышение уровня синтеза вазопрес-сина, о чем свидетельствует увеличение оптической плотности и площади экспрессии исследуемого биомаркера.
5. Влияние ЭМИ ММД на экспрессию тромбо-модулина (CD141) в клетках эндотелия сосудов при старении. В «молодых» культурах эндоте-лиоцитов ЭМИ ММД с различным временем экспозиции не оказывало достоверного влияния на уровень экспрессии тромбомодулина, а также на значение его оптической плотности.
В «старых» контрольных культурах клеток площадь экспрессии тромбомодулина (CD 141) составила 0,98 ± 0,05%. После КВЧ-излучения длительностью 5 и 10 мин уровень экспрессии тромбомодулина (CD 141) снижался на 66 и 54% соответственно и составил 0,34 ± 0,06 и 0,46 ± 0,08%. Наибольшее снижение уровня экспрессии наблюдалось при увеличении времени экспозиции до 15 мин — в 4,9 по сравнению с контрольным значением.
Вместе с этим под воздействием КВЧ-излу-чения также снижалась оптическая плотность экспрессии. В контроле её значение составило 0,11 ± 0,02%. После 5- и 10-минутного облучения значение оптической плотности опускалось до 0,06 ± 0,01 и 0,06 ± 0,02% соответственно, т.е. почти в 2 раза.
Действие тромбина на сосудистый тонус проявляется в его способности освобождать из эндотелия при разных условиях либо оксид азота (NO) и простациклин, тем самым стимулируя вазоди-латацию, либо эндотелии-1, а из тромбоцитов — тромбоксан А2, стимулируя процесс тромбообра-зования.
Таким образом, снижение уровня экспрессии тромбомодулина под действием ЭМИ ММД различной длительности может вызывать различные биологические эффекты через активацию тромбина. В «старых» культурах ЭМИ ММД способно нивелировать процессы тромбообразования, уменьшая уровень тромбина через снижение уровня экспрессии тромбомодулина.
6. Влияние ЭМИ ММД на экспрессию фактора роста эндотелия сосудов VEGF в клетках эндотелия сосудов при старении. В «молодых» контрольных культурах клеток площадь экспрессии VEGF составила 3,35 ± 0,17%. После 5-минутного облучения экспрессия VEGF в «молодых» культурах клеток возрастала на 14% и составила 3,89 ± 0,07%. При этом увеличение времени экспозиции до 10 мин также увеличивало уровень экспрессии VEGF — на 16% и составила 3,95 ± 0,11%.
Оптическая площадь экспрессии VEGF достоверно повышалась под воздействием ЭМИ ММД длительностью 15 мин на 39% по сравнению с соответствующим показателем в контроле и составила 0,28 ± 0,03%.
В «старых» культурах уровень экспрессии VEGF достоверно повышался на 29% (2,04 ± 0,2%), на 48% (2,78 ± 0,12%) и на 54% (3,14 ± 0,09%) при длительности КВЧ-излучения 5, 10 и 15 мин соответственно. Оптическая плотность экспрессии VEGF, так же как и «молодых» культурах, повышалась под воздействием ЭМИ ММД длительностью 15 мин. Величина оптической плотности повышалась на 39% по сравнению с соответствующим показателем в контроле и составила 0,26 ± 0,03%. При этом ЭМИ ММД меньшей длительности — 5 и 10 мин — не оказывали такого влияния на «старые» культуры клеток эндотелия.
Следовательно, увеличение уровня VEGF под воздействием ЭМИ ММД может способствовать вазодилатации опосредованно, стимулируя высвобождение эндотелиальной NO-синтазы как в «молодых», так и в «старых» культурах эндоте-лиоцитов.
7. Влияние ЭМИ ММД на экспрессию молекулы адгезии ICAM в клетках эндотелия сосудов при старении. Под действием ЭМИ ММД площадь экспрессии молекулы адгезии ICAM-1 снижалась как в «молодых», так и в «старых» культурах клеток. В «молодых» контрольных культурах клеток площадь экспрессии молекулы адгезии ICAM составила 0,64 ± 0,09%. После воздействия КВЧ-излучения уровень экспрессии молекулы адгезии ICAM-1 достоверно снижался на 22% (0,5 ± 0,08%), на 22,5% (0,56 ± 0,13%) и на 54% (0,43 ± 0,07%) при длительности экспозиции 5, 10 и 15 мин соответственно.
При этом ЭМИ ММД различной длительности не оказывало достоверного влияния на значение оптической плотности экспрессии ICAM-1 в «молодых» культурах эндотелия сосудов.
В «старых» контрольных культурах клеток площадь экспрессии молекулы адгезии ICAM составила 2,33 ± 0,1%. После воздействия ЭМИ ММД уровень экспрессии молекулы адгезии ICAM-1 достоверно снижался на 46% (1,28 ± ±0,13%), на 38% (1,45 ± 0,17%) и на 59% (0,97 ± 0,07%) при длительности экспозиции 5, 10 и 15 мин соответственно. При этом наиболее сильно снижался уровень экспрессии при длительной экспозиции — 15 мин в «молодых» культурах в 1,48 раза.
Оптическая плотность экспрессии также достоверно снижалась под воздействием ЭМИ ММД длительностью 5, 10 и 15 мин на 34, 25 и 34% соответственно по сравнению с соответствующим показателем в контроле и составила 0,08 ± 0,02;
0.09.± 0,02 и 0,08 ± 0,02%.
ВЫВОДЫ
1. Электромагнитное излучение миллиметрового диапазона (мощность 0,01 мВт, частота 40 ГГц) в зависимости от времени воздействия по-разному влияет на экспрессию сигнальных молекул (eN0S, 1САМ-1, УЕСР, CD141, эндоте-лин-1, ангиотензин-11, вазопрессин) в эндотелии сосудов при старении клеточных культур.
2. ЭМИ ММД длительностью 5 мин оказывает вазопротекторное влияние благодаря стимуляции экспрессии эндотелиальной N0-синтазы (eN0S), причем в «старых» культурах клеток этот эффект больше в сравнении с «молодыми».
3. ЭМИ ММД длительностью 15 мин вызывает вазопротекторный эффект благодаря стимуляции экспрессии ангиотензина-11, вазопресси-на, фактора роста эндотелия сосудов (УЕСР) и снижению синтеза молекулы адгезии 1САМ-1, тромбомодулина (CD141). В «старых» культурах клеток эффект КВЧ-излучения был в несколько раз выше, чем в «молодых» культурах клеток.
4. ЭМИ ММД на молекулярно-клеточном уровне оказывает различное вазопротекторное и геропротекторное влияние на эндотелий сосудов при его старении в зависимости от длительности воздействия.
ЛИТЕРАТУРА
1. Головачева Т.В., Киричук В.Ф., Ушаков В.Ю., Пав-люк В.М. Влияние различных режимов КВЧ-терапии на состояние системы гемостаза у больных ОИМ // «Миллиметровые волны нетепловой интенсивности в медицине» Междунар. симпозиум. М., 1991. С. 65-69.
2. Киричук В.Ф., Антипова О.Н., Иванов А.Н. и др. Анти-стрессорное действие электромагнитного излучения те-рагерцового диапазона частот молекулярного спектра оксида азота // Биомед. технолог. 2004. № 11. С. 12-20.
3. Медведев Д.С. Возможности коротковолновочастотной терапии в регуляции общего периферического сосудистого сопротивления при сочетанной патологии у пожилых // Вестник РУДН. Серия «Медицина». 2010. № 4. С. 330-332.
4. Медведев Д.С. Оксидативный статус у больных с артериальной гипертензией в гериатрической практике и миллиметровая терапия // Фундаментальные исследования. 2011. № 5. С. 118-121.
5. Пальцев М.А., Кветной И.М., Полякова В.О. и др. Сигнальные молекулы: место в персонифицированной диагностике, лечении и профилактике социально значимых заболеваний // Молекулярная медицина. 2012. № 5. С. 4-8.
Поступила 02.09.2014
