Влияние экзополисахаридов молочнокислых бактерий- на синтез провоспалительных цитокинов макрофагами мышей при фагоцитозе Staphylococcus aureus Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

24. Wagemakers A., Koetsveld J., Narasimhan S. et al. Variable major proteins as targets for specific antibodies against Borrelia miyamotoi. J. Immunol. 2016,196 (10): 4185-4195.

25. Wagemakers A., Oei A., Fikrig M.M. et al. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasit. Vectors 2014, 7:418.

26. Wagemakers A., StaarinkPJ., Sprang H., Hovius J. W. Borrelia miyamotoi: a widespread tickborne relapsing fever spirochete. Trends Parasitol. 2015, 31 (6): 260-269.

Поступила 21.08.17

Контактная информация: Платонов Александр Евгеньевич, д.б.н., проф.,

111123, Москва, ул. Новогиреевская, За, р.т. (495) 976-96-46

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018

Г.Т.Урядова, Е.А.Горельникова, Н.А.Фокина, А.С.Долмашкина, Л.В.Карпунина

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ НА СИНТЕЗ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ МАКРОФАГАМИ МЫШЕЙ ПРИ ФАГОЦИТОЗЕ STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова

Цель. Изучение влияния экзополисахаридов (ЭПС) молочнокислых кокков на цито-киновую активность макрофагов мышей при фагоцитозе in vitro Staphylococcus aureus 209-P. Материалы и методы. В работе использовали ЭПС Streptococcus thermophilus и Lactococcus lactis В-1662. На 1, 3, 5 и 7 выделяли альвеолярные (АМФ) и перитонеальные (ПМФ) макрофаги и моделировали процесс фагоцитоза in vitro. Через 30 минут, 1,6 и 24 часа определяли содержание провоспалительных цитокинов ИЛ- 1а и ФНО-а. Результаты. ЭПС оказывали неоднозначное влияние на продукцию цитокинов. Наибольшее действие на синтез ИЛ-1 а и ФНО-а оказывал ЭПС S. thermophilus. Заключение. Результаты исследований позволяют говорить о возможности использования ЭПС S. thermophilus в качестве профилактического иммуностимулятора для коррекции цитокинового статуса животных.

Журн. микробиол., 2018, № 1, С. 67-71

Ключевые слова: экзополисахариды, цитокины, фагоцитоз, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis В-1662

G.Т.Uryadova, E.A.Gorelnikova, N.A.Fokina, A.S.Dolmashkina, L.V.Karpunina

EFFECT OF EXOPOLISACCHARIDES OF LACTIC ACID BACTERIA ON THE SYNTHESIS OF PROINFLAMMATORY CYTOKINES BY MACROPHAGIC MICE IN PHAGOCYTOSIS OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Vavilov State Agrarian University, Saratov, Russia

Aim. Study of the effect ofexopolysaccharides (EPS) of lactic acid cocci on cytokine activity of macrophages of mice with phagocytosis in vitro Staphylococcus aureus 209-P. Materials and methods. The EPS of Streptococcus thermophilus and Lactococcus lactis B-1662 was used in the work. At 1,3, 5 and 7, AMP and PMP were isolated and the phagocytosis process was modeled in vitro. After 30 minutes, 1, 6 and 24 hours, the content of pro-inflammatory cytokines IL-1 a and TNF-a was determined. Results. EPSs had an ambiguous effect on the production of cytokines. The greatest effect on the synthesis was provided by EPS of S. thermophilus. Conclusion. The results of the study allow us to talk about the possibility of using EPS of S. thermophilus as a preventive immunomodulator for correction of the cytokine status of animals.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2018, No. 1, P. 67-71

Keywords: exopolysaccharides, cytokines, phagocytosis, Streptococcus ¡hemophilus, Lactococcus lactis B-1662

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы большое внимание уделяется изучению роли экзополи-сахаридов в организме человека и животных. Известно, что ЭПС таких молочнокислых бактерий, как Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Bifidobacterium adolescentis, L. rhamnosus, L. kefiranofaciens обладают иммуностимулирующим эффектом [2, 4, 7 — 12]. Биополимеры этих бактерий способны повышать продукцию иммунокомпетентными клетками провоспали-тельных цитокинов, таких как интерлейкин-1а (ИЛ-1а) и фактор некроза опухоли-а (ФНО-а), играющих важную роль в активации макрофагов и лимфоцитов.

В настоящей работе было изучено влияние экзополисахаридов Streptococcus thermophilus и Lactococcus lactis В-1662 на цитокиновый статус лабораторных мышей при фагоцитозе in vitro Staphylococcus aureus 209-P.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали ранее выделенные нами ЭПС из S. thermophilus и L. lactis В-1662 [5, 6]. Культура S. thermophilus была получена из Всероссийского НИИ молочной промышленности, Москва, L. lactis В-1662 — из Всероссийской коллекции микроорганизмов, г. Пущино-на-Оке.

Экзополисахариды в концентрации 0,06 г/мл вводили по 0,2 мл внутри-брюшинно беспородным мышам-самцам массой 18 — 20 г возрастом 2 — 3 месяца. Концентрация была подобрана из расчета предельно допустимой дозы ЭПС (0,06%) для организма животных [1]. Альвеолярные (АМФ) и пери-тонеальные (ПМФ) макрофаги выделяли из легких и брюшной полости по общепринятой методике [3] на 1,3, 5 и 7 сутки после введения экзополисахаридов. В качестве объекта фагоцитоза использовали суточную культуру S. aureus 209-Р, полученную из музея кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии СГМУ им. В.И.Разумовского. Провоспалительные цитокины ИЛ-1а и ФНО-а, продуцируемые макрофагами в процессе фагоцитоза, определяли с помощью иммуноферментных моноклональных тест-систем (ООО «Цитокин», Санкт-Петербург). Результаты учитывали на микропланшетном фотометре Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США) при 450 нм. По значениям оптической плотности стандартных образцов строили калибровочные кривые и с учетом оптической плотности образцов определяли концентрации цитокинов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В процессе исследований было показано, что изучаемые ЭПС способны индуцировать провоспалительные цитокины ИЛ-1а и ФНО-а, но характер воздействия оказался различен. Так, альвеолярные макрофаги под действием экзополисахарида S. thermophilus были наиболее активны в продуцировании ИЛ-1 а через 24 ч на 1 и 7 сутки процесса фагоцитоза, что в обоих случаях в 1,4 раза больше контрольных значений (табл. 1). Аналогичную тенденцию к повышению продукции ИЛ-1а наблюдали в отношении перитонеальных макро-

фагов на 5 и 7 сутки эксперимента. Продукция ПМФ ИЛ-1а под действием ЭПС S. thermophilus через 24 ч фагоцитоза была выше контрольных значений в 3,3 и 1,3 раза для 5 и 7 суток соответственно (табл. 1).

В отношении ФНО-а альвеолярные макрофаги были наиболее активны на 1, 3 и 5 сутки: значения отличались от контрольных в 1,4 раза для 1 и 5 суток и в 1,2 раза для 3 суток (на протяжении всего эксперимента наблюдали последовательное увеличение содержания цитокина в крови). Перитонеальные макрофаги были активны в синтезе ФНО-а на 1 и 5 сутки эксперимента: к 24 ч концентрация цитокина была больше контрольных значений в 2,1 и 1,3 раза соответственно (табл. 1).

При изучении влияния ЭПС L. lactis В-1662 на продукцию ИЛ-1а было показано неоднозначное его влияние на различные макрофаги. Так, в отношении АМФ не было замечено увеличения продукции ИЛ-1а под влиянием ЭПС лактококка. Однако перитонеальные макрофаги к 24 ч продуцировали ИЛ-1а больше контрольных в 2,1 и 7,75 раза на 1 и 7 сутки соответственно (табл. 2).

При изучении влияния ЭПС L. lactis В-1662 на продукцию ФНО-а макроТаблица 1. Влияние экзополисахарида S. thermophilus на синтез ИЛ-1а и ФНО-а макрофагами мышей при фагоцитозе in vitro S. aureus 209-P

Макрофаги Время процесса фагоцитоза

30 мин 1ч 6 ч 24 ч

Содержание ИЛ-1а, нг/мл

Контроль АМФ 54,30±0,12 84,30+0,14 54,30+0,12 558,00±0,13

ПМФ 51,30±0,12 57,30+0, 1 1 сутки 53,30+0,13 100,00+0,15

АМФ 51,30±0,22* 44,80+0,12 40,30±0,24* 782,00±0,11

ПМФ 96,80±0,12 53,80±0,21* 3 сутки 55,30±0,31* 84,80±0,12

АМФ 76,30+0,12 106,30+0,15 180,80+0,22* 211,80±0,17

ПМФ 65,30+0,13 115,30±0,20 79,30±0,21* 74,30±0,13

Опыт 5 сутки

АМФ 82,80±0,15 89,30+0,21 84,80+0,12 121,80+0,23*

ПМФ 120,30±0,17 134,30+0,31* 7 сутки 111,80±0,12 328,30+0,28*

АМФ 94,30+0,22* 97,30±0,25* 118,30+0,17* 771,80+0,18*

ПМФ 154,30+0,20* 133,80±0,21* 143,30+0,42* 133,30+0,22*

Содержание ФНО-а, нг/мл

Контроль АМФ 1,24±0,22 1,32±0,12 1,35+0,17 1,60±0,23

ПМФ 1,20+0,28 1,45±0,23 1 сутки 2,30±0,32 1,42+0,15

АМФ 1,48±0,22 1,45+0,12 1,80±0,28 2,21±0,30*

ПМФ 1,27±0,27 1,55±0,18 3 сутки 2,80±0,23 3,00+0,27*

АМФ 1,4810,15 1,51+0,18 2,00±0,20 1,79±0,28*

ПМФ 1,48+0,27 1,50±0,22 1,43±0,12 1,79+0,17

Опыт 5 сутки

АМФ 2,19±0,18 1,52±0,30 1,50±0,17 1,48±0,22

ПМФ 1,70±0,17 1,85+0,18 7 сутки 2,26±0,25 1,9410,13

АМФ 1,50±0,21 1,50±0,17 1,58±0,28* 1,65+0,21

ПМФ 1,34+0,20 1,39+0,15 1,32±0,31* 1,6010,25

Примечание:* Достоверные различия по сравнению с контролем при р<0,05.

Таблица 2. Влияние экзополисахарида L. lactis В-1662 на синтез ИЛ-1аи ФНО-а макрофагами мышей при фагоцитозе S. aureus 209-Р

Время процесса фагоцитоза

макрофаги 30 мин 1ч 6 ч 24 ч

Содержание ИЛ-1а, нг/мл

Контроль АМФ 54,30+0,12 84,30+0,14 54,30±0,12 558,00±0,13

ПМФ 51,30+0,12 57,30±0,11 1 сутки 53,30±0,13 100,00+0,15

АМФ 120,80+0,11 119,30+0,17 77,30±0,20* 131,30+0,15*

ПМФ 107,30+0,12 169,30±0,25* 3 сутки 146,8010,21* 150,00+0,25*

АМФ 80,30+0,13 60,30+0,32* 47,80±0,12* 59,80+0,19*

ПМФ 98,30+0,12 66,80±0,18* 87,30±0,21* 114,80+0,23*

Опыт 5 сутки

АМФ 97,30+0,27* 79,80+0,17 50,80+0,11* 51,80±0,13

ПМФ 58,30+0,25* 89,30±0,21 52,80±0,25* 57,80+0,18

7 сутки

АМФ 65,80+0,21* 94,80±0,13 110,30+0,16* 150,80+0,15*

ПМФ 53,80+0,20 64,30+0,17 46,80±0,22* 775,80+0,31*

Содержание ФНО-а, нг/мл

Контроль АМФ 1,24+0,22 1,32+0,12 1,35+0,17 1,60±0,23

ПМФ 1,20+0,28 1,45±0,23 1 сутки 2,30±0,32 1,42±0,15

АМФ 1,37+0,12 1,29+0,13 1,39±0,28 2,20+0,11

ПМФ 1,34+0,11 1,50+0,18 3 сутки 1,37+0,16 1,40+0,18

АМФ 1,30+0,22 1,37+0,32* 1,51+0,15 2,40+0,21*

ПМФ 1,50+0,20 1,35+0,18* 1,50+0,21 1,69+0,17*

Опыт 5 сутки

АМФ 1,45±0,15* 1,37+0,21* 1,47+0,17 1,39+0,11

ПМФ 1,58±0,12* 1,45±0,17* 7 сутки 1,43+0,18 1,40+0,21

АМФ 1,50+0,23 1,40+0,13 1,42±0,21* 1,57+0,17

ПМФ 1,40+0,15 1,44±0,27 1,60±0,25* 1,58+0,15

Примечание:* Достоверные различия по сравнению с контролем при р<0,05.

фагами более активны в отношении синтеза данного цитокина были АМФ на 1 и 3 сутки эксперимента — к 24 часам опытное значение превышало контрольное в 1,4 и 1,5 раза соответственно. Перитонеальные макрофаги, выделенные от мышей, которым вводили ЭПС L. lactis В-1662, во все сроки исследования не были активны в продукции ФНО-а (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ

Из данных литературы известно, что ЭПС, синтезированные молочнокислыми бактериями, составляющими основу слизистой оболочки кишечника, способны поддерживать гомеостаз кишечника, влиять на систему иммунитета через цитокины, синтезируя их в кровь, т.е. регулировать защитный иммунитет [12]. Полисахариды, синтезируемые бактериями рода Lactobacillus, обладают иммуностимулирующим эффектом и активацией макрофагов и лимфоцитов [7, 8, 10, 11], иммуномодулирующими свойствами в отношении спленоцитов мышей за счет стимуляции выработки макрофагами ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-12, ИФ-у [9].

В настоящем исследовании нами было показано, что ЭПС S. thermophilus и L. lactis В-1662 оказывают влияние на продукцию цитокинов макрофагами в процессе фагоцитоза in vitro. При моделировании процесса фагоцитоза ЭПС термофильного стрептококка, по сравнению с ЭПС L. lactis В-1662, оказывал более выраженное воздействие на синтез провоспалительных цитокинов, в особенности ФНО-а. Представленные результаты коррелируют с полученными нами ранее данными [2,4], согласно которым ЭПС других молочнокислых бактерий — Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii В-1596, L. delbrueckii В-1936 и L. delbrueckii ssp. bulgaricus способствуют синтезу ИЛ-la и ФНО-a перитонеальными и альвеолярными макрофагами в процессе фагоцитоза бактерий [2,4].

Таким образом, на основании полученных результатов можно говорить о возможном участии экзополисахаридов S. thermophilus и L. lactis В-1662 в регуляции цитокинового статуса в организме животных при фагоцитозе S. aureus 209-Р.

ЛИТЕРАТУРА

1. Булдаков А.С. Пищевые добавки. СПб: UT, 1996.

2. Горельникова Е.А., Карпунина Л.В. Действие экзополисахаридов лактобацилл на фагоцитарную и цитокиновую активность in vitro и в организме животных при моделировании инфекционного процесса. Журн. микробиол. 2015, 5:44-50.

3. Кондратьева И.А., Воробьева И.В., Буракова О.В. Практикум по иммунологии. М.: Издательство Московского университета, 2001.

4. Правдивцева М.И., Горельникова Е.А., Карпунина Л.В. Влияние экзополисахаридов лактобацилл на синтез ИЛ-1 а и ФНО-а макрофагами мышей при фагоцитозе Staphylococcus aureus. Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. 2011, 4: 14-16.

5. ФокинаН.А.,УрядоваГ.Т.,КарпунинаЛ.В.ВыделениеэкзополисахаридаизLactococcus lactis при различных условиях культивирования. Аграрный научный журнал. 2016, 12: 40-42.

6. Фокина Н.А., Урядова Г.Т., КарпунинаЛ.В. Физико-химические свойства экзополисахарида Lactococcus lactis. Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2017,2 (19): 74-77.

7. Arai K.I., Lee F., Miyajima A. et. al. Cytokines: coordinators of immune and inflammatory responses. Annual. Rev. Biochem. 1990,59: 783-836.

8. Benjamini E., Sunshine G., Leskowitz S. Immunology, a short course. WILEY-LISS, New York, 1996, p. 451-453.

9. Chabot S., Yu H. et al. Exopolysaccharide from Lactobacillus rhamnosus RW-9595M stimulate TNF, IL-6 and IL-12 in human and mouse cultured inmunocompetent cells, and IFN-y in mouse splenocytes. Lait. 2001, 81:683-697.

10.Kitazawa H., Nishimura J., Harata Т., Itoh T. Phosphate group requirement for mitogenic activation of lymphocytes by an extracellular phosphopolysaccharide from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Int. J. Food Microbiol. 1998,40: 169-175.

11. Kitazawa H., Ishii Y., Uemura J. et al. Augmentation of macrophage functions by an extracellular phosphopolysaccharide from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Food Microbiology. 2000,17:109-118.

12.Vinderola G., Perdigón G., Duarte J. et al. Effects of the oral administration of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens on the gut mucosal immunity. Cytokine. 2006, 36: 254-260.

Поступила 17.07.17

Контактная информация: Урядова Галина Тимофеевна, 410012, Саратов, Театральная пл., 1, р.т. (8452)23-32-92