Научная статья на тему 'Влияние экзогенных протеолитических ферментов на передачу плазмидных генов в смешанных бактериальных биоплёнках'

Влияние экзогенных протеолитических ферментов на передачу плазмидных генов в смешанных бактериальных биоплёнках Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
443
78
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
БАКТЕРИАЛЬНЫЕ БИОПЛЁНКИ / ФЕРМЕНТЫ / ГЕНЫ / ПЕРЕДАЧА / АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТЬ / BACTERIAL BIOFILMS / ENZYMES / GENES / TRANSFER / ANTIBIOTIC RESISTANCE

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Тец Г. В., Артеменко Н. К., Заславская Н. В., Артеменко К. Л., Кнорринг Г. Ю.

Изучено действие комплекса ферментов препарата Вобэнзим на передачу плазмидных генов в биоплёнках грамотрица-тельных бактерий. Показано, что внеклеточный матрикс бактериальных биоплёнок, содержит внеклеточную ДНК, несущую маркеры антибиотикоустойчивости. Установлено, что воздействие комплекса ферментов приводит к снижению частоты передачи генов антибиотикоустойчивости в смешанных бактериальных биоплёнках.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Тец Г. В., Артеменко Н. К., Заславская Н. В., Артеменко К. Л., Кнорринг Г. Ю.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Effect of Exogenic Proteolytic Enzymes on Transfer of Plasmid Genes in Mixed Bacterial Biofilms

The effect of the enzyme complex from Vobenzin on transfer of plasmid genes In biofilms of gramnegative bacteria was studied. The extracellular matrix of the bacterial biofilms was shown to contain extracellular DNA carrying the antibiotic resistance markers. The action of the enzyme complex resulted in lower frequency of the antibiotic resistance genes transfer in mixed bacterial biofilms.

Текст научной работы на тему «Влияние экзогенных протеолитических ферментов на передачу плазмидных генов в смешанных бактериальных биоплёнках»

е

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Влияние экзогенных протеолитических ферментов на передачу плазмидных генов в смешанных бактериальных биоплёнках

Г. В. ТЕЦ, Н. К. АРТЕМЕНКО, Н. В. ЗАСЛАВСКАЯ, К. Л. АРТЕМЕНКО, Г. Ю. КНОРРИНГ, В. В. ТЕЦ, Ю. И. СТЕРНИН

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова,

Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования

Effect of Exogenic Proteolytic Enzymes on Transfer of Plasmid Genes in Mixed Bacterial Biofilms

G. V. TETS, N. K. ARTEMENKO, N. V. ZASLAVSKAYA, K. L. ARTEMENKO, G. YU. KNORRING, V. V. TETS, YU. I. STERNIN

Academician I. P. Pavlov St.Petersburg State Medical University St.Petersburg Academy of Postgraduate Medical Training

Изучено действие комплекса ферментов препарата Вобэнзим на передачу плазмидных генов в биоплёнках грамотрица-тельных бактерий. Показано, что внеклеточный матрикс бактериальных биоплёнок, содержит внеклеточную ДНК, несущую маркеры антибиотикоустойчивости. Установлено, что воздействие комплекса ферментов приводит к снижению частоты передачи генов антибиотикоустойчивости в смешанных бактериальных биоплёнках.

Ключевые cлoвa: бaкmеpuaльные бшплент, феpменmы, гены, передача, aнmuбuomuкoycmoйчuвocmь.

The effect of the enzyme complex from Vobenzin on transfer of plasmid genes In biofilms of gramnegative bacteria was studied. The extracellular matrix of the bacterial biofilms was shown to contain extracellular DNA carrying the antibiotic resistance markers. The action of the enzyme complex resulted in lower frequency of the antibiotic resistance genes transfer in mixed bacterial biofilms.

Key words: bacterial biofilms, enzymes, genes, transfer, antibiotic resistance.

Введение

Практически все бактерии и грибы, находящиеся в ротовой полости человека, образуют и входят в состав биоплёнок. Свойства бактерий внутри сообщества значительно отличаются от таковыгх у изолированных клеток [1—3]. Показано, что биоплёнка является идеальной нишей для обмена генетической информацией между бактериями. Трансформация в биоплёнках Streptococcus mutans наблюдается в 10—600 раз чаще, чем в планктонных клетках [4]. На модели биоплёнки была продемонстрирована передача между стрептококками конъюгативного транс-позона, кодирующего резистентность к тетрациклину [5]. Передача генетической информации посредством конъюгации в биоплёночных культурах Pseudomonas aeruginosa также наблюдалась чаще, чем среди планктонных клеток [6, 7]. Отмечено, что клинически значимые штаммы бактерий, содержащие конъюгативные плазмиды, отличаются лучшей способностью формировать биоплёнки, что связано с участием F-пилей в качестве адгезивных молекул

© Коллектив авторов, 2009

Адрес для корреспонденции: 197089 С.-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8. Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова

во взаимодействии клеток с поверхностью субстрата и друг с другом [8].

В последние годы показано, что различные ферменты могут изменять свойства внеклеточного матрикса и влиять таким образом на выживаемость бактерий. Вместе с тем остается неизученной изменчивость в условиях воздействия протеаз и липаз на матрикс биоптенок.

В связи с этим целью настоящего исследования было изучение возможности влияния на изменчивость бактерий за счëт действия экзогенных ферментов на бактериальные биоптенки.

Материал и методы

Muкpoopгaнuзмы. Объектом исследования служили стандартные штаммы Escherichia coli HB101, tetR, несущий хромосомный ген устойчивости к тетрациклину и E.coli DH5 alfa, pUC 19 ampR, несущие ген устойчивости к ампициллину (табл. 1). Микроорганизмы получены из музеев кафедры микробиологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова.

Пumamельные cpеды. Использованы: мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), минимальная синтетическая среда М9, бульон Мюллера-Хинтон (BioMerieux), агар Мюллера-Хинтон (BioMerieux), среда LB (Sigma).

Anm^uommu. В работе использованы различные природные и синтетические антибиотики: ампициллин (Hemofarm AD), тетрациклин (BioMerieux, Франция).

-е-

Є

Таблица 1. Характеристика использованных микроорганизмов

№ и.о. Длина последовательности нуклеотидов (п. н.) Температура отжига (°С) Последовательность

E.coli HB101.

Ген хромосомной устойчивости к тетрациклину — tetA.

Прямой праймер 869 20 59.98 5'-GCTACATCCTGCTTGCCTTC-3'

Обратный праймер 1077 20 59.80 3'-ATAGATCGCCGTGAAGAGGA-5'

Б.еоИ БН5а /риС19.

Плазмида риС19 размер: 2.6(кЬ) = 2686 bp.

Прямой праймер 151 20 59.97 5'-CGGCATCAGAGCAGATTGTA-3'

Обратный праймер 308 20 60.00 3'-CTGGCGTAATAGCGAAGAGG

Примечание. Для подбора праймеров использовали программу Primer3 - http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/

primer3/primer3_www.cgi.

Ферментные препараты. Вобэнзим (Мукос Фарма, Германия).

Определение жизнеспособности бактерий. Жизнеспособность бактерий оценивали, определяя методом серийных разведений число колониеобразующих единиц (КОЕ). Для этого готовили последовательные десятикратные разведения в физиологическом растворе, высевали на агаризованную среду по 0,1 мл, после чего инкубировали при 37°С и подсчитывали количество выросших колоний.

Получение бактериальных биоплёнок в чашках Петри. В чашки Петри (D=40 мм) вносили по 0,8 мл взвеси бактерий в конечной концентрации (5х108 КОЕ), инкубировали 3 часа при 37°С и после этого добавляли по 2 мл свежей среды. Чашки Петри выдерживали 24 часа при 37°С, а затем ферменты вносили или сразу, или через 24 часа. После инкубации с препаратами при 37°С содержимое чашек сливали, промывали 1 мл фосфатного буфера, добавляли 0,5 мл свежей среды и механически соскабливали биоплёнку. Жизнеспособность бактерий оценивали, определяя КОЕ. В качестве контроля использовали биоплёнку, образованную бактериями, без обработки её ферментами.

Выявление передачи плазмидных генов антибиотикоустой-чивости. Для передачи плазмидных генов антибиотикоустой-чивости совместно выращивали штаммы E.coli, устойчивые к тетрациклину и ампициллину, на средах без антибиотика. Полученные смешанные сообщества ресуспендировали в изотоническом растворе хлорида натрия, и высевали на среды, содержащие отдельно тетрациклин или ампициллин и тетрациклин с ампициллином. Учёт результата проводили в течение 72 часов. В опытные образцы ферменты добавляли согласно схеме опыта.

Статистические методы. Полученные количественные данные были обработаны с использованием методов вариационной статистики. Наряду со средним арифметическим значением (М) вычисляли величины среднеквадратичной ошибки (а), определяли доверительные границы выборочного параметра. Далее при представлении количественных данных приводятся значения М±а. Достоверность различий оценивали, используя ¿-критерий Стьюдента при пороге доверительной вероятности 0,97 [9].

Результаты исследования

Для проведения экспериментов были созданы 2 штамма: E.coli HB101, tetR, несущий хромосомный ген устойчивости к тетрациклину, и E.coli DH5 alfa, pUC 19 ampR, несущий ген устойчивости к ампициллину.

Для проверки штаммов и последующего поиска переданных генов методом полимеразной

цепной реакции были созданы праймеры для соответствующих генов.

Для определения частоты передачи плазмидных генов использовали полученные штаммы микроорганизмов: E.coli HB101, tetR, и E.coli DH5 alfa, pUC 19 ampR. В качестве маркерного признака оценена передача плазмидных генов устойчивости к ампициллину. Оценка передачи устойчивости признака в биоплёнках после 24, 48, 72, 96, 120, 144 и 168 ч инкубации в присутствии Вобэнзима и без него в качестве контроля.

В ходе экспериментов оценивали:

а) выявление передаваемых признаков в генах ДНК матрикса;

б) определение количества живых бактерий биоплёнки (число колониеобразующих единиц, КОЕ);

в) определение числа бактерий, получивших новый признак за счёт пересева на дифференциально-диагностические среды с антибиотиками;

г) выделение ДНК;

д) электрофорез и выявление соответствующих генов методом ПЦР.

Для проведения запланированных экспериментов была выполнена проверка образования смешанных биоплёнок штаммами, созданными для данного исследования. В ходе проведённого испытания установлено, что смешанные биоплёнки образуются в заданных условиях при их формировании бактериями, взятыми в посевной дозе в 2 — 5х109в соотношении 1:1.

Выявление передаваемого признака в генах ДНК матрикса. Смешанные 24-часовые биоплёнки получали на дне 9 см стеклянных чашек Петри. Матрикс и клетки разделяли центрифугированием при 9000 g в течение 30 мин. Из матрикса выделяли ДНК фенол-хлороформным методом, и после электрофореза в материале полосы ДНК по размеру, соответствующей плазмиде данного штамма, определяли наличие плазмидных генов методом ПЦР. В результате установлено, что плазмида штамма E.coli DH5 alfa, pUC 19, ampR

О

Є

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Таблица 2. Передача плазмидных генов в присутствии Вобэнзима

Время Доза Вобэнзима (мг/л)

инкубации О о 5 О О О

с ферментом КОЕ число реком- КОЕ число реком- КОЕ число реком- КОЕ число реком- КОЕ число реком-

(в часах) бинантов бинантов бинантов бинантов бинантов

24 8+2 (9,9±0,5)х108 7±3 (9,7±0,5)х108 8±3 (1,2±0,4)х109 4±2 (9,0±0,6)х108 4±2

48 (9,6±0,2)х108 8±3 (1,2±0,4)х109 9±3 (9,9±0,4)х108 10±3 (1,2±0,2)х109 4±2 (1,0±0,2)х109 4±2

72 (1,2±0,3)х109 10±3 (9,9±0,4)х108 8±3 (9,4±0,2)х108 8±2 (9,9±0,4)х108 3±2 (9,6±0,4)х108 3±1

96 (1,7±0,5)х109 8±2 (1,2±0,4)х109 9±2 (1,2±0,5)х109 9±3 (1,0±0,4)х109 5±1 (9,7±0,6)х108 4±2

120 (9,8±0,6)х108 6±3 (1,0±0,3)х109 6±2 (9,5±0,5)х108 7±3 (1,1±0,2)х109 4±2 (9,6±0,5)х108 3±2

144 (9,6±0,6)х108 8±2 (9,4±0,6)х108 5±3 (9,8±0,2)х108 8±2 (9,6±0,4)х108 4±1 (9,0±0,3)х108 4±1

168 (9,9±0,2)х108 9±3 (1,0±0,6)х109 8±3 (9,4±0,6)х108 7±2 (9,2±0,6)х108 3±1 (9,4±0,3)х108 3±1

присутствует во внеклеточном матриксе смешанных бактериальных биоплёнок, может быть выделена из него и идентифицирована методом ПЦР (табл. 2).

Выявлено, что при действии высоких концентраций Вобэнзима на биоплёнки различного возраста происходит изменение числа выявления рекомбинантов антибиотикоустойчивости. При этом число рекомбинантов снижается в 2 раза. По данным молекулярного анализа происходит передача плазмиды, контролирующей устойчивость к ампициллину, к штамму, несущему ген устойчивости к тетрациклину.

Обсуждение

Полученные данные свидетельствуют, что ферменты, входящие в состав Вобэнзима, воздействуют на свойства смешанных микробных биоплёнок. Эти данные соответствуют ранее полученным результатам об универсальности действия различных ферментов, когда объектом воздействия являются не собственно бактерии, а компоненты внеклеточного матрикса биоплёнок

ЛИТЕРАТУРА

1. Ghannoum M., O'Toole G. A., eds. Microbial Biofilms. Washington: ASM Press; 2004. p. 478.

2. Тец В. В. Бактериальные биоплёнки. Антимикробная терапия. Consilium medicum. 2007; Экстравыпуск: 13—15.

3. Tetz V. V, Korobov V. P., Artemenko N. K. et al. Extracellular phospholipids of isolated bacterial communities. Biofilms 2004; 1—7.

4. Li Y. H, Lau P. C, Lee J. H. et al. Natural genetic transformation of Streptococcus mutans growing in biofilms. J Bacteriol 2001; 183: 897—908.

5. Hausner M, Wuertz S. High rates of conjugation in bacterial biofilms as determined by quantitative in situ analysis. Applied Environmental Microbiol 1999; 65: 3710—3713.

6. Roberts A. P. Cheah G., Ready D. et al. Transfer of Tn916-like elements in microcosm dental plaques. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45: 2943—2946.

[10, 11]. Присутствие плазмид и мутантных генов, контролирующих антибиотикоустойчивость, не делают бактериальные биоплёнки устойчивыми к воздействию использованных ферментов. В матриксе смешанных биоплёнок однаружена внеклеточная ДНК, несущая использованные маркерные гены антибиотикоустойчивости. Так, во внеклеточном матриксе смешанных бактериальных биоплёнок выявлена плазмида штамма E.coli DH5 alfa, pUC 19, ampR. При действии ферментов, входящих в состав Вобэнзима, зарегистрировано уменьшение количества внеклеточного матрикса, что очевидно снижает эффективность передачи генов между бактериями биоплёнок. При этом установлено статистически значимое снижение частоты передачи плазмидных генов антибиотикоустойчивости в бактериальных биоплёнках использованных штаммов.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности влиять на частоту передачи плазмидных генов антибиотикоустойчи-вости в бактериальных биоплёнках с помощью ферментов.

7. Thoma C. M., Nielsen K. M. Mechanisms of and barriers to horizontal gene transfer between bacteria. Nature Rev 2005; 3: 711—721

8. Ghigo J. M. Natural conjugative plasmids induce bacterial biofilm development. Nature 2001; 25; 413: 6858: 772.

9. Монцевичуте-Эрингене E. В. Упрощенные математико-статистические методы в медицинской исследовательской работе. Патол Физиол Экспер Тер 1964; 4: 71—78.

10. Тец В. В., Кнорринг Г. Ю., Артеменко Н. К. и соавт. Влияние экзогенных протеолитических ферментов на бактерии. Антибиотики и химиотер 2004; 12: 3—6.

11. Tetz G. V., Artemenko N. K., Tetz V. V. Effect of DNase and antibiotics on biofilm characteristics. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53: 1204—1209.

О

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.