Научная статья на тему 'Влияние экзогенных бактериальных РНКаз на функционирование кальций-зависимых калиевых каналов в клетках эмбриональной почки человека'

Влияние экзогенных бактериальных РНКаз на функционирование кальций-зависимых калиевых каналов в клетках эмбриональной почки человека Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
90
28
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
БАКТЕРИАЛЬНЫЕ РНКАЗЫ / ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ / СА2+-ЗАВИСИМЫЕ КАЛИЕВЫЕ КАНАЛЫ / CA2+-ACTIVATED K+ CHANNELS / BACTERIAL RNASES / CYTOTOXICITY

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Зеленихин Павел Валерьевич, Колпаков Алексей Иванович, Митькевич Владимир Александрович, Макаров Александр Александрович, Ильинская Ольга Николаевна

Исследовали связь между активностью Са2+-зависимых калиевых каналов (КСа-каналов), искусственно внесенных в клетки эмбриональной почки человека, и подверженностью данных клеток цитотоксическому действию катионных микробных РНКаз. Показано, что внесение экзогенной РНКазы в среду через 24 ч культивирования приводило к увеличению мембранного тока через КСа-каналы. Дальнейшее культивирование приводило к угнетению функций канальных белков. Удаление из среды культивирования РНКаз приводило к восстановлению активности КСа-каналов. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о возможной регуляции функций КСа-каналов катионными экзогенными РНКазами на трансляционном и транскрипционном уровнях.Исследована связь между активностью Са2+-зависимых калиевых каналов (КСа-каналов), искусственно внесенных в клетки эмбриональной почки человека, и подверженностью данных клеток цитотоксическому действию катионных микробных РНКаз. Показано, что внесение экзогенной РНКазы в среду через 24 ч культивирования приводило к увеличению мембранного тока через КСа-каналы. Дальнейшее культивирование приводило к угнетению функций канальных белков. Удаление из среды культивирования РНКаз приводило к восстановлению активности КСа-каналов. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о возможной регуляции функций КСа-каналов катионными экзогенными РНКазами на трансляционном и транскрипционном уровнях.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Зеленихин Павел Валерьевич, Колпаков Алексей Иванович, Митькевич Владимир Александрович, Макаров Александр Александрович, Ильинская Ольга Николаевна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Влияние экзогенных бактериальных РНКаз на функционирование кальций-зависимых калиевых каналов в клетках эмбриональной почки человека»

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА

Том 151, кн. 3

Естественные науки

2009

УДК 577.29+615.015+616.006

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РНКаз НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ КАЛЬЦИЙ-ЗАВИСИМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ В КЛЕТКАХ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ПОЧКИ ЧЕЛОВЕКА

П.В. Зеленихин, А.И. Колпаков, В.А. Митькевич, А.А. Макаров, О.Н. Ильинская

Аннотация

Исследована связь между активностью Са2+-зависимых калиевых каналов (КСа-каналов), искусственно внесенных в клетки эмбриональной почки человека, и подверженностью данных клеток цитотоксическому действию катионных микробных РНКаз. Показано, что внесение экзогенной РНКазы в среду через 24 ч культивирования приводило к увеличению мембранного тока через Кса-каналы. Дальнейшее культивирование приводило к угнетению функций канальных белков. Удаление из среды культивирования РНКаз приводило к восстановлению активности К^-каналов. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о возможной регуляции функций К^-каналов катионными экзогенными РНКазами на трансляционном и транскрипционном уровнях.

Ключевые слова: бактериальные РНКазы, цитотоксичность, Са2+-зависимые калиевые каналы.

Введение

Токсическое действие экзогенных РНКаз на раковые клетки послужило толчком к изучению этих ферментов в качестве противоопухолевых препаратов. Значительный объем экспериментальных и теоретических данных, полученных в разных лабораториях и исследовательских центрах мира, существенно расширил представления о свойствах и механизмах действия цитотоксич-ных РНКаз. Тем не менее в силу многих причин говорить о массовом практическом применении противораковых препаратов на основе РНКаз пока преждевременно. На сегодняшний день известно значительное количество РНКаз, обладающих селективным цитотоксическим действием по отношению к клеткам опухолей [1-3]. Наиболее известным ферментом этого ряда является РНКаза лягушки Rana pipiens - онконаза [4] - перспективный препарат для терапии злокачественной мезателиомы легких, которая индуцирует апоптоз опухолевых клеток преимущественно по митохондриальному пути. РНКаза бычьих семенников (BS-РНКаза) индуцирует апоптоз клеток миелоидного лейкоза, нейроб-ластомы [5] и агрессивных субтипов опухолей щитовидной железы [6]. Рибо-нуклеаза Bacillus intermedius (биназа) индуцирует апоптоз клеток миелогенного лейкоза К562, не оказывая негативного влияния на нормальные лимфоциты периферической крови [7].

Несмотря на то что основной эффект взаимодействия клетки с экзогенной РНКазой состоит в деградации доступных клеточных РНК, необходимо отметить регуляторные эффекты продуктов этой деградации. Последние могут относиться к различным типам малых некодирующих РНК, способных влиять на процессы РНК-интерференции. На сегодняшний день многие описанные регуляторные эффекты экзогенных РНКаз объясняются именно их воздействием на образование или разрушение малых некодирующих РНК [8].

Известно, что антипролиферативное действие биназы на фибробласты, трансформированные онкогеном ras, ассоциировано с угнетением в них тока ионов через Са2-зависимые калиевые каналы [9], в то время как в нормальных клетках тесной связи между функционированием КСа-каналов и степенью токсического действия РНКазы на клетки не наблюдалось. В то же время показано, что КСа-каналы играют важную роль в реализации механизмов начальной стадии апоптоза [10]. Таким образом, КСа-каналы могут быть объектами направленного воздействия в терапии опухолевых заболеваний цитотоксичными РНКазами.

В настоящей работе исследованы изменения физиологической активности КСа-каналов, инициированные воздействием микробных РНКаз: биназы, РНКазы Streptomyces aureofaciens (РНКаза Sa) и ее катионного мутанта 5К.

1. Материалы и методы исследования

В работе использовали биназу - гуанилспецифичную РНКазу Bacillus intermedius 7Р дикого типа (молекулярная масса 12.3 кДа, 109 аминокислотных остатков, pI 9.5) [6], а также нативную РНКазу Sa (молекулярная масса 10.2 кДа, 96 аминокислотных остатков, pI 3.5) и ее мутантный вариант 5К (pI 9.1). Физико-химические и каталитические свойства биназы и РНКаз Sa и 5К охарактеризованы в [11-13].

Исследование эффектов РНКаз проводили на клетках эмбриональной почки человека (HEK293), в норме лишенных КСа-каналов. Клетки были трансфециро-ваны геном кальций-зависимых калиевых каналов hSK4, как это описано ранее [14]. Клетки выращивали в питательной среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma), 2 мМ глутамина, по 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина и 400 мкг/мл генецитина при 37 °С в атмосфере 6% СО2.

Мембранный ток отдельных клеток измеряли с помощью патч-кламп технологии, как это описано в [15]. Для определения значения тока измерения проводили для 9-15 клеток в серии.

Математическую обработку результатов цитометрии проводили с помощью Statistica 6.0, используя непараметрический критерий Манна - Уитни в качестве критерия достоверности. При этом р < 0.05 принимали за достоверный уровень значимости.

2. Результаты и обсуждение

При культивировании с биназой (300 мкг/мл) в течение 24 и 48 ч в популяции клеток HEKhSK4 происходило снижение количества клеток с активными Са -зависимыми калиевыми каналами. После 24 и 48 ч инкубации число клеток с активными КСа-каналами снизилось до 55% и 45% соответственно (рис. 1).

s

ч о

120 -,

100 -

80 -

60 -

40 -

20

24 ч

48 ч

Î

300

0 300

Концентрация биназы, мкг/мл

Рис. 1. Изменение доли клеток с активными КСа-каналами под действием биназы (300 мкг/мл) после 24 и 48 ч инкубирования. За 100% принято количество клеток с активными КСа-каналами в пробах необработанных биназой

с

bf о

H «

1200 -,

1000 -

800 -

600 -

400 -

200

□ Биназа

□ 5К

] РНКаза Sa

li

300

i

300 300 300

Концентрация РНКаз, мкг/мл

0

0

0

0

Рис. 2. Изменение К+ тока через КСа-каналы клеток НЕКИ8К4 под действием РНКаз (300 мкг/мл) после 24 и 48 ч инкубирования

Одновременно со снижением доли клеток, несущих активные КСа-каналы, в течение первых 24 часов культивирования с биназой происходило увеличение калиевого мембранного тока через эти каналы у клеток, их сохранивших. Значение К-тока у клеток, обработанных биназой, возрастало на 40% по сравнению с контролем. Через 48 ч культивирования значение К+-мембранного тока у клеток, имеющих активные КСа-каналы, в опытных пробах снижалось по сравнению с контролем на 25% (рис. 2). РНКаза 5К сходным образом изменяла калиевый ток через каналы клеток НЕКЪ8К4 через 48 ч культивирования, снижая его на 54%. Нецитотоксичная РНКаза 8а не вызывала снижения активности КСа-каналов после 48 ч совместного инкубирования (рис. 2). Поскольку ин-гибирование активности каналов было немгновенным и требовало времени, это

^ 120 -| 2 100 -| В0-| 6°, 2 40 -20 0

0 24 48

Время культивирования без РНКазы, ч

Рис. 3. Восстановления функций КСа-каналов клеток ИБКЬ8К4 после инкубации с РНКазой. Клетки культивировали с РНКазой 5К (300 мкг/мл) 96 ч, затем переносили в среду без РНКазы. За 100% принято значение мембранного тока контрольных клеток, не подвергавшихся обработке РНКазой

косвенно свидетельствует не о прямом ингибировании активности каналов РНКазами, а об опосредованном действии этих ферментов, возможно влияющих на экспрессию генов канального белка.

Данное предположение подтвердили результаты эксперимента по восстановлению функций КСа-каналов после инкубации с РНКазами. После инкубации с РНКазой 5К (300 мкг/мл) в течение 96 ч клетки ИБКЪ8К4 переносили в среду без РНКазы и регистрировали восстановление кальций-зависимого калиевого тока отдельных клеток. Полное восстановление функций КСа-каналов таких клеток происходило за 4 В ч (рис. 3). Полученные

результаты свидетельствуют о принципиальной роли Кса-ка-налов в проявлении цитотоксических эффектов РНКаз и должны быть учтены при разработке лекарственных препаратов на их основе.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (ГК № 02.512.12.2014), «Развитие научного потенциала высшей школы (РНП.2.1.1.1005), РФФИ (проект № 07-04-01051) и НИОКР АН РТ ГК 03-3.5.2/2008 (ФП).

I

Summary

P.V. Zelenikhin, A.I. Kolpakov, V.A. Mitkevich, A.A. Makarov, O.N. Ilinskaya. The Effect of the Exogenious Bacrerial RNase on Calcium-activated Potassum Channels in Human Em-brio Kidney Cells Functioning.

The connection between the action of cationic microbial RNases and Ca2+-activated K+ channel was investigated in human embrio kidney cells HEKhSK4 artificially expressing the channels. After 24 hours potassum current of RNase-treated cells increased, whereas after 48 hours the K+ membrane current significantly decreased. Removing the RNases from culture medium led to potassum channels reactivation. Basing on this pattern, we hypothesize that RNases downregulate KCa-channels at the level of transcription and translation.

Key words: bacterial RNases, cytotoxicity, Ca2+-activated K+ channels.

Литература

1. Leland P., Raines R. Cancer chemotherapy - ribonucleases to the rescue // Chem. Biol. -2001. - V. 8. - P. 405-413.

2. Spalletti-Cernia D., Sorrentino S., Gaetano S. Di, Piccoli R., Santoro V., D'Alessio G., Laccetti P., Vacchio G. Highly selective toxic and proapoptotic effects of two dimeric ribonucleases on thyroid cancer cells compared to the effects of doxorubicin // Brit. J. Cancer. Res. - 2004. - V. 90. - P. 270-277.

3. Ильинская О.Н., Макаров А.А. Почему рибонуклеазы вызывают гибель раковых клеток // Мол. биол. - 2005. - Т. 39, № 1. - С. 3-13.

4. Saxena S.K., Shogen K., Ardelt W. Onconase and its therapeutic potential // Lab. Med. -2003. - V. 34. - P. 380-387.

5. Marinov I, Soucek J. Bovine seminal ribonuclease induces in vitro concentration dependent apoptosis in stimulated human lymphocytes and cells from tumor cell lines // Neoplasma. - 2000. - V. 47. - P. 294-298.

6. Kochetkov R., Cinatl J., Krivtchik A.A., Vogel J.U., Matousek J., Pouckova P., Kornhu-ber B., Schwabe D., Cinatl Jr. Selective activity of BS-Rnase against anaplastic thyroid cancer // Anticancer Res. - 2001. - V. 21. - P. 1035-1042.

7. Zelenikhin P.V., Ilinskaya O.N., Petrushanko I.Y., Mitkevich V.A., Prassolov V.S., Ma-karov A.A. Binase induces apoptosis of transformed myeloid cells and does not induce T-cell immune response // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2007. - V. 361. - P. 10001005.

8. Ardelt B., Ardelt W., Darzynkiewicz Z. Cytotoxic ribonucleases and RNA interference (RNAi) // Cell Cycle. - 2003. - No 2. - P. 22-24.

9. Ilinskaya O.N., Koschinsky A., Mitkevich V.A., Repp H., Dreyer F., Pace C.N., Ma-karov A.A. Cytotoxity of RNases is increased by cationization and counteracted by K(Ca) channels // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2004. - V. 314. - P. 550-554.

10. Lang F., Shumilina E., Ritter M., Gulbins E., Vereninov A., Huber S.M. Ion channels and cell volume in regulation of cell proliferation and apoptotic cell death // Contrib. Nephrol. - 2006. - V. 152. - P. 142-160.

11. Sevcik J., Urbanikova L., Leland P.A., Raines R.T. X-Ray structure of two crystalline forms of a Streptomycete ribonuclease with cytotoxic activity // J. Biol. Chem. - 2002. -V. 277. - P. 47325-47330.

12. Schulga A., Kurbanov F., Kirpichnikov M., Protasevich I., Lobachev V., Ranjbar B., Chekhov V., Polyakov K., Engelborghs Y., Makarov A. Comparative study of binase and barnase: experience in chimeric ribonucleases // Protein Engin. - 1998. - V. 11. -P. 773-780.

13. Yakovlev G.I., Moiseyev G.P., Struminskaya N.K., Borzykh O.A., Kipenskaya L.V., Zna-menskaya L.V., Leschinskaya I.B. Mutational analysis of the active site of RNase of Bacillus intermedius (BINASE) // FEBS Lett. - 1994. - V. 354. - P. 305-306.

14. Ilinskaya O.N., Koschinski A., Repp H., Mitkevich V.A., Dreyer F., Scholtz J.M., Pace C.N., Makarov A.A. RNase-induced apoptosis: fate of calcium-activated potassium channels // Biochimie. - 2008. - V. 5. - P. 717-725.

15. Repp H., Birringer J., Koschinski A., Dreyer F. Activation of Ca2+-dependent K+ current in mouse fibroblasts by sphingosine-1-phosphate involves the protein tyrosine kinase c-Src // Arch. Pharmacol. - 2001. - V. 363. - P. 295-301.

Поступила в редакцию 27.04.09

Зеленихин Павел Валерьевич - кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры микробиологии Казанского государственного университета.

E-mail: pasha_mic@mail.ru

Колпаков Алексей Иванович - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией Биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии Казанского государственного университета.

E-mail: Alexei.Kolpakov@ksu.ru

Митькевич Владимир Александрович - кандидат химических наук, старший научный сотрудник Института молекулярной биологии РАН, г. Москва.

E-mail: vmitkevich@eimb.ru

Макаров Александр Александрович - доктор биологических наук, профессор, академик РАН, директор Института молекулярной биологии РАН, г. Москва.

E-mail: aamakarov@genome.eimb.relarn.ru

Ильинская Ольга Николаевна - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии Казанского государственного университета.

E-mail: Olga.Ilinskaya@ksu.ru

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.