CC BY
54
УДК 599:539.1.047 В.Ю. Сафонова
ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА ПИХТЫ СИБИРСКОЙ НА НЕКОТОРЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ И АУТОИММУННЫХ ПРОЦЕССОВ У ОБЛУЧЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
В статье приведены результаты исследований по практическому применению пихты сибирской для оздоровления облученных животных. Концентрированный экстракт зелени пихты сибирской в расчете 5-7 мл/кг с водой и кормом вводили крысам в течение недели до и после воздействия радиации в дозе 7 Грей (Гр). При этом установлено, что препарат обладает способностью регулировать антиокислитель-ные процессы в печени и сдерживать развитие аутоиммунных реакций в крови облученных животных. Полученные результаты могут быть использованы для практического применения экстракта зелени пихты сибирской с целью повышения радиорезистентности животных в экологически неблагоприятных условиях, связанных с повышенным радиационным фоном.
После аварии на Чернобыльской атомной электростанции возрос интерес к изысканию средств и методов профилактики, как хронической, так и острой лучевой патологии. Правильный подход к данной проблеме должен учитывать механизм действия радиации, который представляет собой сложную цепочку физических, физико-химических, химических и биологических процессов, возникающих в организме сразу после облучения.
Известно, что в результате воздействия ионизирующей радиации в организме животных и человека в период первичной реакции на облучение образуются свободные гидроксильные радикалы [1-2]. Они мгновенно, в течение 7Ч0-10с, вступают в реакции с белками, нуклеиновыми кислотами, липидами, разрушая клеточные структуры и способствуя дальнейшему образованию перекисей, альдегидов, кетонов, которые, в свою очередь, относятся к высокотоксичным соединениям [2-4]. В результате образуются модифицированные молекулы и клетки, которые, являясь для своего организма чужеродным материалом, вызывают развитие патологических аутоиммунных реакций, и, как следствие, геморрагического синдрома [5].
С целью профилактики острой лучевой патологии применяются фармакохимические соединения, механизм действия которых направлен на снятие негативных физико-химических и химических процессов, возникающих в организме в период первичной реакции на облучение. Зачастую эти препараты вводятся за короткое время перед облучением в высоких нефизиологических дозах и тем самым вызывают побочные эффекты в организме [6].
В последние годы для повышения, как общей резистентности, так и радиорезистентности организма, в народной медицине применяются препараты, называемые адаптогенами. Среди них особый интерес вызывают фитопрепараты природного происхождения, поскольку они более доступны, как правило, не токсичны, а потому их применение не вызывает дополнительных побочных эффектов в облученном организме [7-8].
В этом плане пихта сибирская вызывает определенный научный интерес, потому что обладает бактерицидными, фитонцидными свойствами, является экологически чистым сырьем для приготовления лекарственных препаратов в условиях нашей страны. Но вместе с тем в литературе отсутствуют сообщения о механизме ее радиозащитного действия и возможности применении ее для профилактики лучевой патологии.
Учитывая вышеизложенное, целью настоящей работы явилось изучение влияния экстракта зелени пихты сибирской на некоторые показатели окислительных и аутоиммунных процессов, возникающих в организме под воздействием ионизирующей радиации.
При этом надо было также изучить: 1) динамику малонового диальдегида (МДА) и глутатионредуктазы в печени; 2) динамику титров аутоантител и бляшкообразующих клеток в периферической крови облученных животных на фоне применения исследуемого препарата.
Материал и методика исследований. В работе использовали концентрированный экстракт зелени пихты сибирской. В составе его содержится комплекс растительных полифенолов, фитонцидные фракции, микроэлементы, витамины. Экстракт зелени пихты сибирской выпускается во флаконах темного цвета 200 мл по ТУ 8501-050-20680882-05. Изготовитель фирма «Биолит» г. Томск.
Опыты проведены на белых беспородных крысах-самцах с массой тела 180-210 г.
Животные по принципу аналогов были разделены на четыре группы: первая - биологический контроль; вторая - облученный контроль; третья - препарат ежедневно в течение 7 дней + облучение; четвертая - облучение + препарат ежедневно в течение недели. Концентрированный экстракт зелени пихты сибирской в объеме 5-7 мл/кг вводили крысам с кормом и водой вволю. Доза однократного воздействия ионизирующего излучения составляла 7 Гр. Облучение животных проводили на Y-установке «Агат-С» при мощности дозы 6 Гр/мин с источником излучения 60Со. Кормление и содержание всех подопытных крыс было однотипным и подчинялось нормативам, принятым для условий вивария. Кровь и печень для исследования брали при убое животных декапитацией под наркозом через 24 часа 5-ти и 10-ти суток после облучения. Выбранные сроки исследования отражают первичную реакцию на облучение (24 часа), латентный период и период разгара болезни соответственно. Количество лейкоцитов в периферической крови и их морфологический состав определяли общепринятыми методами исследования. Интенсивность перекисного окисления липидов по накоплению малонового диальдегида (МДА) и состояние антиоксидантной системы по активности глутатионредуктазы (ГР) в печени крыс определяли методами, описанными в источниках [9-10]. Титры аутоантител к лизату собственных эритроцитов (ЛСЭ) и количество бляшкообразующих клеток (БОК) в периферической крови определяли соответственно реакциями Уанье и Йерне в модификации Н.Н. Клемпар-ской [11]. Статистическую обработку полученных данных осуществляли по Стъюденту.
Результаты и их обсуждение. Результаты исследований картины периферической крови у крыс группы облученного контроля свидетельствовали о средней степени острой лучевой болезни. Так, количество лейкоцитов в данной группе животных на 5-е сутки после облучения понизилось на 85-90% по сравнению с аналогами группы биологического контроля. Изучение морфологического состава крови показало, что уменьшение произошло за счет лимфоцитов. Возникшим нарушениям в системе крови, как известно, предшествуют нарушения антиоксидантной системы организма [1-2; 12]. Гибель клеток крови, в частности, основных клеток иммунной системы - лимфоцитов, влечет за собой развитие, как вторичных иммунодефицитов, так и развитие аутоиммунных реакций [5; 13]. В результате развивается порочный круг лучевой патологии. Поэтому применение средств и методов, направленных на коррекцию антиоксидантной системы организма, вполне оправдано[14].
Данные исследований, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что однократное внешнее общее облучение крыс в дозе 7,0 Гр (ЛД50/30) подавляет активность глутатионредуктазы (ГР), которая является одним из компонентов антиоксидантной защиты организма, обладает способностью катализировать химические реакции, в результате которых токсичные свободные радикалы и перекиси превращаются в безвредные соединения. Недостаток ГР способствует тому, что в местах присоединения перекисных радикалов жирные кислоты разрываются на фрагменты, на краях которых расположены альдегидные группы, обладающие высокой реакционной способностью. Если разрыв произошел с двух сторон, образуется малоновый диальдегид, поэтому уровень МДА при лучевой патологии является информативным показателем процессов деградации липидов, свободно радикального окисления полиненасыщенных жирных кислот биомембран гепатоцитов. Следовательно, снижение активности антиоксидантного фермента влечет за собой достоверный прирост малонового диальдегида [15].
Результаты наших исследований, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что активность ГР у животных группы облученного контроля по сравнению с биологическим контролем понижается во все сроки исследования с более достоверной разницей (38%) на 5-7-е сутки после облучения. При этом концентрация МДА в печени крыс этой группы достоверно возрастает во все сроки исследования, отражающие период первичной реакции на облучение (24 часа), латентный период (5-е сутки) и разгар болезни (10-е сутки). Приведенные результаты еще раз подтверждают то, что в организме облученных животных нарушается антиоксидантная система.
Введение крысам с водой и кормом экстракта зелени пихты сибирской за 7 дней до облучения способствовало коррекции этих показателей. Прирост МДА в опытной группе наблюдался, но был достоверно ниже, чем в облученном контроле в указанные периоды на 44,5, 27 и 32,4% соответственно. Следовательно, у животных данной группы сохранялась активность ГР, которая не позволяла накапливаться МДА в более высоких концентрациях, характерных для животных незащищенной второй группы. Так, через 1, 5, 10 суток у крыс третьей опытной группы содержание антиоксидантного фермента было достоверно выше по сравнению с животными группы облученного контроля.
Введение экстракта зелени пихты сибирской животным после облучения в течение 5-7 суток также вызывало эффект коррекции показателей антиоксидантной защиты организма, но было несколько слабее эффекта приема данного препарата перед облучением, о чем свидетельствуют данные, приведенные в таблице. Вероятно, это связано с уже развившимися нарушениями в антиоксидантной системе, которые проис-
ходят в считанные секунды и минуты после облучения. Поэтому радиозащитный эффект вводимого препарата ослабевает.
Показатели антиокислительных процессов и аутоиммунных реакций у облученных и защищенных экстрактом пихты сибирской крыс
Показатель Группа Срок исследования (сутки)
1 5 10
Содержание малонового 1 б.к. 2,20±0,05 2,22±0,05 2,30±0,12
диальдегида, 2 5,24±0,12* 5,12±0,04* 3,80±0,02*
н-моль/1г ткани 3 2,86±0,02** 3,02±0,22** 2,57±0,17
4 - 3,80±0,24** 3,07±0,12
Содержание глутатионре- 1 б.к. 14,22±0,32 14,22±0,32 14,22±0,32
дуктазы, 2 7,78±0,20* 8,84±0,22* 9,02±0,34*
Н-моль НАДФ'Н2/1мг ткани 3 12,60±1,42** 12,92±1,70** 13,90±0,34**
за 1 мин 4 - 11,72±0,46** 12,24±0,20**
Титры аутоантител к ЛСЭ, 1 б.к. 0,26±0,09 0,22±0,09 0,26±0,07
балл 2 2,42±0,42* 3,20±0,28* 2,60±0,05*
3 2,02±0,02 1,80±0,08** 1,20±0,04**
4 - 2,02±0,06 1,26±0,04**
Содержание БОК в крови, % 1 б.к. 1,80±0,13 1,60±0,06 1,46±0,12
2 3,34±0,13* 5,80±0,16* 3,90±0,06*
3 2,90±0,09** 3,30±0,06** 3,20±0,09
4 - 3,26±0,08** 2,92±0,21
* - достоверная разница с биологическим контролем; ** - достоверная разница с облученным контролем.
Результаты исследований, приведенные в таблице, свидетельствуют также и о том, что в норме у крыс обнаруживаются антитела к ЛСЭ, оцениваемые реакцией Уанье как «следы». Облучение в дозе 7,0 Гр (ЛД50/30) вызывает накопление аутоантител в периферической крови облученных животных с оценкой реакции как «положительная» и «резкоположительная». Резко положительных значений (3-4 балла) у крыс облученного контроля реакция Уанье достигала на 5-е сутки после воздействия радиации.
Применение экстракта пихты сибирской оказывало влияние на образование антител к лизату собственных эритроцитов. Как следует из таблицы, титры аутоантител к ЛСЭ были ниже у крыс 3-4-й группы, принимавших препарат до и после облучения, по сравнению с аналогами облученного контроля. Такая положительная особенность отмечалась у защищенных крыс на 5-е и на 10-е сутки после облучения.
Клетки-продуценты аутоантител в периферической крови у интактных крыс регистрировались в пределах 1-2%. Воздействие радиации в дозе 7 Гр увеличивало их содержание во все сроки исследования. Так, количество бляшек лизиса эритроцитов периферической крови на 1, 5, 10-е сутки после облучения у крыс группы облученного контроля достигало 3,34±0,13; 5,80±0,16; 3,90±0,06%%, что было достоверно выше по сравнению с биологическим контролем. Большая разница отмечалась на 5-е сутки после облучения, что имело прямую корреляцию с титрами аутоантител к лизату собственных эритроцитов.
Введение экстракта пихты сибирской крысам с водой и кормом способствовало ослаблению аутоиммунных реакций. Разница в титрах аутоанатител к ЛСЭ и в количестве БОК в крови у животных 3-4-й групп, которым вводили препарат до облучения и после облучения, была достоверной в сроки, характеризующие латентный период (5-е сутки) и разгар болезни (10-е сутки).
Можно считать, что применение исследуемого препарата сдерживает реакцию цепного окисления липидов, инициируемую ионизирующим излучением и играющую важную роль в патологии и гибели клеток. В результате понижается значимость такой реакции, способствующей массовому накоплению избытка токсических продуктов окисления липидов. Доказательством тому служат полученные данные по относительной нормализации антиоксидантной защиты, характеризующейся оптимальным содержанием малонового диальдегида и глутатионредуктазы.
Существует прямая связь между окислительными процессами и развитием аутоиммунных реакций, обусловленных накоплением модифицированных молекул и погибших клеток в облученном организме. В
результате происходит «возмущение» иммунной системы. Она реагирует экстренной выработкой антител к чужеродным аутоантигенам. Образуются циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), а если не срабатывают клеточные факторы иммунитета, то ЦИК фиксируются на стенках сосудов, вызывая их повреждение. В этой части исследований показано положительное влияние исследуемого продукта природного происхождения на процессы аутоиммунизации организма облученных крыс.
Таким образом, внешнее общее однократное облучение крыс ЛД50/30 сопровождается подавлением антиоксидантной защиты организма, что проявляется снижением глутатионредуктазы и нарастанием концентрации в печени МДА. Указанная доза ионизирующего излучения способствует развитию резкоположительной реакции Уанье к ЛСЭ и достоверному повышению клеток лизиса эритроцитов крови по сравнению с биологическим контролем.
Ежедневное, в течение недели до облучения, введение крысам экстракта зелени пихты сибирской в дозе 5-7 мл/кг с водой или кормом обеспечивает достоверную коррекцию показателей антиоксидантной защиты, что проявляется повышением активности глутатионредуктазы и понижением концентрации в печени МДА. Одновременно с этим понижаются титры аутоантител к ЛСЭ и количество клеток, способных лизиро-вать эритроциты крови. Применение препарата в течение 5-7 дней после облучения дает положительный эффект, но не столь эффективный.
Ко всему этому следует добавить, что животные, в частности, крысы, подвергнутые воздействию внешней радиации, являются удобной экспериментальной моделью для определения антиоксидантных, иммуномодулирующих свойств различных фармакологических препаратов, предназначаемых для применения в медицине и ветеринарии.
Литература
1. Кудряшов, Ю.Б. Радиационная биофизика / Ю.Б. Кудряшов. - М.: Физматлит, 2004. - 448 с.
2. Кудряшов, Ю.Б. Основные принципы в радиобиологии / Ю.Б. Кудряшов // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2001. - Т. 41. - № 5. - С. 531-547.
3. Gutterdge, J.M.C. Superoxide-dependent lipid peroxidation. Problems with the use of catalase as a specific
probe for feuton-derived hydroxyl radicals / J.M.C. Gutterdge, A.P.C. Beard, G.J. Quinlan // Biochem. Biophys.
Res. Commun. - 1983. - V. 117. - № 3. - P. 901-907.
4. Halliwell, B. Oxygen radicals and tissue damag / B. Halliwell// J. Mol. Cell. Cardiol. - 1981. - V. 13. - Suppl. 1.
- P. 36.
5. Клемпарская, Н.Н. Аутоантитела облученного организма / Н.Н. Клемпарская. - М.: Атомиздат, 1982.
- 156 с.
6. Владимиров, В.Г. Радиопротекторы - структура и функции / В.Г. Владимиров, И.И. Красильников,
О.В. Арапов. - Киев: Наук. думка, 1989. - 259 с.
7. Кудряшов Ю.Б., Гончаренко Е.Н. // Радиац. биология. Радиоэкология. - 1999. - Т. 39. - № 2-3. - С. 197-211.
8. Гулик Е.С., Костеша Н.Я. // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2004. - Т. 44. - № 5. - С. 563-565.
9. Методы биохимических исследований / под ред. М.И. Прохоровой. - Л.: Изд-во ЛГУ, 1982. - 272 с.
10. Современные методы в биохимии / под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - 391 с.
11. Клемпарская Н.Н., Раева Н.В. // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 1981. - Т. 51. - № 5. - С. 77-81.
12. Сазонтова Т.Г., Анчишкина Н.А., Архипенко Ю.В. // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2007. - Т. 143. -№ 4. - С. 378-382.
13. Ярилин, А.А. Радиация и иммунитет / А.А. Ярилин // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1997. -Т. 37. - Вып. 4. - С. 597-602.
14. Орехова, Н.А. Антиоксидантный статус как модель для исследования радиорезистентности организма / Н.А. Орехова, Л.Н. Расина // Физика в биологии и медицине: сб. тр. - 2001. - С. 120-123.
15. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М.: Наука, 1972. - 252 с.
