CC BY
84
УДК 581.192.547 ББК28.4
ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАГЕНТОВ НА СОСТАВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В ЭКСТРАКТАХ ИЗ КОРНЕЙ И КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ PAEONIA ANOMALA L.
Зарипова А. А., Шаяхметов И. Ф., Баширова Р. М., Байбурина Р. К.*
Изучено содержание пеонифлорина в растительных экстрактах Р. anómala. Показано, что каллусная ткань пиона уклоняющегося и растения-регенеранты являются перспективными продуцентами фенольных соединений. Экстракты, полученные из корней растений-регенерантов и каллусной ткани не уступают по содержанию биологически активных веществ экстрактам корневищ растений из природного местообитания. Использование этанола в качестве экстрагента является наиболее перспективным для получения действующих веществ из биомассы культивируемых in vitro тканей.
Наряду с поисками новых лекарственных растений проводится углубленное изучение ранее известных фармакоп ейных растений, их интродукция и введение в культуру in vitro. К таким растениям относится пион уклоняющийся Paeonia anómala L. (syn. P. sibirica Pallas) - ценное лекарственное растение семейства пионие-вых Paeoniaceae. Растение широко исп ользуется в народной медицине Западной Сибири п од названием «Марьин корень» в качестве противовоспалительного, протистоцидного, бактерицидного средства при желудочно-кишечных заболеваниях [1]. В государственный реестр лекарственных средств включены как корневища и корни (№ 95/124/6), так и трава P. anómala (№ 72/736/2/7) [2]. В научной медицине исп ользуют 40 % сп иртовую настойку из равных п о массе сухих надземных и п одземных частей п иона ук-
лоняющегося (Tinctura Paeoniae) как седативное средство при неврастении, вегетативнососудистой дистонии и др. P. anómala входит в состав п ищевой добавки «Нейростабил» рекомендуемой при нарушениях функциональной активности желудка и п ечени, нервных и простудных заболеваниях [3].
Лечебные эффекты корня пиона связаны с наличием в нем 1,10-1,59 % эфирного масла, содержащего более чем 30 ком п онентов. Считают, что ведущую роль в фармакологической активности экстрактов Paeonia играет монотерп е-новый гликозид - п еонифлорин, содержание которого колеблется от 0,05 до 6,01 % [4]. В Я п о-нии п одлинность сырья оценивается п о наличию п еонифлорина и его бензоил- и окси п роизводных [5], рассматриваемых как п ерс п ективное средство п рофилактики старческого слабоумия [б].
COCK
оск
но
Апиопионозид Галлопеонифлорин
*
Зарипова Альфия Ануровна - младший научный сотрудник Ботанического сада-института УНЦ РАН.
Ш аяхметов Изгам Фазлиахметович - профессор кафедры биохимии и биотехнологии БашГУ.
Баширова Раиса Миннуловна - доцент кафедры физиологии растений БашГУ
Байбурина Рима Кашафовна - старший научный сотрудник, зав. лабораторией морфогенеза и биотехнологии растений Ботанического сада-института УНЦ РАН
Монотер п еновые гликозиды представляют собой пролонгированные, п олифункциональные антибиотики, при расще плении которых высвобождаются как соединения бензойной и галловой кислот, п одавляющие п атогенную кишечную микрофлору, так и монотерп еноиды, оказывающие антисп астическое и п ротивовос-п алительное действие [5]. Производные п еонифлорина как в свободном виде, так и в форме соединений с галлотанинами ингибируют агрегацию тромбоцитов, вызванную тромбином, арахидоновой кислотой и коллагеном. Пион широко п рименяется в составе ге п ато п ротекторных и п ротивоо п ухолевых сборов [7].
Основным п ре пятствием для расширения производства преп аратов на основе пиона уклоняющегося является дефицит сырья, более того пион занесен в «Красную книгу СССР» [8]. Для увеличения сырьевой базы P. anomala необходимо введение растения в культуру, в том числе с исп ользованием биотехнологических методов.
В связи с тем, что закономерности синтеза вторичных метаболитных соединений в клетках in vitro отличаются от таковых в интактных растениях, а установленные закономерности этого п роцесса в культуре клеток п ротиворечивы, п еред нами была п оставлена задача п ровести сравнительное изучение содержания биологически активных веществ в растительных тканях интактного растения и биомассе культуры in vitro с исп ользованием различных экстрагентов.
Материалы и методы исследований
Объектом исследования служили:
1) корни P. anomala генеративного п ериода развития из природного местообитания (контроль); 2) корни молодого генеративного растения, интродуцированного в Ботаническом саду Уфимского научного центра РАН; 3) корни растения-регенеранта п регенеративного п ериода развития; 4) каллусная ткань, п олученная из почки возобновления.
P. anomala был интродуцирован в Уфимский Ботанический сад-институт РАН из Татышлинского района республики Башкортостан. Стерилизацию сред, растительного материала проводили п о стандартным методикам. В качестве экс п ланта для п олучения каллусной ткани исп ользовали п очки возобновления, которые культивировали на агаровой среде Мурасиге и Скуга с содержанием сахарозы 3%.
Образцы тканей растений растирали и экстрагировали гидрофобные вещества в течение суток хлороформом, п осле чего экстрагировали производные п еонифлорина и фенольные соединения с исп ользованием в качестве экстрагента метанол и этанол. Содержание п еонифлорина оценивали на основании п рямо-го с п ектрофотометрирования метанольных и этанольных экстрактов при длине волны 231,7 нм (е 1% 1 см= 265.4) [5]. Содержание флавоноидов о п ределяли п о цветным комплексным соединениям с хлористым алюминием. Содержание катехинов в сравниваемых образцах оценивали п о реакции с ванилином п ри л=500 нм [9]. Содержание п еоновых лактонов оценивали в метанольном экстракте исп ользуя реакцию с пикратом.
Интегральную характеристику п олученных экстрактов п роводили п утем сравнения с п ектров п оглоще-ния на сп ектрофотометре СФ-121 в диа п азоне волн 200-350 нм.
Результаты и обсуждение
Кривые светоп оглощения метанольных экстрактов имели два четко выраженных пика п ри л=232 и л=275 нм характерные для п еонифлорина (рис.1), п ричем в корнях растений, п олученных из природных местообитаний содержание этого тер п енового гликозида было минимальным.
74 Вф =*■
90ft4d,
Рис. 1. С п ектры п оглощения экстрактов P. anomala в метаноле
Судя п о о птической плотности метанольного экстракта, в корнях молодых растений содержание п еонифлорина было на 80 % выше, чем в контрольном растении. Как известно, максимальное содержание гли-козидов сосредоточено снаружи камбия в клетках вторичной флоэмы [10]. Следовательно в тонких, разветвленных корнях содержание гликозидов выше, чем в толстых. В каллусной культуре содержание этого гликозида было выше, чем в корнях дикорастущих растений на 44 %, и на 26 % ниже чем в корнях расте-ний-регенерантов.
'1-Ч i. ■ ■ i.-.'. J-
Рис.2. Спектры поглощения экстрактов Р. anómala в этаноле
Использование этанола в качестве экстрагента показало более высокую оптическую плотность экстракта из каллусной ткани (рис.2). Сравнение спектров поглощения метанольных и этанольных экстрактов из разных тканей пиона показывает, что метанол обладает высокой экстрагирующей способностью обеих фракций фенольных соединений. В этанольном же экстракте наиболее полно представлены соединения из каллусной ткани, тогда как вещества из корней с максимумом спектра поглощения при 275 и 290 нм представлены в незначительном количестве. Это свидетельствует о том, что биологически активные вещества из тканей интактного растения плохо экстрагируются этанолом, особенно те, которые соответствуют второму пику с максимумом поглощения 290 нм.
Сравнение полученных спектров в области, соответствующей поглощению фенольных соединений, показывает наиболее высокое содержание фенольных соединений в корнях молодых растений. Судя по максимуму светопоглощения это могут быть фенольные кислоты. Наименьшее содержание низкомолекулярных фенольных соединений отмечено в корнях взрослых растений, где визуально отмечается высокое содержание флобафенов. Очевидно, что с возрастом растения накапливают более конденсированные фенольные соединения. Как известно, в китайской медицине используют корни диаметром 4-6 см, в которых сформировались морфологические структуры, накапливающие флобафены [11].
Высокое содержание фенольных соединений отмечено в молодых корнях и каллусной ткани. Очевидно, это связано с тем, что именно эти образцы тканей характеризуются самой высокой удельной поверхностью, где и сосредоточено максимальное количество фенольных соединений. Следует отметить, что способность более активно синтезировать танниновые производные пентагаллоилглюкозы в культуре ткани нежели в интактном растении отмечена также у представителя кизиловых - Cornus officinalis [12]. Соответственно экстракты поверхностной части корня Р. suffruticosa ингибируют эластазную активность более эффективно, нежели экстракты целостного корня [13].
Сопоставление оптических свойств сравниваемых экстрактов после внесения пикрата натрия, реагирующего с лактонным кольцом, позволяет сделать вывод, что содержание пеонолактонов в них существенно не отличается.
Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что каллусная культура Р. anómala является перспективным продуцентом монотерпеновых гликозидов и фенольных соединений. Метанольные экстракты, полученные из корней регенерантов и каллусной культуры, не уступают по содержанию биологически активных веществ экстрактам корневищ дикорастущих и интродуцированных растений. Учитывая, что в медицинской практике используют этанольные экстракты пиона, можно заключить о целесообразности получения действующих веществ из биомассы культивируемых in vitro тканей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Минаева В. Г. Пион марьин корень - Paeonia anómala L. // Лекарственные растения Сибири. Новосибирск. Наука. 1991. С. 146-148.
2. Государственный реестр лекарственных средств. М. МЗРФ. 2000.
3. Пилат Т. Л., Иванов А А. Биологически активные добавки к пище (теория, производство, применение). М. Аваллон, 2002 С. 328.
4. Radix Paeoniae. WHO monographs Reports on selected medicinal Plants. Geneva. P. 195 -201.
5. Koide T, Iwata M, Saito H, Tanimoto [Paeoniflorin Reference Standard (Control 011) of National Institute of Health Sciences]//Kokuritsu lyakuhin Shokuhin Eisei Kenkyusho Hokoku. 2002; (120), p. 124127.
6. Ohta H. et al. Paeoniflorin attenuates learning impairment of aged rats in operant brightness discrimination task//Pharmacology, biochemistry and behavior. 1994. 49. Р. 213-217.
7. Oh G. S., Рае Н.О., Oh H.et al. In vitro antiproliferative effect of 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose on human hepatocellular carcinoma cell line, SK-HEP-1 cells // Cancer letters, 2001, 174(1), P. 17-24.
8. Красная книга СССР: Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды животных и растений. Т. 2 / Главная ред. коллегия: А. М. Бородин, А. Г. Банников, В. Е. Соколов и др. - Изд. 2е, перераб. и доп. -Лесн. Пром-сть, 1984. -480 с.
9. Ferreira E. C., Nogueira A. R. Vanillin-condensed tannin study using flow injection spectrophotometry//Talanta. 2000. 51. P.1-6.
10.Shan S.-J., Waporin P., Fukuda et al. Elisa, Western Blotting, Immuonolocalization and Immu-noaffinity Column for naturally occurring bioactive compounds using monoclonal antibodies // J.of food and drug analysis. 2000. Vol.8, N4, P.258-269.
11. Paeony (Paeonia spp.) // Alternative medicine review. 2001. Vol. 6, N 5, P. 495 - 499.
12.Jazaki K., Okuda T. Gallotanin production in cell cultures of Cornus officinalis Sieb. Et Zucc. //
Plant cell repts. 1989. Vol. 8, P. 346-349.
13.Lee K.-K., Kim J.H., Cho J.J. et al. Inhibitory effects of 150 plant extracts on elastase activity, and
their anti-inflammatory effects // International j. of cosmetic science. 1999. 21. P. 71 - 82 .
