CC BY
88
УДК 547.587
ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАГЕНТА НА КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ ФЕНОЛЬНОГО КОМПЛЕКСА, ИЗВЛЕКАЕМОГО ИЗ КОРЫ ЛИСТВЕННИЦЫ ГМЕЛИНА
© И.И. Гордиенко, Т.Е. Федорова , С.З. Иванова, В.А. Бабкин
Иркутский институт химии СО РАН, ул. Фаворского, 1, Иркутск, 664033 (Россия) E-mail: babkin@irioch.irk.ru
Исследовано влияние экстрагента (растворителей - этилацетата, ацетона, метанола) на выход экстрактивных веществ и количественное соотношение фракций соединений в составе фенольного комплекса коры лиственницы Гмели-на (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr,),
Ключевые слова: лиственница Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.), кора, фенолокислоты, флавоноиды, хроматография.
Введение
Кора лиственницы Гмелина - богатый источник многих уникальных природных биологически активных соединений (терпеноиды, стерины, углеводороды, фенолокислоты, флавоноиды, спирофлавоноиды, танни-ны, пектин и др.) [1-3].
Ранее был разработан способ выделения из коры лиственницы фитокомплекса, который при предварительном тестировании проявил антиоксидантную активность в 1,5 раза выше, чем дигидрокверцетин [4]. Дальнейшие исследования химического состава полифенольного комплекса (ПФК) коры лиственницы показали, что он является сложной смесью фенольных соединений [1], которые условно можно разделить на группы: фенолокислоты и их эфиры; мономерные флавоноиды; спирофлавоноиды; олигомерные и полимерные флавоноидные соединения.
Задача настоящей работы - исследование влияния экстрагента на выход экстрактивных веществ и количественный групповой состав ПФК коры лиственницы Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.).
Экспериментальная часть
В работе использована кора лиственницы Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.), отобранная в п. Бада Хилокского района Читинской области в ноябре 2005 г. Экстрактивные вещества извлекали из измельченной коры (размер частиц 10-15 мм, влажность 3,5%) трехкратной экстракцией различными растворителями (метанол, ацетон, этилацетат) при комнатной температуре в течение 3-4 суток. Экстракты концентрировали на роторном испарителе (t = 40 °C) и сушили в вакуум-эксикаторе.
Для удаления липидной части экстракты последовательно обрабатывали неполярными растворителями (гексан, хлороформ).
Для фракционирования полифенольного комплекса использовался метод флеш-хроматографии [5]. Условия проведения флеш-хроматографии (сорбент, соотношение вещество-сорбент, скорость элюирования) и системы растворителей для разделения ПФК были подобраны экспериментально. Для фракционирования 1 г ПФК в качестве сорбента использовался силикагель (1,5 г силикагеля с размером частиц 5-40 ц для предварительного адсорбирования исходной смеси фенольных соединений, 18 г с размером 40100 ц для колонки), в качестве элюента использовались смеси хлороформ-метанол с увеличением доли последнего (от
* Автор, с которым следует вести переписку.
0 до 100%), скорость элюирования 1,5-1,7 мл/мин, общее время хроматографирования составляет 7,5-8 ч. При этом были получены следующие фракции, содержащие: I - фенолокислоты и их эфиры (0-5% СН3ОН в СНС13); II - мономерные флавоноиды (10-15% СН3ОН в СНС13); III - спиробифлавоноиды (15-20% СН3ОН в СНС13), IV - олигомеры, полимеры (30-100% СН3ОН в СНС13).
Анализ полученных фракций проводили методом ТСХ на пластинках БПиМ в системе бензол-ацетон (1,5 : 1; 1 : 1), проявитель - диазотированная сульфаниловая кислота, А1С13.
Для получения количественных данных использовался средний результат от 3-х параллельных опытов.
Обсуждение результатов
Ранее нами были проведены исследование химического состава и подробная систематизация флавоноидных соединений коры лиственницы сибирской и Гмелина [1, 2, 6]. Было показано, что в коре присутствуют представители практически всех классов флавоноидов, начиная от флаванона нарингенина до бифлавоноидов, проанто-цианидинов и конденсированных таннинов. В ходе исследований химического состава фенольных соединений коры лиственницы было идентифицировано несколько новых соединений: впервые обнаружены сложные эфиры транс-п-кумаровой кислоты и высших н-алифатических спиртов с доминирующим содержанием эйкозанола [7], установлено строение целого ряда флавоноидных соединений спиротипа - спиробифлавоноидов лариксидинола и ларизинола, тримера - трифлариксинола [8-11]. Отмечено, что по типу гидроксилирования кольца В фенольные соединения коры лиственницы можно отнести к двум основным группам: п-гидроксифенильному (моноза-мещенному) и пирокатехиновому (дизамещенному), с преобладанием первого [1].
С помощью хроматографических методов ПФК можно разделить на фракции !-^. Используя комплекс физико-химических методов анализа, идентифицировали основные соединения, входящие в состав этих фракций (табл. 1).
Чтобы оценить возможность получения новых биологически активных препаратов на основе ПФК (с различным количественным соотношением фракций и, возможно, различным физиологическим действием в целом) исследовали влияние экстрагента на компонентный состав выделяемого фитокомплекса.
В качестве экстрагентов использовали три органических растворителя - этилацетат, ацетон, метанол.
Как видно из таблицы 2, при экстрагировании коры лиственницы этилацетатом и ацетоном выход экстрактивных веществ примерно одинаков. При использовании метанола выход веществ снизился на ~ 2%. Это может быть обусловлено тем, что метанол, как наиболее полярный из применяемых растворителей, меньше извлекает из коры липидные соединения. Действительно, после удаления липидной части выход ПФК для всех используемых растворителей оказался примерно одинаков (табл. 2).
Для фракционирования ПФК использовался метод флеш-хроматографии [5]. Условия хроматографирования, позволяющие разделять ПФК на фракции были определены экспериментально. В таблице 3 представлены данные по количественному соотношению фракций в составе ПФК коры лиственницы, полученных с использованием различных экстрагентов.
Данные таблицы 3 демонстрируют существенное влияние экстрагента на соотношение компонентов в получаемых фенольных комплексах. При увеличении полярности применяемого растворителя в ПФК увеличивается содержание олиго-, полимерной фракции и уменьшается содержание фракций мономерных и спирофлавоноидов. Это согласуется с литературными данными, согласно которым эфиры оксикоричных кислот, флавоноиды и димерные проантоцианидины обладают хорошей растворимостью в этилацетате [12, 13], а ацетон и метанол обладают избирательным действием по отношению к конденсированным таннинам -лучше растворяют полимерные флавоноидные соединения [14].
Этилацетатный ПФК отличается наиболее высоким содержанием фракций фенолокислот и их эфиров и мономерных флавоноидов. Согласно литературным данным, коричные кислоты обладают высокой антиоксидант-ной и мембраностабилизирующей активностью, входят в состав противовоспалительных средств и препаратов, уменьшающих токсические явления при химиотерапии [15], используются в ряде косметических средств [16].
Фармакологическое действие мономерных флавоноидов чрезвычайно разнообразно. В настоящее время они входят в состав иммуностимулирующих, противоопухолевых, кардио-, радио-, гепато- и геропротекторных, ан-титромбоцитарных, противоаллергических и противовирусных препаратов [17]. основным мономерным флаво-ноидным соединением коры лиственницы является дигидрокверцетин (ДКВ), обладающий широким спектром биологической активности. При проведении полного фармакологического скрининга установлено наличие у ДКВ антиоксидантных и капилляропротекторных свойств в сочетании с противовоспалительным, гастро- и гепа-топротекторным, гиполипидемическим, диуретическим и радиопротекторным действием [18].
Таблица 1. Компонентный состав фракций полифенольного комплекса (ПФК) коры (ритидома) лиственницы Гмелина
Фракция Соединения
I - фенолокислоты и их эфиры II - мономерные флавоноиды III - спирофлавоноиды IV - олигомеры, полимеры Кислоты: п-оксибензойная, протокатеховая, ванилиновая, п-кумаровая, кофейная, феруловая; алкилкумараты, алкилферулаты нарингенин, кемпферол, кверцетин, дигидрокемпферол, дигидрокверцетин, (-)-эпиафцелехин, (+)-катехин, (-)-эпикатехин лариксинол, лариксидинол, ларизинол, трифлариксинол олигомеры, конденсированные таннины
Таблица 2. Выход экстрактивных веществ и ПФК, % от массы а.с. коры
Растворитель Выход экстрактивных веществ, % от массы а.с. коры Выход ПФК, % от массы а.с. коры
Этилацетат 11,8 8,1
Ацетон 11,1 8,3
Метанол 9,4 7,6
Таблица 3. Количественное соотношение фракций в ПФК, %отн.
Содержание фракции в ПФК, %отн.
Растворитель фенолокислоты и их эфиры мономерные флавоноиды спирофлавоноиды олигомеры, полимеры
Этилацетат 8,1 11,0 38,5 42,4
Ацетон 6,7 8,3 24,4 60,6
Метанол 7,5 6,3 19,1 66,9
Содержание спирофлавоноидной фракции в этилацетатном ПФК близко к содержанию олиго-, полимерной фракции. Спирофлавоноиды - это новый класс флавоноидных соединений, и к настоящему времени известно лишь 10 спирофлавоноидов, четыре из которых выделены из коры лиственницы сибирской и Гмелина [1, 8-11]. Биологическая активность этих соединений не изучалась, возможно, ввиду малых количеств выделенных спиро-бифлавоноидов (десятки миллиграм) и небольшого их содержания в растительных источниках. Высокое содержание спиробифлавоноидных соединений в коре лиственницы позволяет выделить их в достаточном количестве и получить информацию о биологических свойствах этого уникального класса флавоноидных соединений.
Таким образом, каждый из компонентов ПФК обладает индивидуальным фармакологическим действием. однако, возможно, высокий лечебный эффект фенольного комплекса достигается не только за счет действия его отдельных компонентов, но и синергизма компонентов.
Согласно токсико-фармакологическим исследованиям, выполненным в лаборатории фармакологии НИОХ СО РАН, антиоксидантный комплекс, выделенный этилацетатом из коры лиственницы, обладает выраженной каппиляроукрепляющей активностью, превосходящей активность дигидрокверцетина в 1,2-1,4 раза, высоким гастро- и гепатозащитным эффектом, достоверно увеличивает резервы системы антиоксидантной защиты организма, обладает дозазависимым стимулирующим влиянием на центральную нервную систему [18].
Доминирующей фракцией в ацетоновом и метанольном экстрактах является фракция олигомерных и полимерных флавоноидов. Ранее нами было показано, что олигомерная фракция флавоноидных соединений коры лиственницы состоит из процианидиновых (РС) (пирокатехиновый тип замещения кольца В) и пропеларгони-диновых (РР) модулей (п-гидроксифенильный тип замещения кольца В) в количественном соотношении 1:3. Было установлено, что бифлавоноиды спиротипа присутствуют в олиго- и полимерных флавоноидных соединениях как структурные звенья. Таким образом, олигомерные и полимерные флавоноиды коры лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина являются продуктом конденсации флаван-3-олов [(-)-эпиафцелехина, (+)-катехина, (-)-эпикатехина] и димеров спиротипа [1].
Известна биологическая активность комплексов олигомерных и полимерных проантоцианидинов - полимеров на основе (+)-катехина и (-)-эпикатехина, производимых из экстракта коры французской сосны (пикногенол - РУС) и экстракта косточек винограда [19-21]. Исследования показывают, что компоненты РУС высокобиодоступны. РУС оказывает положительное влияние на сердечно-сосудистую систему (вазоре-лаксантная активность) и способен усиливать капиллярное кровообращение (микроциркуляцию), увеличивая капиллярную проницаемость, обладает высокой антирадикальной активностью [19].
Таким образом, полученные результаты показывают, что полифенольные комплексы, выделяемые из коры лиственницы Гмелина, могут являться аналогами таких биологически активных добавок, как пикноге-нол. В дальнейшем планируется исследование биологической активности отдельных фракций ПФК и комплексов фенольных соединений в целом. Установлено, что использование различных экстрагентов позволяет получать из коры лиственницы биологически активные фитокомплексы с количественным преобладанием тех или иных фракций и, возможно, обладающих различной физиологической активностью.
Выводы
Исследовано влияние различных экстрагентов (этилацетата, ацетона, метанола) на выход экстрактивных веществ и количественное соотношение фракций соединений в составе фенольного комплекса коры лиственницы Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.). Показано, что использование различных растворителей позволяет получать из коры лиственницы биологически активные комплексы полифенольных соединений с количественным преобладанием тех или иных фракций и, возможно, обладающих различной физиологической активностью.
Список литературы
1. Иванова С.З., Федорова Т.Е., Иванова Н.В., Федоров С.В. и др. Флавоноидные соединения коры лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина // Химия растительного сырья. 2002. №4. С. 1-15.
2. Бабкин В.А., Остроухова Л.А., Иванова С.З., Иванова Н.В. и др. Продукты глубокой химической переработки биомассы лиственницы. Технология получения и перспективы использования // Российский химический журнал. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д. И. Менделеева). 2004. Т. XLVIII. №3. С. 62-69.
3. Черненко Г.Ф., Шмид Э.Н. Нейтральные экстрактивные вещества коры Larix Sibirica // Химия природных соединений. 1990. №6. С. 833-834.
4. Патент 2188031 РФ. Фитокомплекс, обладающий антиоксидантной активностью, и способ его получения // Бабкин В.А., Остроухова Л.А., Иванова Н.В., Малков Ю.А. и др. // БИ. 2002. №24.
5. Шарп Дж., Госни И., Роули А. Практикум по органической химии. М., 1993. С.240.
6. Иванова Н.В., Остроухова Л.А., Бабкин В.А., Иванова С.З., Попова О.В. Комплекс мономерных фенольных соединений коры лиственницы // Химия растительного сырья. 1999. №4. С. 5-7.
7. Федорова Т.Е., Иванова С.З., Иванова Н.В. Алкилкумараты коры лиственницы сибирской и даурской // Химия
растительного сырья. 2001. №2. С. 89-91.
8. Федорова Т.Е., Иванова С.З.,. Иванова Н.В., Федоров С.В. и др. Лариксидинол - новый спиробифлавоноид из коры лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина // Химия растительного сырья. 2003. №2. С. 5-8.
9. Федорова Т.Е., Иванова С.З., Федоров С.В., Бабкин В.А. Ларизинол - новый спиробифлавоноид из коры лиственницы Гмелина // Химия природных соединений. 2007. В печати.
10. Иванова С.З., Федорова Т.Е., Иванова Н.В., Федоров С.В., Бабкин В.А. Трифлариксинол - новый спирофлаво-ноид из коры лиственницы // Химия растительного сырья. 2006. №1. С. 37-41.
11. Иванова С.З., Федорова Т.Е., Иванова Н.В., Федоров С.В., Бабкин В.А. Спирофлавоноиды коры лиственницы // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: Мат. II Всеросс. конф. Барнаул, 2005. С. 388.
12. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М.,1974. 211 с.
13. Долгодворова С.Я., Перышкина Г.И., Орешкина В.И., Черняева В.Н. Экстрактивные вещества древесины и коры древесных пород среднетаежной подзоны Сибири // Экстрактивные вещества древесных пород Средней Сибири. Красноярск, 1977. С. 3-26.
14. Левин Э.Д., Астапкович И.И., Рязанова Т.В. Состав спирто-щелочного экстракта коры лиственницы сибирской // Химия древесины. 1985. №6. С. 101-104.
15. Симонян А.В. Активность производных коричных кислот и новые методы их синтеза // Химикофармацевтический журнал. 1993. №2. С. 21-23.
16. Faulds С., Clarke B., Williamson G. Ferulic acid unearthead // Chem. Brit. 2000. V. 36, №5. Р. 48-50.
17. Плотников М.Б., Тюкавкина Н.А., Плотникова Т.М. Лекарственные препараты на основе диквертина. Томск, 2005. 228 с.
18. Бабкин В.А., Остроухова Л.А., Иванова С.З., Малков Ю.А. и др. Ресурсосберегающая и экологически безопасная переработка древесины и коры лиственницы // Наука - производству. 2004. №1. С. 52-58.
19. Packer L., Rimbach G., Virgili F. Antioxidant activity and biologic properties of a procyanidin-rich extract from pine (Pinus maritima) bark, Pycnogenol // Free Radical Biology & Medicine. 1999. V. 27. Р. 704-724.
20. Ye X., Krohn R.L., Liu W., Joshi S.S., Kuszynski C.A., McGinn T.R., Bagchi M., Preuss H.G., Stohs S.J., Bagchi D. The cytotoxic effects of a novel IH636 grape seed proanthocyanidin extract on cultured human cancer cells // Molecular and Cellular Biochemistry. 1999. V. 196. P. 99-108.
21. Wang J.-N., Hano Y., Nomura T., Chen Y.-J. Procyanidins from the seeds of Vitis amurensis // Phytochemistry. 2000. V. 53. P. 1097-1102.
Поступило в редакцию 13 июня 2007 г.
