CC BY
29
УДК 575.116.4:575.2
Влияние двух мажорных QTL в хромосоме 4 на признаки яйца курицы-несушки*
Баркова Ольга Юрьевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
е-таИ: barkoffws@list.ru.
Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных. Филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»
Аннотация. Результаты исследования выявили два мажорных QTL на 4 хромосоме кур породы род айленд оказывающее влияние на яичные признаки несушки. Для проведения экспериментов использованы 241 курица породы мясо-яичного направления род айленд красного оперения и 149 образцов крови кур кросса УК Кубань, созданного на основе породы род айленд белого оперения. SNP2-1, кото-
V/ Л ■ | V/ V/ V/ V/
рый маркировал первый QTL, связан с массой яйца и толщиной яичной скорлупы. Также выявлено достоверное влияние второго QTL маркированного ^14491030 на признак масса яйца. Выявленные QTL могут быть использованы для создания системы молекулярно-генетических маркеров.
Ключевые слова: курица, QTL (локус количественного признака), яичные признаки, SNP (однонуклеотидный полиморфизм), конденсин I, толщина скорлупы яйца, масса яйца.
*Работа выполнена при финансовой поддержке ФАНО (Госзадание № АААА-А18-118021590138-1).
Введение. Отрасль птицеводства России яичного направления целиком зависит от иностранных кроссов кур. В связи с этим интенсификация отечественной селекции птицы, направленная на повышение яичной продуктивности приобретает особую актуальность и значимость. Неотложной задачей является создание собственных кроссов, а также сокращение потерь в отрасли птицеводства, обусловленных расходами на корма, заболеваемость кур и повышение качества продукции.
Во многих странах за последние десятилетия применение кроссов кур яичного направления, полученных современными программами разведения, значительно улучшило экономические показатели этой отрасли сельского хозяйства. В стандартных программах скрещивания кур большинство экономически важных признаков кур отбирались по фенотипу на протяжении многих десятилетий. С появлением полногеномных данных сиквенса и SNP-маркеров стало возможным выявлять локусы количественных признаков (QTLs) и гены-кандидаты, участвующие в реализации яичной продуктивности, что, несомненно, должно повлиять на эффективность селекции яичных кур. Фундаментальной основой селекции кур является выбор конкретных особей с благоприятными признаками. В этом отношении яичная продуктивность и, в частности, качество яйца кур, связанное с такими показателями как формирование желтка, толщины, прочности скорлупы и веса яиц, являются первостепенной целью селекции. Достижение этой цели возможно при помощи современной молекулярной генетики. Современные технологии молекулярной генетики позволяют обнаружить гены, влияющие на интересующие исследователя признаки. В последнее десятилетие поиск QTL (локусов количественных признаков) при помощи микросателитов замещается методом полногеномного ассоциативного анализа (GWAS). Другой метод поиска QTL основывается на разном уровне экспрессии изучаемых генов, ассоциированных с признаком [1].
Анализ экспрессии в реальном времени тканей яйцевода позволил выявить нуклеотидную последовательность CR523443. Данная нуклеотидная последовательность имела разные уровни экспрессии у кур с тонкой и толстой скорлупой. При секвенировании CR523443 получено шесть нуклеотидных замен. SТ2-1, SТ3-1, SТ3-2, SТ3-3 и SТ6-1. Наибольшая связь с признаком «толщина скорлупы» наблюдалась у нуклеотидной замены SТ2-1[2].
При помощи полногеномного ассоциативного анализа (GWAS), выполненного польскими учеными [3], был выявлен однонуклеотидный полиморфизм (SNР) rs14491030 на хромосоме 4, оказывающий влияние на массу яйца домашней курицы. Ассоциация с генетической изменчивостью массы яйца составила до 38 % (Р < 0,03). Генотипирование 2900 кур осуществлялось с помощью Illumina 42k Infinium chip SNP чипа.
Проведенный нaми aнaлиз in silico показал, что SNP rs14491030 находится в 14 экзоне гена NСАРG (не^ИС субъединице САР-G комплекса конденсина I) в позиции 78775527 п.н.
Конденсины являются субъединичными белковыми комплексами, основной функцией которых является компактизация хроматина и разделение хроматид в ходе их митотической сегрегации [4, 5]. Комплекс конденсина играет фундаментальную роль в структурной и функциональной организации хромосом, а также участвует в рекомбинации, репарации и регуляции экспрессии генов. Также каждый комплекс (конденсин I, конденсин II) содержит уникальный набор не-SMC субъединиц (CAP-D2, САР-G, и CAP-H для конденсина I, и CAP-D3, CAP-G2, и CAP-H2
для конденсина II). Не-SMC субъединица САР-G комплекса конденсина I участвует в белок-белковых взаимодействиях [6].
Цель данной работы - изучить влияние двух QTL маркированных ST2-1 и rs14491030 на признаки яичной продуктивности.
Материал и методы. Для проведения экспериментов использованы 241 курица породы мясо-яичного направления род айленд красного оперения, содержащиеся на базе «Генетической коллекции редких и исчезающих пород кур» ВНИИГРЖ. Также были использованы 149 образцов крови кур кросса УК Кубань, созданных на основе породы род айленд белого оперения, содержащихся в ООО «Лабинский». Кросс УК Кубань состоял из линий кур: УК 72, УК 73 и межлинейного гибрида CD.
Из образцов крови вышеперечисленных кур была выделена ДНК фенол-хлороформным методом. Среди них 51 образец крови несушек из линии УК 72, 73 из линии УК-73 и 25 особей из межлинейного гибрида CD.
В работе использовали следующие признаки: Масса яйца (в граммах), толщина скорлупы (в мкм.) и упругая деформация (в мкм.).
Подбор олигонуклеотидов для генотипирования кур по аллелям rs14491030, гена NCAPG и по аллелям SNP2-1, расположенным рядом с последовательностью CR523443, проводили на основании информации баз данных NCBI (www.nlm.ncbi. nih.gov) и компьютерной программы PRIMER_3 (wwwgenome.wi.mit.edu). Температура отжига 60 °С, размер фрагмента задан в пределах 200-600 п.н.. Программа BLAST использовалась для проверки полученных олигонуклеотидов на специфичность и отсутствие внутригеномной гомологии.
Последовательности олигонуклеотидов для генотипирования кур по аллелям rs 14491030:
Up_G: CTTCTTCCTCACAACTTTCAGTTCCAG Dn: TGTTTAAGCTTTGACTCATATCAGACC Up_A: CTTCTTCCTCACAACTTTCAGTTCCAA Dn: GTGGTGGTCTGCTATAACACTGTCTG
Последовательности олигонуклеотидов для генотипирования кур по аллелям S2-1 последовательности CR523443:
S2-1 C: CTGCTCAGTGTCTTAGTCTGATCAGC S2-1 T: CTGCTCAGTGTCTTAGTCTGATCAGT S2-1 Dn: ACAGTCATGATGAGGAAACAGG
Амплификацию ДНК проводили с использованием амплификатора IQ-5 (BioRad, США) с использованием реактивов СибЭнзим в следующем режиме: один цикл - 95° С - 3мин; 40 циклов - 94° С - 1 мин., 61° С - 1 мин., 72° С - 1 мин; один цикл - 72° С - 7 мин., 4° С - ю. Разделение фрагментов осуществляли с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Визуализацию полученного амплифика-та проводили при помощи УФ-трансиллюминатора. Статистический анализ результатов осуществляли с помощью однофакторного дисперсионного анализа, находящегося в пакетах программы SigmаРlоt 9 с использованием рангового варианта однофакторного дисперсионного анализа для признаков с ненормальным распределением.
Результаты и их обсуждение. Проведенный анализ in siliw с помощью опции Map View базы данных NCBI показал, что SNP rs14491030 находится в 14 экзо-не гена NCАРG (не^МС субъединице САР-G комплекса конденсина I), в позиции 78775537 п.н. SNP rs14491030 является несинонимической мутацией с заменой валина на аланин, что дает основание рассматривать данный олигонуклеотидный
полиморфизм как кандидата на причинную нуклеотидную замену (SNP).
При проведении статистического однофакторного дисперсионного анализа данных для генотипов АG, АА и GG ^14491030 у кур было выявлено достоверное влияние генотипа на признак «масса яйца» Р <0.001 (табл.1). Эффект замещения аллеля А на G составил 7,7 грамм (Р <0.05) для признака «масса яйца». Влияние гена NCAPG на массу яйца можно отнести к мажорным генам, поскольку его эффект составляет одну сигму (а = 6.0), что дает основание использовать ^14491030 в качестве надежного селекционного маркера (рис. 2).
Таблица 1 - Влияние генотипов гб14491030 на признаки яйца курицы-несушки
Признак N Генотип Среднее значение ± ошибка среднего Стандартное отклонение Р
Масса 14 GG 55.5 ± 1.5 6.0 < 0.001
яйца (г.) 57 АА 54.6 ± 0.7 5.1
170 AG 60.6 ± 0.4 6.0
Упругая дефор- 14 GG 21.5 ± 1.8 6.4 <0.03
мация 57 АА 22.1 ± 0.6 4.6
(мкм.) 170 AG 20.0 ± 0.5 6.5
Толщина 14 GG 341 ± 8 32 <0.2
скорлупы 57 АА 348 ± 5 35
(мкм.) 170 AG 352 ± 2 31
Олигонуклеотидный полиморфизм SNP2-1 был обнаружен на расстоянии 900 п.н 5'-3' направлении от конца транскрибируемой последовательности СЯ523443, состоящей из 2105 пар нуклеотидов, расположенной на GGA4 в положении 16,7 Мб. Програма GENSCAN (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html) не выявила промоторы, экзон-интронные границы и сайты полиаденилирования.
Таблица 2 - Эффект замещения нуклеотидов ^14491030
Признак Генотип N Медиана Эффект замещения аллелей (грамм) Р
Масса яйца (г.) AG 170 61.6 AG-АА 7,7 <0.05
АА 57 53.9 AG-GG 7,3 <0.05
GG 14 54.3 АА^ < 0.08
Анализ т silico СЯ523443 подтверждает, что эта последовательность относится к длинной нетранслируемой РНК [2]. Необходимы дальнейшие исследования для идентификации СЯ523443 как гена-кандидата и причины QTL-эффекта. На сегодняшний день известно, что поблизости с изучаемой нуклеотидной последовательностью находятся следующие гены: СОММD5, FАМ199х, RHОХF1. Влияние указанных генов в организме курицы не было изучено, однако известно, что СОММD5 является кальцийзависимым геном и его экспрессия ведет к гипертонии у мышей
и человека [7] .
Куры кросса Кубань анализировались отдельно, поскольку линии кур УК 72, УК 73 и межлинейный гибрид СD имеют свое происхождение и историю селекции и, следовательно, разную величину неравновесия по сцеплению между маркером SNP2-1 и QTL, что может исказить информацию о влиянии данной нуклеотидной замены на признак.
При проведении статистического анализа данных для трех генотипов СТ, СС и ТТ маркера SNP2-1 у кур линии УК 72 не было выявлено достоверного различия генотип - признак, но эффект замещения аллеля С на Т составил 35 мкм (Р <0.017) для признака «толщина скорлупы». Из данных следует, что достоверный эффект замены нуклеотидов SNP2-1 наблюдается у кур линии УК 72 и составляет более одного стандартного отклонения (табл. 3). Следовательно, по силе влияния на толщину скорлупы яиц обнаруженный QTL относится к каузальным QTL.
Достоверных различий не было получено у кур линии УК 73. У двухлинейного гибрида CD (см. табл. 3) достоверное различие было получено для признака «масса яйца» (Р = 0.002) и эффект замещения нуклеотидов составил 5 грамм (Р = 0.002). Следует заметить, что генотип СС отсутствовал у кросса CD из-за малой частоты этого генотипа в популяции кур.
Таблица 3 - Влияние генотипов БЫР2-1 на признаки яйца курицы-несушки
Среднее Стандартное Эффект за
Признак Генотип N значение ± ошибка oтклонение мещения аллелей
YК 72 среднего
Толщина скорлупы (мкм.) СТ 18 31 СТ-ТТ 0.25
28 359± 6 33 СС-ТТ 0,11
СС 5 335 ±15 25 С1-СС 35мкм 0.017
Масса яйца (г.) СТ 9 68.7 ±0.9 3 СТ-ТТ 5.0 гр. 0.002
" 16 64.0 ± 0.8 3
Выводы. Исследование выявило два мажорных QTL на четвертой хромосоме
кг ■■ V/ \л
курицы породы род-айленд с плейотропным эффектом на признаки яйца домашней курицы, что может быть результатом действия длинной нетранслируемой РНК в случае с SNP2-1 последовательности СЯ 523443 и влияния ^14491030 гена NCAPG на регуляцию транскрипции на уровне хроматина.
Вышеуказанные нуклеотидные замены (SNP) могут быть рекомендованы для создания системы QTLs, направленной на увеличение яичной продуктивности кур, в частности на увеличение массы яйца, упругую деформацию и толщину скорлупы, и создание рекомендаций для селекции кур яичных кроссов на основе генетического потенциала QTLs, ответственных за яичную продуктивность. Выявленные мажорные QTL могут быть использованы для создания системы молекулярно-гене-тических маркеров, что позволит создать задел для селекции отечественных высокопродуктивных кроссов птицы, обеспечивающих потребности населения России, и избежать необходимости приобретения кроссов из зарубежных стран.
Список литературы:
1. Preliminary mapping of QTL,s affecting egg quality on chromosomes 1-5 in chickens / Wardecka B., Olszewski R., Jaszczak K. et al. // Czech J. Anim. Sci. - 2003. - Vol. 48. - P. 97-105.
2. Баркова, О.Ю. Анализ ассоциации однонуклеотидной замены в межгенном районе хромосомы 4 с признаками, определяющими качество яйца домашней курицы / О.Ю. Баркова, М.Г. Смарагдов // Генетика. - 2013. - Т. 49. - №7. - С. 243-248.
3. Wolc A., Arango A. J., Settar P. Genome - wide association analysis and genetic architecture of egg weight and egg uniformity in layer chickens / A. Wolc, A.J. Arango, P. Settar // Animal Genetics. - 2012. - Vol. 43. - P. 87-96.
4. Molecular and genetic analysis of condensin function in vertebrate cells / D.F. Hudson, S. Ohta, T., Freisinger et al. // Mol Biol. Cell. 2008. - Vol. 19. - P. 3070-3079.
5. Hirano T. At the heart of the chromosome: SMC proteins in action / T. Hirano // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2006. - Vol. 7. - P. 311-322.
6. Xing H.1., Vanderford N. L., Sarge K.D. The TBP-PP2A mitotic complex bookmarks genes by preventing condensin action / H.I. Xing H.1, N.L. Vanderford, K.D. Sarge // Nat Cell Biol. -2008. - Vol.10. -P.1318-1323.
7. HCaRG/COMMD5 inhibits ErbB receptor-driven renal cell carcinoma / Matsuda Hiroyuki, Carole G. Campion, Fujiwara Kyoko, Ikeda Jin, Cossette Suzanne, Verissimo Thomas, Ogasawara Maiko, Gaboury Louis, Saito Kosuke, Yamaguchi Kenya, Takahashi Satoru, Fukuda Noboru, Soma Masayoshi, Hamet Pavel and Tremblay Johanne // Oncotarget. 2017 -Vol. 8(41). - Р. 69559-69576.
References:
1. Wardecka B., Olszewski R., Jaszczak K. Preliminary mapping of QTL's affecting egg quality on chromosomes 1-5 in chickens. Czech J. Anim. Sci., 2003, vol. 48, pp. 97-105.
2. Barkova O.Yu, Smaragdov M.G. Association analysis of single-nucleotide replacement in the 4- th chromosome intergenic area with signs that determine the quality of domestic chicken eggs. Genetika[Genetics], 2013, vol. 49, no.7, pp 243-248 (in Russian).
3. Wolc A., Arango A.J., Settar P. Genome - wide association analysis and genetic architecture of egg weight and egg uniformity in layer chickens. Animal Genetics, 2012, vol. 43, pp.87-96.
4. Hudson D. F., Ohta S., Freisinger T. Molecular and genetic analysis of condensin function in vertebrate cells. Mol Biol. Cell, 2008, vol. 19, pp. 3070-3079.
5. Hirano T. At the heart of the chromosome: SMC proteins in action. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2006, vol. 7, pp. 311-322.
6. Xing H.1., Vanderford N.L., Sarge K.D. The TBP-PP2A mitotic complex bookmarks genes by preventing condensin action. Nat Cell Biol., 2008, vol.10, pp.1318-1323.
7. Hiroyuki M,. Carole G.C., Fujiwara K. et al. HCaRG/COMMD5 inhibits ErbB receptor-driven renal cell carcinoma. Oncotarget, 2017, vol. 8(41), pp.69559-69576.
Two major QTLs in the 4-th chromosome of laying hens
with the effects on egg traits
Barkova Olga Yurevna, Candidate of Science (Biology), senior researcher.
e-mail: barkoffws@list.ru
Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breedingof farm animals, Branch of Federal state budget scientific institution "Federal scientific center for animal husbandry — VIZH of academician L. K. Ernst.
Abstract. Obtained data have revealed the presence of two major QTLs in the 4-th chromosome of Rhode island hens. Studies have been conducted on 241 laying of red Rhode island breed hens and on 149 Kuban cross laying hens based on the white Rhode island breed. The SNP2-1 which has marked the first QTL is associated with egg weight and eggshell thickness. Rs14491030 has marked the second QTL a significant effect of single nucleotide polymorphism on the egg weight trait. Identified QTLs can be used to create a system of molecular genetic markers.
Keywords: chicken; QTL; egg traits, SNP SNP (Single nucleotide polymorphism), condensin I, eggshell thickness, egg weight.
