CC BY
160
УДК 57.084.1:57.085.1:57.042:57.017.35:57.012.4
ВЛИЯНИЕ ДОКСОРУБИЦИНА НА ДИЛАТАЦИОННОЕ РЕМОДЕЛИРОВАНИЕ МИОКАРДА В ПЕРИОД ПРОГРЕССИВНОГО РОСТА
Л.М. Непомнящих, ЕЛ. Лушникова, М.Г. Калинникова, О.П. Молодых
НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН, Новосибирск E-mail: pathol@soramn.ru
INFLUENCE OF DOXORUBICIN ON DILATED MYOCARDIAL REMODELING DURING PROGRESSIVE GROWTH
L.M. Nepomnyashchikh, E.L. Lushnikova, M.G. Klinnikova, O.P. Molodykh
Institute of Regional Pathology and Pathomorphology of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Novosibirsk
Исследовано влияние доксорубицина на структурную реорганизацию миокарда и дилатационное ремоделирование сердца крыс в фазе прогрессивного роста. Установлено сохранение регенераторного потенциала кардиоми-оцитов и его активация после однократного воздействия доксорубицина в дозе 5 мг/кг, способствующие сохранению и увеличению общей численности и размеров кардиомиоцитов в сердце и, как следствие, гипертрофии сердца в ранний период онтогенеза. Представлены клеточные механизмы и морфогенез дилатационного ремо-
делирования сердца после воздействия доксорубицина.
Ключевые слова: кардиотоксичность, миокард, доксорубицин, морфометрия, стереология.
The influence of doxorubicin on the structural reorganization and dilated remodeling of rat myocardium during early stages of ontogenesis was studied. Preservation and activation of regenerative capacities of cardiomyocytes after doxorubicin treatment (in dose 5 mg/kg) contributing to conservation and increasing total cardiomyocyte number in the heart and as a result to heart hypertrophy during the early stage of ontogenesis were revealed. Cellular mechanisms and morphogenesis of dilated heart remodeling after the doxorubicin treatment are presented.
Key words: cardiotoxicity, myocardium, doxorubicin, morphometry, stereology.
Введение
Дилатационная кардиомиопатия является одним из тяжелейших заболеваний с крайне неблагоприятным, часто летальным прогнозом [1, 3, 14]. Среди причин, обусловливающих развитие сердечной недостаточности, ди-латационная кардиомиопатия по значимости и частоте занимает третье место после коронарной недостаточности и артериальной гипертензии.
В свете современных представлений дилатационная кардиомиопатия относится к интегральному финальному фенотипу гетерогенной группы заболеваний сердца [3]. Развитие дилатационной кардиомиопатии могут обусловливать идиопатические миокардиты (до 12% случаев), аутоиммунные заболевания, заболевания коронарных артерий (до 11%), другие неидентифицируемые причины (около 31%), в число которых включают метаболические нарушения, токсические агенты (например, ант-рациклиновые антибиотики, алкоголь и др.) [1, 3].
Использование антрациклиновых антибиотиков в схемах противоопухолевой терапии в ряде случаев обусловливает развитие хронической (необратимой) сердечной недостаточности, в том числе и у детей [7, 9, 11-13]. Несмотря на большое количество клинических исследований в этой области, закономерности структурной реорганизации миокарда и его регенераторные возможности после применения доксорубицина в период прогрессивного роста остаются слабо изученными.
Цель работы: изучить клеточные и внутриклеточные механизмы дилатационного ремоделирования сердца крыс при доксорубициновом повреждении в период прогрессивного роста.
Материал и методы
Проведено моделирование доксорубицинового повреждения миокарда у 59 крыс-самцов Вистар в возрасте 1 мес. (период прогрессивного роста). Животным вводили однократно внутрибрюшинно доксорубицина гидрохлорид (Ферейн, Россия) в дозе 5 мг/кг. Контрольную группу составили животные (п=10), которым одновременно вводили физиологический раствор в соответствующем их массе тела объеме. Всех животных до начала и во время эксперимента содержали в обычных условиях вивария при комнатной температуре без ограничения доступа к воде и пище. Животных (по 3 особи на каждую временную точку) опытной группы выводили из опыта декапитацией через 1, 3, 5, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 и 56 сут. после введения препарата, контрольных - через 21 и 56 сут. (как одновозрастной контроль с учетом прогрессивного роста особей). Образцы миокарда фиксировали в
10% нейтральном формалине, обрабатывали по стандартной методике с заливкой в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по ван Гизону; ставили PAS-реакцию. Светооптическое исследование проводили в универсальном микроскопе “Leica DM 4000B”. Общую (абсолютную) численность кардиомиоцитов в сердце оценивали с помощью метода щелочной диссоциации фиксированных тканей.
Для электронно-микроскопического исследования образцы миокарда фиксировали в 4% растворе параформальдегида, постфиксировали в 1% растворе четырехо-киси осмия, обрабатывали по стандартной методике с заливкой в смесь эпона и аралдита. Полутонкие и ультра-тонкие срезы получали на ультратомах LKB III и Leica EM UC7 (Leica, Германия). Полутонкие срезы окрашивали азуром II, проводили тканевой стереологический анализ с оценкой объемной плотности структурных компонентов миокарда с помощью компьютерной программы “Leica QWin V3”.
Статистическую обработку количественных данных осуществляли с помощью статистического пакета MS Excel 2007 и пакета прикладных программ STATISTICA 6.0. Вычисляли среднее значение (M) и ошибку среднего (m). Результаты исследования представлены в виде значений М±ш. При сравнении групп использовался параметрический критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Общетоксические свойства доксорубицина оценивали по внешнему виду животных и данным массометрического анализа. Однократное введение доксорубицина гидрохлорида в дозе 5 мг/кг не приводило к гибели крыс в течение всего срока эксперимента. В то же время у всех животных отмечались макроскопические изменения внутренних органов, обусловленные токсическим действием препарата. С 3-х сут. почти у половины животных отмечался неопрятный внешний вид, у четверти особей -диспепсия, у 70% особей - “лягушачий” живот. Через 5 сут. у половины животных появились признаки асцита, с 14-х сут. стали регистрироваться единичные случаи анемии и спаечных процессов в брюшной полости, почти у всех животных (90%) отмечались алопеции, на брюшке в месте введения доксорубицина иногда возникал некроз тканей. К концу эксперимента площадь алопеций и их количество постепенно уменьшались, нормализовался внешний вид, но сохранялись спаечные процессы в брюшной полости.
По данным массометрического анализа, несмотря на диспепсические расстройства, с 3-х сут. происходило уве-
личение массы тела крыс (табл. 1), что в значительной степени было обусловлено нарастающим асцитом. Масса сердца также нарастала на протяжении всего эксперимента, но наиболее существенно в первые 21 сут. эксперимента (на 43%; р<0,05), в течение следующих 35 сут. этот показатель увеличился на 18% по сравнению с возрастным контролем (табл. 2). Важно отметить, что индуцированная цитопатическим действием доксорубицина гипертрофия сердца крыс сопровождалась его ремоделированием по дилатационному варианту - через 42-56 сут. отмечалось увеличение полостей желудочков сердца и истончение их стенок.
Морфологические изменения миокарда крыс после однократного введения доксорубицина на протяжении всего эксперимента проявлялись как в контрактурных, так и литических повреждениях кардиомиоцитов, которые были преобладающим типом повреждения во всех слоях миокарда. Особенностью доксорубициновых повреждений кардиомиоцитов, хорошо выявляемых на световом уровне, является вакуолизация саркоплазмы, которая обусловлена выраженными расширениями профилей агранулярной саркоплазматической сети. Эти изменения выявлялись при исследовании полутонких срезов (рис. 1).
При характеристике выраженности и распространенности литических повреждений кардиомиоцитов в динамике эксперимента следует отметить, что несмотря на однократность доксорубицинового воздействия, количество поврежденных кардиомиоцитов нарастало до конца эксперимента. Если через 1-3 сут. литически поврежденные кардиомиоциты с вакуолизированной саркоплазмой составляли около 25% от всех сердечных миоцитов
Рис. 1. Вакуолизация саркоплазмы кардиомиоцитов через 21 сут. после однократного введения доксорубицина 1-месячным крысам. Полутонкий срез. Окраска азуром II. Ув. x1000
клеток, то через 5-7 сут. они достигали уже 50%. Во временной интервал от 21 до 56 сут. количество литически измененных кардиомиоцитов достигало 80% (рис. 2). К доксорубициновым повреждениям кардиомиоцитов, распространенность которых нарастала на протяжении эксперимента, следует отнести также разрывы мышечных волокон по вставочным дискам (диссоциацию кардио-миоцитов, нарушение функционального синцития). Диссоциацию кардиомиоцитов следует рассматривать как раннее проявление их апоптотической гибели, поскольку лишенные базальной мембраны и межклеточных контактов клетки становятся нежизнеспособными.
Начиная с 14-х сут. отмечалась выраженная фенотипическая гетерогенность кардиомиоцитов - наряду с гипертрофированными клетками встречались истонченные (атрофированные). Несмотря на выраженные некробио-тические изменения отдельных кардиомиоцитов, их объемная плотность существенно не изменялась на протяжении всего эксперимента.
Нарушения гемодинамики на протяжении всего эксперимента проявлялись в виде венозного и капиллярного полнокровия, интерстициального и периваскулярно-го отека, лимфостаза и небольших очагов геморрагий. Усиление лимфангиогенеза было связано с нарастающей сердечной недостаточностью и развивающимся венозным застоем и, как следствие, усилением дренажной функции лимфатической системы сердца, которая рассматривается как компенсаторно-приспособительная реакция. Во всех слоях миокарда регистрировалась диффузная мононуклеарная инфильтрация стромы, интенсивность которой коррелировала с выраженностью и распространенностью литических и некробиотических из-
Рис. 2. Выраженные литические повреждения саркоплазмы кардиомиоцитов через 49 сут. после однократного введения доксорубицина 1-месячным крысам. Полутонкий срез. Окраска азуром II. Ув. x1000
менений кардиомиоцитов. Очаги инфильтрации в строме были небольшими, встречались чаще всего перивас-кулярно и в местах атрофии и гибели кардиомиоцитов. В более поздние сроки эксперимента (начиная с 21-х сут.) в миокарде формировались небольшие очаги кардиосклероза.
Структурная доксорубицин-индуцированная реорганизация миокарда молодых крыс проявлялась преимущественно в уменьшении в течение эксперимента объемной (на 17%, от 70,0±9,5 мм3/см3 в контроле до 58,0±5,1 мм3/см3 в конце опыта) и поверхностной (на 15%, от
0,040+0,006 м2/см3 в контроле до 0,034±0,005 м2/см3 в конце опыта) плотностей капилляров. Одновременно происходило заметное снижение объемной (на 37%, от 9,1±1,8 мм3/см3 в контроле до 5,7+1,4 мм3/см3 в конце опыта) и поверхностной (на 22%, от 0,009±0,002 м2/см3 в контроле до 0,007+0,0003 м2/см3 в конце опыта) плотностей эндотелиальных клеток. Эти изменения обусловливали снижение объемных и поверхностно-объемных отношений капилляров к кардиомиоцитам (соответственно на 26 и 30%). Подобные изменения соотношений между объемными характеристиками капилляров и кардио-миоцитов на протяжении эксперимента свидетельствовали о более выраженном повреждении эндотелиоцитов
[10] и замедлении роста капилляров по отношению к росту мышечных клеток после доксорубицинового воздействия. Одновременно на протяжении всего эксперимента регистрировалось увеличение объемной плотности волокон и основного вещества соединительной ткани (на 24%, от 111,3±12,9 мм3/см3 в контроле до 138,3±15,6 мм3/ см3 в конце опыта), частично обусловленное интерстициальным отеком.
Характер выявленных повреждений кардиомиоцитов и реорганизации миокарда молодых крыс при введении доксорубицина отражает общие закономерности развития регенераторно-пластической сердечной недостаточности [2, 4]. Регенераторно-пластическая недостаточность кардиомиоцитов обусловлена значительными повреждениями структур кардиомиоцитов, нарушением биосинтетических процессов (процессов внутриклеточной регенерации) и гибелью клеток и, как правило, их численным дефицитом, обусловливающими атрофию сердца [5,
6, 8]. Эти изменения составляют основу развивающейся сердечной недостаточности при антрациклиновых кар-диомиопатиях. Однако у молодых животных характер структурных изменений миокарда и его ремоделирование после доксорубицинового повреждения отличались от таковых у особей в зрелом возрасте.
Таблица 1
Морфометрические показатели и количественная оценка популяции кардиомиоцитов в сердце крыс Вистар в возрасте 1 мес. через 21 сут. после однократного введения доксорубицина (M±m)
Показатели Контроль (1-й) Время после введения препарата
1 сут. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 14 сут. 21 сут.
Масса тела, г 108,5+1,5 104,3+2,4 122,0+2,1* 114,0+4,9 137,0+2,3** 142,6+1,2** 159,5+3,7**
Масса сердца, г Относительная масса 0,467+0,015 0,438+0,013 0,473+0,008 0,488+0,036 0,551+0,028* 0,590+0,031* 0,670+0,057*
сердца, мг/г Диаметр сердечных 4,31+0,14 4,21+0,20 3,88+0,80 4,27+0,15 4,02+0,16 4,14+0,25 4,19+0,27
миоцитов, мкм Концентрация кардио- 13,9+0,48 13,1+0,42 12,5+0,30 12,8+0,74 14,9+0,37 14,1+0,64 15,0+0,50
миоцитов, 103/мг ткани Абсолютная численность кардиомиоцитов 7,1+0,79 7,8+0,73 8,7+0,58 8,0+0,61 6,4+0,61 5,4+0,18 5,4+0,36
в сердце, х106 3,25+0,33 3,21+0,30 3,91+0,49 3,64+0,47 3,48+0,51 2,94+0,09 3,31+0,43
Примечание: здесь и в таблице 2: * - р<0,05, ** - р<0,01 при сравнении с контролем, здесь и далее.
Таблица 2
Морфометрические показатели и количественная оценка популяции кардиомиоцитов в сердце крыс Вистар в возрасте 1 мес. через 56 сут. после однократного введения доксорубицина (M±m)
Показатели Контроль (2-й) Время после введ ения препарата
28 сут. 35 сут. 42 сут. 49 сут. 56 сут.
Масса тела, г 209,5+7,6 198,0+5,6 231,2+13,3 249,8+8,4* 235,0+10,3 238,6+10,7
Масса сердца, г Относительная масса 0,800+0,029 0,773+0,027 0,900+0,025* 0,960+0,02* 0,863+0,012 0,943+0,030**
сердца, мг/г Диаметр сердечных 3,83+0,04 3,91+0,04 3,91+0,16 3,83+0,12 3,69+0,12 3,96+0,10
миоцитов, мкм Концентрация кардио- 16,0+0,49 15,6+0,27 17,5+0,47* 18,9+0,47* 17,4+0,42* 17,8+0,45*
миоцитов, 103/мг ткани Абсолютная численность кардиомиоцитов 4,5+0,61 4,9+0,26 4,4+0,32 4,4+0,26 5,5+0,18* 4,7+0,10
в сердце, х106 3,42+0,36 3,42+0,08 3,84+0,48 3,96+0,05 4,57+0,22* 4,19+1,12
Для выяснения клеточных механизмов ремоделирования сердца при доксорубициновом повреждении проведена оценка диаметра кардиомиоцитов и их общей численности в желудочках сердца (табл. 1, 2). Через 3 сут. после однократного введения доксорубицина наблюдалось транзиторное уменьшение диаметра кардиомиоци-тов (на 10%), сопровождаемое транзиторным увеличением их концентрации в 1 мг ткани (на 23%) и общей численности (на 20%) в сердце. К 21-м сут. происходило умеренное увеличение диаметра кардиомиоцитов (на 8%) при снижении их концентрации (на 24%); общая численность кардиомиоцитов в сердце в этот срок соответствовала контрольному уровню. Масса сердца к 21-м сут. возрастала на 43% по сравнению с одновозрастным контролем. В течение последующих 35 сут. (до 56-х сут.) происходило умеренное увеличение диаметра сердечных ми-оцитов (на 11%), их гипертрофия и одновременно увеличение общей численности кардиомиоцитов в сердце (на 23%). Эти изменения обусловили увеличение массы сердца (гипертрофию) к концу эксперимента на 18% (p<0,01).
Сохранение и увеличение общей численности карди-омиоцитов в сердце после однократного воздействия доксорубицина обусловлено сохранением пролиферативной активности кардиомиоцитов у молодых животных. Индукция процессов клеточной (увеличение численности клеток) и внутриклеточной регенерации кардио-миоцитов вследствие цитопатического действия доксо-рубицина проходила у молодых животных на фоне физиологического роста. Интенсификация физиологического роста кардиомиоцитов, обусловленная репаратив-ными процессами, обусловливала гипертрофический рост и увеличение массы сердца к концу эксперимента. Гипертрофию кардиомиоцитов и сердца у молодых животных, несмотря на компенсаторно-приспособительный характер этого процесса, следует отнести к негативным побочным эффектам действия доксорубицина в раннем онтогенезе. Дилатационный характер ремоделирования гипертрофированного сердца после доксорубициново-го воздействия у молодых животных позволяет считать эти изменения терминальными и необратимыми.
Заключение
По данным комплексного морфологического анализа, однократное введение 1-месячным крысам доксору-бицина в дозе 5 мг/кг вызывает значительную структурную реорганизацию миокарда и кардиомиоцитов, регистрируемую в течение 2 мес. после введения препарата. В то же время сохранение регенераторного потенциала кардиомиоцитов и активация процессов репаративной регенерации у молодых животных способствовали гипертрофическому росту кардиомиоцитов и, как следствие, гипертрофии сердца. Сохраняющиеся на протяжении длительного времени модификация молекулярно-биологических процессов в кардиомиоцитах, вызванная док-сорубицином, обусловливающая их преимущественно апоптотическую гибель, с одной стороны, и компенсаторный гипертрофический рост кардиомиоцитов, с другой стороны, способствуют дилатационному ремоделированию гипертрофированного сердца. Морфогенез ди-
латационного ремоделирования сердца после воздействия доксорубицина определяется атрофическими изменениями, гибелью кардиомиоцитов, компенсаторной гиперплазией и гипертрофией сохранившихся кардио-миоцитов, развитием диффузного и мелкоочагового кардиосклероза. Доксорубицин-индуцированное дилатаци-онное ремоделирование и гипертрофию сердца у молодых особей следует относить к негативным побочным эффектам. Эти процессы отражают преждевременную возрастную реорганизацию органа, старение сердечной мышцы.
Литература
1. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М. Генетические факторы развития дилатационной кардиомиопатии // Вестн. РАМН.
- 2006. - № 7. - С. 43-52.
2. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Клинникова М.Г. и др. Ультраструктурные проявления нарушений регенерации кардиомиоцитов при действии доксорубицина // Морфология. - 2005. - Т. 128, № 4. - С. 81-84.
3. Лушникова Е.Л., Непомнящих Л.М., Розенберг В.Д. Морфологические и молекулярно-генетические основы дилатаци-онной кардиомиопатии. - М. : Изд-во РАМН, 2004. - 192 с.
4. Непомнящих Л.М. Регенераторно-пластическая недостаточность сердца: Молекулярно-биологические механизмы и морфологические основы // Арх. патол. - 2007. - Вып. 3. -С. 3-12.
5. Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Л., Ларионов П.М. и др. Регенерация миокарда: Пролиферативный потенциал карди-омиоцитов и индукция кардиомиогенеза при альтератив-ной и пластической недостаточности сердца // Вестник РАМН. - 2010. - № 5. - С. 3-11.
6. Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Л., Семенов Д.Е. Регенераторно-пластическая недостаточность сердца: Морфологические основы и молекулярные механизмы. - М. : Изд-во РАМН, 2003. - 255 с.
7. Abosoudah I., Greenberg M.L., Ness K.K. et al. Echocardiographic surveillance for asymptomatic late-onset anthracycline cardiomyopathy in childhood cancer survivors // Pediatr. Blood Cancer. - 2011. - Vol. 57. - P. 467-472.
8. Carvalho R.A., Sousa R.P., Cadete V.J. et al. Metabolic remodeling associated with subchronic doxorubicin cardiomyopathy // Toxicology. - 2010. - Vol. 270. - P. 92-98.
9. Ewer M.S., Ewer S.M. Cardiotoxicity of anticancer treatments: what the cardiologist needs to know // Nat. Rev. Cardiol. - 2010.
- Vol. 7. - P. 564-575.
10. Maney S.K., Johnson A.M., Sampath Kumar A. et al. Effect of apoptosis-inducing antitumor agents on endocardial endothelial cells // Cardiovasc. Toxicol. - 2011. - Vol. 11. -P. 253-262.
11. Pontes J.C., Gomes Jun. J.F., Silva G.V. et al. Anatomopathological study of cardiomyopathy induced by doxorubicin in rats // Acta Cir. Bras. - 2010. - Vol. 25. - P. 137-143.
12. Rathe M., Carlsen N.L., Oxhoj H. et al. Long-term cardiac follow-up of children treated with anthracycline doses of 300 mg/m2 or less for acute lymphoblastic leukemia // Pediatr. Blood Cancer. - 2010. - Vol. 54. - P. 444-448.
13. Sivaprakasam P., Gupta A.A., Greenberg M.L. et al. Survival and long-term outcomes in children with hepatoblastoma treated with continuous infusion of cisplatin and doxorubicin // J. Pediatr. Hematol. Oncol. - 2011. - Vol. 33. - P. 226-230.
14. Startari U., Taylor M.R., Sinagra G. et al. Dilated cardiomyopathy: etiology, clinical criteria for diagnosis and screening of the familial form // Ital. Heart J. - 2002. - Vol. 3. - P. 378-385.
Поступила 19.08.2011
