CC BY
73
ЛЕСНАЯ СЕЛЕКЦИЯ, ГЕНЕТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ
ВЛИЯНИЕ ДЛИНЫ СВЕТОВОГО ДНЯ НА УСТОЙЧИВОСТЬ СЕЯНЦЕВ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ К ТОКСИЧЕСКОМУ ДЕЙСТВИЮ ЦИНКА
Ю.В. ИВАНОВ, н. с. Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, канд. биол. наук, Ю.В. САВОЧКИН, мл. н. с. Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН
Сосна обыкновенная (Pirns sylvestris L.), благодаря способности существовать в самых разнообразных экологических условиях от крайнего севера (в условиях полярного дня) до субтропиков (в условиях короткого дня юга), имеет обширный ареал на материке Евразия: от 70° до 37° с.ш. и от 7° з.д. до 126°
в.д. На севере граница ареала сосны достигает предела распространения древесных пород, поднимаясь выше Северного полярного круга (66°33'39") на 3...4° (северо-западное побережье Норвегии (Порсангер-Фьорд, 70°20' с.ш.)). Южная граница ареала достигает предельного распространения в Сьерра-Неваде (37° с.ш.), однако южную границу сплошного распространения принято выделять по границе лесостепной и степной зон [5].
Особенности ареала сосны свидетельствуют о том, что она должна проявлять сильно выраженную географическую изменчивость, обусловленную резко различающейся в широтном направлении продолжительностью светового дня и температурным режимом. На Земле наблюдаются регулярные периодические смены радиации, следовательно, все живые существа в ритме день-ночь, а также в годовом ритме подвержены периодическим изменениям освещенности и температуры. Амплитуда этой ритмичности зависит от географической широты. В течение лета в экваториальной области дни наиболее короткие. С увеличением географической широты они становятся длиннее, вплоть до временного круглосуточного светового дня в полярных областях. Одновременно вследствие изменения температурных условий сокращается и вегетационный период растений. У южных границ ареала (37° с.ш.) вегетационный период протекает при средней продолжительности светового дня, не превышающей 15 ч, а у северных (70° с.ш.) - в условиях полярного дня продолжительностью с третьей декады мая по август.
[email protected]; [email protected]
По свидетельствам Л.Ф. Правдина, в северных широтах и горах хвоя сосны короче, чем в южных широтах и низменностях. Средняя длина хвои в пунктах, удаленных друг от друга на расстояние 13° по широте, различается между собой в полтора раза. При этом средняя длина хвои сосны на 66° с.ш. является минимальной для сосны на 53° с.ш. [5]. Безусловно, определяющим фактором развития растений на данных широтах является температурный режим почв и воздуха, а влияние фотопериода менее выражено.
От экватора до умеренных широт развитие деревьев характеризуется отличительными периодами покоя, распускания почек, быстрого роста побегов и синхронного цветения, являющегося необходимым условием эффективного перекрестного опыления. Эти периоды хорошо приспособлены к сезонности окружающей среды. Например, со снижением широты распускание почек и цветение деревьев умеренного климата, индуцируемое возрастающими весенними температурами, начинается намного раньше. Между 43° и 46° с.ш. (около северных границ ареалов) большинство северо-американских широколиственных деревьев покрывается листвой в мае. В субтропических широтах такие виды, как клен красный (Acer rubrum L.), каркас (Celtis sp. L.), бук крупнолистный (Fagus grandifolia Ehrh.), черемуха поздняя (Prunus serotina Ehrh.), дуб (Quercus sp. L.) и другие, покрываются листвой в феврале, совпадая с сим-патрическими вечнозелеными тропическими видами, которые меняют листву ежегодно [8]. Эти примеры доказывают, что время распускания почек, детерминированное генетически, варьирует между экотипами одного и того же вида и контролируется различными сигналами окружающей среды.
Многочисленные фенологические исследования представителей древесной флоры
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 1/2012
99
ЛЕСНАЯ СЕЛЕКЦИЯ, ГЕНЕТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ
умеренного пояса показали, что распускание почек индуцируется увеличением весенних температур. И только формирование спящих почек и состояние зимнего покоя находятся под контролем фотопериода. Определяющая роль фотопериода в индуцировании распускания почек и цветения многих тропических деревьев не была известна вплоть до начала XXI в. [8]. Установлено, что синхронное распускание почек, наблюдающееся около дня весеннего равноденствия и несколькими неделями ранее начала периода дождей, индуцируется увеличением продолжительности светового дня лишь на 30 или чуть менее минут. Для растений короткого дня ксерофитных лесов распускание листвы весной в субтропиках начинается приблизительно на 1 месяц ранее, чем в более низких широтах. Это означает, что критическая продолжительность светового дня для индукции распускания почек варьирует от 11,5-12,5 ч в субтропиках и составляет около 12 ч в низких широтах [13]. Кроме сигнальной роли, свет является для растений важнейшим экологическим фактором ассимиляции. Если освещенность перерастает компенсационный момент, ассимиляция быстро растет. При увеличении продолжительности дня рост многих пород усиливается. При этом часто действует не столько длительность освещения, сколько длительность темноты. Например, у сосны обыкновенной интенсивный рост наблюдается в темноте, превышая рост на свету на 30 % [3].
Предположение о том, что у вида с большим ареалом можно обнаружить различно реагирующие типы, получило подтверждение в работах Nitsth, 1957 г. [3]. В результате сосна обыкновенная была отнесена к растениям, у которых короткий день вызывает наступление покоя, а длинный способствует периодическому росту. Критическая длина дня для сосны была установлена в диапазоне 12-13 ч. При более продолжительном дне она характеризовалась многократной периодичностью активации роста [3].
Таким образом, при разной продолжительности светового периода в идентичных условиях температурного режима следует ожидать проявления довольно существенных различий в развитии сосны и ее устойчивос-
ти к воздействию негативных факторов среды. Учитывая, что в последние десятилетия среди негативных воздействий на фитоценозы возрастает доля участия тяжелых металлов, они были выбраны нами для моделирования стрессовых условий. Тяжелые металлы составляют особую группу загрязнителей, которые не подвержены биодеструкции и аккумулируются в почвах, достигая токсических для растений концентраций. Одним из основных (по масштабам эмиссии в окружающую среду) и опасных загрязнителей биоценозов является цинк. Его токсичность обусловлена высоким сродством к функциональным группам биологических молекул и участием в составе всех классов ферментов (оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы). Для текущего исследования выбраны концентрации цинка (в виде ZnSO4) - 1,26 (контроль) и 100 мкМ. Проявление токсического действия цинка изучалось при двух контрастных по продолжительности световых периодах 12 (продолжительность светового дня на экваторе) и 16 часов (средняя полоса России).
В экспериментах использованы семена сосны обыкновенной 1-го класса качества (по ГОСТ 14161-86 «Семена хвойных древесных пород. Посевные качества»), полученные в Брянской лесосеменной станции ФГУ Рос-лесозащита в 2009 г.
Перед посевом семена подвергали поверхностной стерилизации в растворе 13 %-ой перекиси водорода (H2O2) в 96 %-ом этаноле (C2H5OH) в течение 10 мин. После удаления стерилизующего раствора десятикратным промыванием дистиллированной водой семена раскладывали на специально подготовленную подложку из перлита и проращивали в растворах, содержащих 1,26 (контроль) и 100 мкМ ZnSO4. После развертывания семядолей всходы выращивали на модифицированной питательной среде Кнопа с микроэлементами по Хог-ленду с соответствующим содержанием ZnSO4. Смену питательных растворов проводили раз в 7 дней. Опытные группы растений выращивали в камерах фитотрона со световыми периодами 12 и 16 ч соответственно, при мощности освещения 37,6 Вт/м2 люминесцентных ламп Philips (F36W/54) и освещенности 25000 лк, обеспечи-
100
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 1/2012
ЛЕСНАЯ СЕЛЕКЦИЯ, ГЕНЕТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ
Таблица
Влияние продолжительности светового периода на линейные размеры сеянцев сосны обыкновенной
1,26 мкМ ZnSO4 100 мкМ ZnSO4
Орган 12 ч 16 ч 12 ч 16 ч
Мх ± mMx N Мх ± mMx N Мх ± mMx N Мх ± mMx N
Корень, мм 75,24 ± 7,49 39 107,94 ± 3,31 114 38,18 ± 2,93 76 98,40 ± 3,90 105
Стволик, мм 28,83 ± 1,02 39 30,28 ± 0,48 114 28,75 ± 0,57 76 31,44 ± 0,38 104
Семядоли, мм 22,65 ± 0,56 39 25,11 ± 0,31 110 21,43 ± 0,34 76 24,17 ± 0,33 105
Хвоя, мм 19,19 ± 1,20 39 24,92 ± 0,44 113 17,57 ± 0,76 76 22,20 ± 0,32 104
Масса, мг 77,6 ± 6,1 39 95,9 ± 2,6 114 61,2 ± 2,6 76 90,2 ± 2,4 114
Кол-во хвои, шт. 12,9 ± 0,7 30 20,5 ± 0,8 30 10,7 ± 0,5 30 19,5 ± 0,9 30
вающей максимальную величину ассимиляции. Температура воздуха днем 23±1°С, ночью 15±1°С; относительная влажность воздуха - 55 и 70 % соответственно.
По достижении растениями возраста 6 недель (сформированы корневая система и первичная хвоя) их вынимали, подсушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали с точностью до 0,1 мг и сканировали с разрешением 800 dpi. В программной среде MapInfo Professional v. 9.5 с точностью до 0,1 мм определяли линейные размеры корней, стволиков, семядолей и хвои, а также подсчитывали количество сформировавшихся хвоинок. После сканирования растения фиксировали жидким азотом и хранили при -70°С для определения биохимическим маркеров степени окислительного стресса (активность супероксиддис-мутазы (СОД), содержание пролина).
Сравнение контрольных групп растений, выращенных при световых периодах 12 и 16 ч, показало, что увеличение продолжительности светового дня на 4 ч привело к увеличению биомассы сеянцев на 23,6 % (таблица). У сеянцев, выращенных при 16 ч, наблюдалось более активное развитие ассимиляционного аппарата и корневой системы. Средняя длина семядолей сеянцев, выросших при 16-ч световом периоде, превышала 12-ч на 10,9 %, а средняя длина хвои - на 29,9 %. Подсчет образовавшейся хвои показал, что в условиях 16-ч светового периода ее количество увеличилось на 59,0 %, составив 20 хвоинок на сеянец, против 12-ч периода (13 хвоинок) (таблица). Увеличение степени развитости ассимиляционного аппарата сеянцев в условиях 16 ч, привело
к более интенсивному развитию корневой системы. Прирост главного корня увеличился на
43,5 % по сравнению с 12-ч периодом.
Таким образом, увеличение продолжительности светового дня в 1,3 раза привело к более значительному увеличению линейных размеров корневой системы (в 1,43 раза) и развитости ассимиляционного аппарата (по количеству хвоинок - в 1,59 раз) и аналогичному увеличению линейных размеров хвои (1,3 раза).
Хроническое действие 100 мкМ ZnSO4 в условиях 12-ч светового периода привело к заметному ингибированию роста сеянцев, выразившемуся в редуцировании линейных размеров органов и снижении темпов накопления биомассы (на 21,1 % по сравнению с соответствующим контролем). Значительный токсический эффект цинка проявился практически вдвое (на 49,3 % по сравнению с контролем). Наименьший эффект цинк оказал на прирост стволиков сеянцев. Редуцирование размеров составило лишь 0,3 %. Ингибирование роста ассимиляционного аппарата составило 5,4 % для семядолей и 8,4 % для хвои. Сеянцы, выращенные при 100 мкМ ZnSO4 в условиях 12-ч светового периода, развили хвоинок на 17,0 % меньше по сравнению с соответствующим контролем (таблица).
Таким образом, редуцирование ассимиляционного аппарата, опосредованное токсическим действием цинка, и недостаточная продолжительность светового дня привели к резкому снижению интенсивности прироста корневой системы, в свою очередь повлекшее слабое развитие сеянцев.
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 1/2012
101
ЛЕСНАЯ СЕЛЕКЦИЯ, ГЕНЕТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ
В условиях 16-ч светового периода хроническое действие 100 мкМ ZnSO4 привело к развитию несколько иных эффектов. Прежде всего, благодаря увеличившейся продолжительности дня развитие ассимиляционного аппарата значительно превосходило аналогичный опыт в условиях 12-ч светового периода (количество хвоинок увеличилось на 82 %), а ингибирование их образования при 100 мкМ ZnSO4 по сравнению с соответствующим контролем составило лишь 4,9 % (таблица). Благодаря более интенсивному функционированию ассимиляционного аппарата недобор биомассы сеянцев составил лишь
5,9 %. При этом ингибирование роста в длину корневой системы составило лишь 8,8 %.
В данных условиях средняя длина хвои уменьшилась более заметно по сравнению с 12-ч световым периодом. Это снижение составило 10,9 % по отношению к соответствующему контролю (таблица). Линейный рост семядолей ингибировался в меньшей степени, всего лишь на 3,7 %. В то же время увеличение продолжительности светового дня вызвало незначительное увеличение длины стволиков сеянцев (на 3,8 %).
Таким образом, увеличение продолжительности светового периода, помимо заметного стимулирования роста сеянцев в контрольных условиях, привело к существенному увеличению устойчивости сеянцев к хроническому действию 100 мкМ ZnSO4. Это проявлялось в менее выраженном ингибировании роста корневой системы и более интенсивном развитии ассимиляционного аппарата.
В связи с тем, что действие любого стрессора вызывает серьезный дисбаланс между образованием активных форм кислорода (АФК), скоростью их ликвидации и скоростью репарационных процессов, в сторону сверхпродукции АФК, развивается окислительный стресс [4]. Образование АФК происходит при неполном одноэлектронном восстановлении кислорода, в результате чего образуются свободные радикалы. Супероксидрадикал (O^_) является первичным продуктом восстановления. Он наиболее опасен для мембранных структур, имеет большое время жизни и становится источником других АФК [6]. Фермен-
том первой линии защиты клетки от суперок-сидрадикала является супероксиддисмутаза (СОД). Поэтому основные значимые изменения ферментативной активности в стрессовых условиях следовало искать именно в изменении активности СОД [1]. Нами определялась активность СОД в корнях, стволиках и хвое (в т.ч. семядоли) сеянцев.
В результате экспериментов установлено, что формирующиеся стволики сосны характеризуются самой высокой активностью СОД (по сравнению с корневой системой и хвоей) в условиях обоих световых периодов (рис. 1-3). Изменения активностей СОД в контрольных условиях и при действии 100 мкМ ZnSO4 не носили четкой достоверной зависимости (рис. 2).
Сравнение активностей СОД в контрольных условиях при 12-ч и 16-ч световых периодах показало значительно более высокую активность СОД во всех органах сеянцев, выращенных при 12-ч длине светового периода. Несмотря на довольно значительную вариабельность признака, активность СОД в корнях сеянцев при 12-ч световом периоде превышала в 5,2 раза активность СОД в корнях сеянцев, выращенных при 16 ч (рис. 1). Для стволиков в аналогичных условиях характерно превышение активности СОД в 3,6 раза (рис. 2), а для хвои - в 1,8 раз (рис. 3).
Действие 100 мкМ ZnSO4 в условиях 12-ч светового периода к значительным изменениям в активности СОД, по сравнению с соответствующим контролем, во всех исследованных органах не приводило. Отметим лишь незначительное падение активности СОД в хвое сеянцев.
Противоположная картина наблюдалась в активности СОД органов сеянцев, выращенных при 16-ч световом периоде. Как уже указывалось ранее, они обладали конститутивно меньшей активностью СОД по сравнению с 12-ч световым периодом. Хроническое действие 100 мкМ ZnSO4 вызывало увеличение активности СОД в корнях (в 2,4 раза) и хвое сеянцев (в 1,2 раза) (рис. 1, 3). В стволиках сеянцев, напротив, происходило снижение активности СОД в 1,6 раза (рис. 2).
Регистрируемые изменения активностей СОД носили, на первый взгляд, про-
102
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 1/2012
ЛЕСНАЯ СЕЛЕКЦИЯ, ГЕНЕТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ
300
1,26 100 ZnSO., мкМ
4
Рис. 1. Активность СОД в корнях сеянцев
800
3
5
ю
ь 600-
s
н
g 400 « s
S 200
(D
ч
о
1,26
ZnSO „ мкМ
100
Рис. 2. Активность СОД в стволиках сеянцев
300
0 т---^--------------1---
1,26 100 ZnSO,, мкМ
4’
Рис. 3. Активность СОД в хвое сеянцев
тиворечивый характер, поэтому для оценки стрессового состояния в хвое сеянцев было измерено содержание пролина - совместимого осмолита и универсального стресс-протектора. Проведенные исследования показали, что в контрольных условиях содержание пролина в условиях 16-ч светового периода превышало в 1,4 раза содержание пролина в хвое сеянцев, выращенных при 12 ч (рис. 4). Содержание пролина в условиях стресса (100 мкМ ZnSO4) изменялось лишь при длине дня 16 ч (в 1,5 раза больше соответствующего контроля).
Таким образом, действие стрессора (цинка) приводило к активации антиоксидантной защитной системы сеянцев и увеличению содержания пролина лишь в условиях 16-ч светового периода. Подобная тенденция характеризует типичное функционирование защитных систем растений в условиях стресса [1]. С другой стороны, регистрируемые изме-
3,5
ZnSO,, мкМ
Рис. 4. Содержание пролина в хвое сеянцев
нения в активностях СОД и содержании про-лина в органах сеянцев, выращенных при 12-ч световом периоде, свидетельствуют об ином протекании физиологических процессов.
Наиболее достоверным объяснением регистрируемых наблюдений следует считать несоответствие 12-ч светового периода для роста и развития сеянцев сосны обыкновенной. Как описывалось выше, естественный ареал сосны не спускается к широтам, в которых длина светового дня составляет менее 15-14 ч. Таким образом, именно выращивание сеянцев в условиях 12-ч светового периода уже является для них стрессовым фактором, возможно, определяющим и темпы развития органов сеянцев.
В пользу этого положения свидетельствуют многочисленные эксперименты с различными видами растений. Установлено, что затенение приводит к уменьшению соотношения корни/надземная часть. Это связано
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 1/2012
103
ЛЕСНАЯ СЕЛЕКЦИЯ, ГЕНЕТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ
со снижением интенсивности фотосинтеза в результате недостаточной освещенности и замедлению скорости оттока ассимилятов из хвои в корни. В итоге прежде всего подавляется рост корневой системы, а затем надземной части [3]. Это подтверждено в опытах с сеянцами сосны Банкса (Pirns banksiana Lamb.), лжетсуги Мензиса (Pseudotsuga menziesii (Mirb.) Franco), сосны смолистой (Pirns resinosa Sol. ex Aiton), сосны скрученной шероховатой (Pinus contorta Dougl. var. latifolia Engelm.) и звездчатки ланцентолист-ной (Stellaria longipes Goldie) [11, 12, 10].
В экспериментах с сосной ладанной (Pinus taeda L.) при 14-ч световом периоде установлено, что при высокой освещенности сеянцы имели меньшую устьичную проводимость и, таким образом, пониженную потерю воды и низкую интенсивность транспирации. В результате они оказались более устойчивыми к водному дефициту по сравнению с сеянцами, выращенными при низкой интенсивности освещения [14].
В опытах с сосной густоцветной (Pinus densiflora Siebold et Zucc.), сходной по требовательности к свету с сосной обыкновенной, установлено, что после раскрытия верхушечной почки на развитие сеянцев большее влияние оказывает интенсивность света, чем влажность почвы. При 20 % и 8 % интенсивности света рост сосны сильно ингибировался. При максимальной интенсивности света в условиях 14-ч светового периода значительно стимулировался прирост сеянцев в высоту, увеличивалось количество хвои, диаметр корневой шейки, прирост главного корня и образование вторичных корней [7].
В экспериментах с сосной смолистой (Pinus resinosa Ait.) наблюдалось сильное ингибирование роста при снижении интенсивности света ниже 50-60 % от естественной. Гибель сеянцев значительно возрастала при снижении интенсивности света ниже 15 % [12].
С биохимической точки зрения фотосинтез (световая часть) - это вызванный поглощенным светом транспорт электронов, в результате которого образуются аденозинтри-фосфат и восстанавливается НАДФ. В условиях слабой освещенности снижается степень
сопряжения работы электрон-транспортной цепи фотосинтеза с фотофосфорилированием. Это ведет к снижению интенсивности фотосинтеза, росту доли неуглеводных соединений [2]. Активность ферментов, вовлеченных в ассимиляцию NH4+ (глутаминсинтаза и фередок-син зависимая глутаматсинтаза), также регулируется светом [9]. В результате нарушается протекание темновой фазы фотосинтеза, что ведет к снижению темпов роста и накопления биомассы. С другой стороны, нарушение направленности окислительно-восстановительных реакций из-за дисбаланса метаболитов и нарушение функционирования цепей переноса электронов в мембранных структурах хлоропластов и митохондрий приводит к повышенному образованию супероксидрадикала [6].
В условиях низкой продолжительности светового дня (12 ч) сеянцы сосны обыкновенной характеризуются слабыми темпами роста, накопления биомассы и меньшей устойчивостью к хроническому действию цинка по сравнению с сеянцами, выращенными при 16-ч световом периоде. В условиях 12-ч дня у сеянцев сосны развиваются признаки сильного окислительного стресса, выражающиеся в повышенной активности СОД и нарушении функционирования защитных систем (СОД, пролин) в условиях хронического действия цинка. Сеянцы, выращенные в условиях 16ч светового периода, характеризовались более высокими темпами развития, накопления биомассы и оказались более устойчивыми к токсическому действию цинка. На биохимическом уровне они характеризовались нормальным функционированием защитных систем (активность СОД, содержание пролина) и проявляли классическую картину активации защитных систем в условиях стресса.
Таким образом, увеличение продолжительности светового дня способствует росту и развитию сеянцев и повышает их устойчивость к действию неблагоприятных факторов среды.
Работа выполнена при частичной поддержке гранта РФФИ 10-04-00799-а и Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
104
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 1/2012
