CC BY
72
УДК: 615.254-08-039.71
ВЛИЯНИЕ ДИСТАНТНОГО И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ НА ЭКСПРЕССИЮ ЭНДОГЛИНА И ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ NO-СИНШЫ В ПОЧКАХ В ОТДАЛЕННОМ ПЕРИОДЕ ПОСЛЕ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ
И.Н.ДОЛЖИКОВА1 М.В. ПОКРОВСКИЙ1 Т.Г. ПОКРОВСКАЯ1
A.А.ДОЛЖИКОВ1 С.А. АЛЕХИН2 И.М. КОЛЕСНИК2 С.В.МЯГЧЕНКО2
B.А. ФИЛИМОНОВ2
О.И. БРАТЧИКОВ2
Белгородский государственный национальный исследовательский университет
Курский государственный медицинский университет
e-mail: dolzhikov@bsu.edu.ru
В статье изложены результаты исследований влияния дистантного прекондиционирования путем создания кратковременной ишемии конечностей и фармакологического прекондиционирования ингибиторами фосфодиэстеразы-5 на экспрессию эндотелиального фактора CDl05 (эндоглина) и эндотелиальной NO-синтазы в клубочковых капиллярах почек в отдаленном периоде после ишемии-реперфузии. Установлено сопоставимое
протективное действие как дистантного, так и фармакологического прекондиционирования и их кумулятивный эффект. Обсуждаются возможные механизмы защитного действия прекондиционирования при ишемии-реперфузии почек.
Ключевые слова: ишемия-реперфузия почек,
прекондиционирование, ингибиторы фосфодиэстеразы-5, эндоглин, NО-синтаза.
Введение. Одной из самых острых проблем при патологии сердечнососудистой системы, нарушениях мозгового кровообращения, медицинских манипуляциях, связанных с временным выключением кровотока, является профилактика ишемических и реперфузионных повреждений органов. Одним из перспективных подходов к решению данной проблемы является разработка методов, основанных на феномене прекондиционирования - включении механизмов повышения резистентности структур органов к недостаточному кровоснабжению. Данное явление впервые открыто C. E. Murry и соавт. [8] как повышение резистентности миокарда к повреждению путем коротких эпизодов коронарной ишемии. Спектр исследований в настоящее время вышел далеко за рамки ишемической болезни сердца. Сформировалось не менее перспективное направление фармакологического прекондиционирования, основанное на знаниях отдельных механизмов повышения резистентности органов к ишемии [1, 3, 4]. На разных моделях показано протективное действие ингибиторов фосфодиэстеразы-5 при ишемических [6, 12, 14] и токсических повреждениях миокарда [7],
гипоксических повреждениях нейронов [5]. Одним из ключевых механизмов являются позитивные регуляторные эффекты в системе эндотелиальной синтазы окиси азота (eNOS). С этой системой тесным образом связан эндотелиальный представитель рецепторного комплекса трансформирующего фактора роста в-эндоглин (белок CD105), участвующий в нормальном эмбриогенезе сердечнососудистой системы, регуляции сосудистого тонуса, обладающий анти-апоптотическим действием при повреждении сосудистого эндотелия [9, 10, 11, 13, 15]. В связи с имеющимися неизученными аспектами проблемы нами была поставлена цель изучения эффектов дистантного и фармакологического прекондиционирования с применением ингибитора фосфодиэстеразы-5 тадалафила при ишемии-реперфузии почек.
Материал и методы исследования. Исследование выполнено на 60 белых лабораторных крысах-самцах массой 200-250 гр. Эксперименты проведены с соблюдением правил гуманного обращения с животными соотвественно «Конвенции
щщ
по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», принятой Советом Европы (Strasbourg, Франция, 1986) и директивой совета 86/609/ЕЕС от 24.11.1986 «По согласованию законов, правил и административных распоряжений стран-участниц в отношении защиты животных, используемых в экспериментальных и научных целях» с осуществлением хирургических вмешательств под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг массы внутрибрюшинно), выведением животных из эксперимента передозировкой хлоралгидрата внутрибрюшинным введением.
Животные распределены на 6 серий по 10 особей в каждой: контрольная (серия 1) и 5 экспериментальных. В серии 2 моделировали ишемическое-реперфузионное повреждение левой почки путем наложения лигатуры на почечную ножку с полным пережатием почечных артерии и вены на 30 минут. В серии 3 осуществляли дистантное прекондиционирование по ранее исследованной методике [2] путем наложения жгута на верхнюю треть правого бедра с пережатием до полного прекращения пульсации артерий конечности за 30 минут до моделирования ишемии-реперфузии левой почки. В серии 4 за 1 час до моделирования ишемии животным внутрибрюшинно вводили 1% раствор ингибитора фосфодиэстеразы-5 тадалафила (препарат «Сиалис» производства Eli-Lilly, Великобритания) на 10% диметилсульфоксиде (ДМСО) в дозе 1 мг/кг. В серии 5 осуществляли комбинированное дистантное и фармакологическое прекондиционирование: введение раствора сиалиса на ДМСО за 1 час и дистантное прекондиционирование за 30 минут до моделирования ишемии. В серии 6 за 30 минут до введения сиалиса животным внутрибрюшинно вводили блокатор АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламид (5 мг/кг на ДМСО), который является доказанным ингибитором прекондиционирующих механизмов.
Животных выводили из эксперимента через 21 сутки после моделирования ишемии. Почки взвешивали с определением относительной массы (гр/гр), после чего рассекали в продольном направлении через латеральный край и фиксировали в 10% забуференном (рН=7,0) формалине иммерсионным способом в течение 24 часов. Для гистологического исследования заливали половину продольно рассеченных почек в парафин и изготавливали срезы толщиной 4 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван-Гизон и по Маллори. Для иммуногистохимического исследования изготавливали мультиблоки по типу технологии «TissueMicroarray» по 15 кусочков размером зхз мм из участков сохраненной почечной ткани, выбранных после изучения обзорных препаратов. Иммуногистохимическое исследование выполнено с применением стандартного протокола высокотемпературной демаскировки антигенов при рН=6,0. Использованы поликлональные антитела к CD105 (SpringBioscience, USA; «Биовитрум») и эндотелиальной (eNOS) NO-синтазе (CellMarque, США; «Микротесты») в рекомендованных разведениях. Для выявления реакции применена полимерная система детекции HistoFine (Япония; «Микротесты») с хромогеном диаминобензидином. Микропрепараты для последующего анализа сканировали с применением системы сканирования и архивирования изображений (MiraxDesk, Германия; «Оптэк»). Последующее изучение и морфометрию с определением относительной площади иммунореактивного вещества осуществляли на компьютерных изображениях. Зону иммунореактивности в почечных клубочках выделяли по методу «компьютерного скелетирования» с определением отношения пикселей в зоне иммунореактивности к общей площади клубочков (в пикс.). В каждой серии производили морфометрию 30 клубочков во всех зонах коркового вещества. Морфологическое исследование выполнено в лаборатории научнообразовательного центра прикладной иммуноморфологии и цитогенетики НИУ БелГУ (руководитель - проф. А.А. Должиков). Статистическую обработку выполняли с применением статистического пакета Statistica 6.0 с предварительной оценкой типа распределения признаков и уровнем статистической значимости при p<0,05.
Результаты исследования. На 21-е сутки после моделирования ишемии-реперфузии в почках завершаются процессы организации очагов некрозов с развитием
нефросклероза различной степени выраженности. У интактных животных средняя относительная масса левой почки составляет 0,0049 гр/гр. На 21-е сутки во всех экспериментальных сериях масса левых почек снижена практически в равной степени: в серии 2 - 0,0035, серии 3 - 0,0031, серии 4 - 0,0032, серии 5 - 0,0030, серии 6 -
0,0032. Однако гравиметрические показатели не отражают структурные изменения, произошедшие в подвергнутых ишемии-реперфузии почках и в контрлатеральных почках. Через 3 недели после повреждения паренхима левых почек на 50-75% по результатам обзорного патогистологического исследования замещена склеротической фиброзной тканью, тогда как в сериях с различными вариантами прекондиционирования нефросклеротические изменения имели сегментарный характер с поражением не более 50% почечной ткани. Закономерных изменений относительной массы правых почек, которая могла бы отражать компенсаторную гипертрофию, мы не выявили, но в группе 2 она была наибольшей (0,0042).
Результаты количественной оценки экспрессии CDl05 и eNOS представлены в таблице. В норме оба маркера относительно равномерно экспрессируются в эндотелии клубочковых капилляров, в несколько меньшей степени в перитубулярных капиллярах. Определяется яркая экспрессия в эндотелии мелких артерий (рис. 1, 2). На 21-е сутки после ишемии-реперфузии почек как визуально, так и при количественном анализе определяется достоверное снижение экспрессии обоих маркеров в клубочковых капиллярах (рис. 1Б, 2Б) вне зависимости от топографии и диаметров почечных телец. При корреляционном анализе не выявлено достоверной зависимости между экспрессией CDl05 и eNOS во всех сериях, кроме 6-й (с введением глибенкламида). В этой серии коэффициент линейной корреляции составил 0,92, коэффициент корреляции Спирмена 0,88 (р<0,05). При различных вариантах прекондиционирования выявлены в целом положительные, но отличающиеся по степени выраженности эффекты. В серии 3 с дистантным прекондиционированием экспрессия CDl05 приблизилась к значениям у интактных контрольных животных, экспрессия eNOS осталась достоверно ниже. Напротив, при фармакологическом прекондиционировании ингибитором фосфодиэстеразы-5 сиалисом (серия 4) уровень экспрессии CDl05 оказался ниже контрольных значений, а экспрессия eNOS вернулась к показателям у контрольных животных. При комбинированном прекондиционировании (серия 5) показатели экспрессии обоих маркеров не отличались от контрольных, уровень CDl05 был даже несколько выше (таблица). Введение глибенкламида, как показывают количественный анализ и визуально наблюдавшиеся изменения, в равной степени блокирует эффект комбинированного прекондиционирования в отношении как CD105, так и eNOS.
Таблица
Количественные показатели экспрессии CD105 и eNOS в почечных клубочках
№ серии Вид эксперимента Удельная площадь иммунореактивного вещества (%) среднее значение + о
CD105 eNOS
1 Контрольная 15,67+1,65 24,30+3,48
2 Ишемия-реперфузия левой почки 7,23+1,73* 5,73+1,82*
3 Дистантное прекондиционирование, ишемия-реперфузия почки 14,47+1,55 15,80+1,94*
4 Фармакологическое прекондиционирование - ишемия-реперфузия почки 12,27+1,72* 25,63+3,09
5 Фармакологическое+дистантное прекондиционирование - ишемия-реперфузия почки 17,8+1,47* 24,90+3,29
6 Фармакологическое+дистантное прекондиционирование на фоне введения глибенкламида - ишемия-реперфузия почки 6,80+1,61* 7,03+1,77*
Примечание: * —p<0,05 по критерию t Стьюдента.
*'•' V ^Щшг> А ■ * Ж- Л11.1 ** 4-> ’ ;^Й38м Зу!» /г*4 Тт? А Л Л» * г/ ' * - *’ФЦГ" • : V . Е& >'«*Г ' у 4, ■' -г т ** »»'г «• • * * ▼** * ' У^Л. и " , - V « а Л -ЛР4г _ .•>&►><^44? - .-V ■ * • С£ ч * Б
• Х\ к <^1#'|Г £ , *-
» #> , ТТт.^ 4 * 1 ЪШЛк V1 .л-Т -/ т. V »/с" , > * '-5 - -* А* ? '• ^ , т*к?ъ<£\ Е с
Рис. 1. Различия в экспрессии CDl05 в контроле (А), на 21-е сутки после ишемии-реперфузии левой почки (Б), при дистантном прекондиционировании (В), фармакологическом прекондиционировании (Г), при комбинированном прекондиционировании (Д) и на фоне введения глибенкламида (Е): равномерная экспрессия гликопротеина CDl05 в эндотелии клубочковых капилляров в контроле, ее различная степень восстановления при прекондиционировании с минимальной выраженностью в серии с фармакологическим прекондиционированием (Г), резкое снижение экспрессии после ишемии в отдаленном периоде (Б) и на фоне введения глибенкламида (Е). Иммуногистохимические реакции.
Микрофото. х 400
иВв/ * * W 9'iV ./y« 5 *■ у <!▼ ’-а * л* л* Б
в *■ ^ Г - ' -
Д " 7 . - - * . ' у¿Яр*' >л А1 < Ш% V 4*' - iL V 1 лчЕ*. ч* VI • '/*£ • E *« t + ‘
Рис. 2. Различия в экспрессии eNOS в контроле (А), на 21-е сутки после ишемии-реперфузии левой почки (Б), при дистантном прекондиционировании (В), фармакологическом прекондиционировании (Г), при комбинированном прекондиционировании (Д) и на фоне введения глибенкламида (Е): равномерная экспрессия фермента в эндотелии клубочковых капилляров в контроле, ее различная степень восстановления при прекондиционировании с минимальной выраженностью в серии с дистантным прекондиционированием (В), резкое снижение экспрессии после ишемии в отдаленном периоде (Б) и на фоне введения глибенкламида (Е). Иммуногистохимические реакции. Микрофото. х 400
Обсуждение результатов исследования. В результате проведенного исследования выявлены положительные эффекты как дистантного, так и фармакологического прекондиционирования с применением ингибитора фосфодиэстеразы-5 сиалиса при ишемии почек в эксперименте, эффект их комбинированного действия. При этом количественные показатели свидетельствуют о некоторых отличиях в эффектах дистантного и фармакологического
HHájj
прекондиционирования. Прекондиционирующий эффект в целом объясняется, прежде всего, известным механизмом накопления циклического гуанозин-монофосфата (ц-ГМФ) при блокаде фосфодиэстеразы-5, с повышением уровня протеинкиназы-G, снижением содержания свободного цитоплазматического кальция и расслаблением гладких миоцитов сосудов с увеличением кровотока. С непосредственным действием ингибитора фосфодиэстеразы-5 сиалиса на NO-зависимую систему активации гуанилат-циклазы и накопления ц-ГМФ можно связать выявленный нами факт, что при фармакологическом прекондиционировании восстановление экспрессии eNOS происходит в большей степени, чем экспрессии CD105. Эффекты действия CD105 на систему eNOS реализуются более сложными путями как на уровне увеличения синтеза матричной РНК eNOS, так и на посттрансляционных этапах, в частности, за счет увеличение периода полураспада eNOS. Кроме этого, активизация мембран-связанной системы CD105-eNOS, в комплексе с которой находятся кальмодулин, белок теплового шока 90 (HSP90) и кавеолин, требует связывания со свободным кальцием. Таким образом, кумулятивный эффект действия дистантного и ишемического прекондиционирования может быть объяснен генетическими и эпигенетическими эффектами дистантного прекондиционирования за счет активизации систем антигипоксической защиты, в которые входят CD105 и белки теплового шока, дополняемые кальций-зависимой активизацией комплекса CD105-eNOS. Известно также, что ц-ГМФ является ингибитором белка рз8, за счет чего увеличивается экспрессия антиапоптотического белкаbcl-2 [5].
Выводы:
1. Дистантное прекондиционирование путем кратковременной ишемии конечности и фармакологическое прекондиционирование ингибитором фосфодиэстеразы-5 сиалисом обладает протективным эффектом на эндотелий сосудов клубочков почек, уменьшая степень повреждения в отдаленном периоде после ишемии-реперфузии, что реализуется по CD105 и eNOS зависимым путям.
2. При дистантном прекондиционировании восстановление экспрессии CD105 происходит раньше, чем eNOS; при фармакологическом прекондиционировании наблюдается обратная зависимость.
3. Дистантное и фармакологическое прекондиционирование обладают кумулятивным защитным эффектом при ишемии-реперфузии почек.
Исследование выполнено в рамках государственного задания на НИОКР (госконтракт №4.913.2011).
Литература
1. Возможности фармакологической коррекции хронической ишемии конечности в эксперименте / Е.Б. Артюшкова, Д.В. Пашков, М.В. Покровский и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008. - Т. 71. - № 3. - С. 23-25.
2. Дистантное и фармакологическое прекондиционирование - новые возможности стимуляции неоваскулогенеза / И.М. Колесник, М.В. Покровский, О.С. Гудырев и др. // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - № 6(120). - С. 56-58.
3. Методические подходы для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте / М.В. Покровский, В.И. Кочкаров, Т.Г. Покровская и др. // Кубанский научный медицинский вестник. - 2006. - № 10(91). - С. 72-77.
4. Фармакологическая коррекция L-аргинином «ADMA-ENOS-ассоциированных мишеней» при экспериментальной преэклампсии / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.В. Гуреев и др. // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - № 1. - С. 85-92.
5. Phosphodiesterase-5 inhibition abolishes neuron apoptosis induced by chronic hypoxia independently of hypoxia-inducible factor-1 a signaling / A. Caretti, P. Bianciardi, R. Ronchi et al. // J. of Experimental Biology and Medicine. - 2012. - Vol. 233. - P. 1222-1230.
6. Das, A. Phosphodiesterase-5 inhibitor sildenafil preconditions adult cardiac myocytes against necrosis and apoptosis / A. Das, L. Xi, C. Kukreja // The Journal of Biological Chemistry. -2005. - Vol. 280, № 13. - P. 12944-12955.
7. Phosphodiesterase 5 inhibition with sildenafil attenuates cardiomyocyte apoptosis and left ventricular dysfunction in a chronic model of doxorubicin cardiotoxicity / P.W. Fisher, F.N. Salloum, A. Das et al.// Circulation. - 2005. - Vol. 111. - P. 1601-1610.
8. Murry, C.E. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium / C.E. Murry, R.B. Jennings, К.А. Reimer // Circulation. - 1986. - Vol. 14. - Р. 1124-1136.
9. TGF-P receptor function in the endothelium / F. Lebrin, M. Deckers, P. Bertolino, P. Dijke // Cardiovasc. Research. - 2005. - Vol. 65. - P. 599-608.
10. CD 105 prevents apoptosis in hypoxic endothelial calls / C. Li, P. Issa, P. Kumar et al. // Journal of Cell Science. - 2003. - Vol. 116. - P. 2677-2685.
11. Lopez-Novoa, J. The physiological role of endoglin in the cardiovascular system / J. Lopez-Novoa, C. Bernabeu // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2010. - Vol. 299. - P. 959-974.
12. Reffelmann, T. Phosphodiesterase 5 inhibitors: are they cardioprotective? /
T. Reffelmann, R. Kloner // Cardiovasc. Research. - 2009. - Vol.83. - P. 204-212.
13. Endoglin Expression is Regulated by transcriptional cooperation between the hypoxia and transforming growth factor- в pathways / T. Sanchez-Elnsner, L. Botella, B. Velasco et al. // The Journal of Biological Chemistry. - 2002. - Vol. 277. - P. 43799-43808.
14. Phosphodiesterase-5 inhibitor, Tadalafil, protects against myocardial ischemia/reperfusion through protein-kinase G dependent generation of hydrogen sulfide / F.N. Salloum, V.Q. Chau, N.N. Hoke et al. // Circulation. - 2009. - Vol. 120. - Р. 31-36.
15. Hypoxic induction of endoglin via mitogen-activated protein kinases in mouse brain microvascular endothelial cells / Y. Zhu, Y. Sun, L. Xie et al. // Journal of the American Heart Association. - 2003. - Vol. 34. - P. 2483-2488.
INFLUENCEOF DISTANTAND PHARMACOLOGICAL PRECONDITIONING ON EXPRESSION OF ENDOGLIN AND ENDOTHELIAL NO-SYNTHASE IN KYDNEYS IN THE LATE PERIOD AFTER ISCHEMIA-REPERFUSION
I.N. DOLZHIKOVA1, М.V. POKROVSKY1 LG. POKROVSKAYA1^. DOLZHIKOV S.А.АLEHIN2,I.М. KOLESNIK2 S.V. MYAGCHENKO2 V.A. FILIMONOV2 O.I. BRATCHIKOV2
1) BelgorodNational Research University
2) Kursk State Medical University e-mail: dolzhikov@bsu.edu.ru
In the paper the data about influence of the distant and pharmacological preconditioning by phosphodiesterase-5 inhibitor tadalafil on the expression of endothelial factor CD105 (endoglin) and endothelial NO-synthase in glomerular capillaries of the kidneys in the late period after ischemia-reperfusion have been presented. As distant as pharmacological preconditioning protect kidneys from the ischemic injury, and cumulative effect is stronger. The possible mechanisms of defensive effects in ischemia-reperfusion of the kidneys are discussed.
Keywords: ischemia-reperfusion of kidneys, preconditioning, phosphodiesterase-5 inhibitor, endoglin, NOsynthase.
