CC BY
41
DOI: 10.24411/2074-5036-2019-10042 УДК 576.08
Ключевые слова: абсансная эпилепсия, миндалевидный комплекс, астроциты, глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP)
Keywords: absence epilepsy, amygdala, astrocytes, glial fibrillary acidic protein (GFAP).
Денисова В. В., Файрушина А. И. , Хисматуллина З. Р. , Садртдинова И. И.
ВЛИЯНИЕ ДЕФИЦИТА ТЕСТОСТЕРОНА НА МОРФОЛОГИЮ И КОЛИЧЕСТВО АСТРОЦИТОВ МИНДАЛЕВИДНОГО КОМПЛЕКСА МОЗГА КРЫС С АБСАНС-ЭПИЛЕПСИЕЙ
THE EFFECT OF TESTOSTERONE DEFICIENCY ON THE MORPHOLOGY AND QUANTITY OF ASTROCYTES OF THE BRAIN'S AMYGDALA OF RATS WITH ABSENCE EPILEPSY
ФГБОУ ВО «Башкирский государственный университет» Адрес: 450076, Россия, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32 Bashkir State University Address: 450076, Russia, Ufa, Zaki Validi St., 32
Денисова Вероника Владимировна, магистрант биологического факультета кафедры физиологии
и общей биологии. E-mail: veronika.denisova.2015@mail.ru Denisova Veronika Vladimirovna, master student of the Faculty of Biology, Department of Physiology
and General Biology. E-mail: veronika.denisova.2015@mail.ru Файрушина Аделия Ильдаровна, магистрант биологического факультета кафедры физиологии и общей биологии. E-mail: fayrushina96@mail.ru Fayrushina Adelia Ildarovna, master student of the Faculty of Biology, Department of Physiology and General Biology. E-mail: fayrushina96@mail.ru Хисматуллина Зухра Рашидовна, д. б. н., проф., зав. кафедрой физиологии и общей биологии. E-mail: hismatullinazr@mail.ru Khismatullina Zukhra Rashidovna, Doctor of Biological Sciences, professor, Head of Department of Physiology
and General Biology. E-mail: hismatullinazr@mail.ru Садртдинова Индира Илдаровна, к. б. н., доцент кафедры физиологии и общей биологии. E-mail: indira.ildarovna@mail.ru Sadrtdinova Indira Ildarovna, PhD of Biological Sciences, assistant professor of Department of Physiology and General Biology. E-mail: indira.ildarovna@mail.ru
Аннотация. Эпилепсия - одно из наиболее широко распространенных неврологических заболеваний населения. Несмотря на многочисленные исследования, механизмы возникновения данной патологии недостаточно изучены. Целью работы стало изучение морфофункционального состояния астроцитов переднего кортикального ядра миндалевидного комплекса мозга при дефиците тестостерона при неконвульсивной (абсансной) форме эпилепсии. В экспериментальном исследовании на лабораторных животных - самцах крыс линии WAG/Rij, являющихся признанной моделью абсансной эпилепсии, продемонстрировано влияние дефицита тестостерона на астроцитар-ную глию. Исследование проведено с использованием современного метода окрашивания клеток - иммуноги-стохимии, которым выявляли содержание маркера астроглиальных клеток - кислого глиального фибриллярного белка (GFAP). Выявлена реактивность астроцитов, которая выражалась в изменении морфологических и морфо-метрических параметров. Измерение морфометрических характеристик показало, что после экспериментальной орхидэктомии происходит увеличение размеров клеток. Подсчет количества астроцитов демонстрирует их явную пролиферацию в ответ на понижение уровня половых гормонов в группе орхидэктомированных животных. Summary. Epilepsy is one of the most widespread neurological diseases of population. Despite numerous studies, the mechanisms of occurrence of this pathology are not enough understood. The purpose of the work was to study the changes in the morphofunctional state of the astrocytes of the anterior cortical nucleus of the brain's amygdala in response to testosterone deficiency at nonconvulsive (absence) form of epilepsy. In an experimental study on laboratory animals - male WAG / Rij rats, which is a recognized model of human absence epilepsy, the effect of testosterone deficiency on astrocytes was demonstrated. The study was conducted using the modern cell staining method - immunohistochemistry. Using an immunohistochemical method, we detected the content of the marker of astroglial cells - a glial fibrillary acidic protein (GFAP). Reactivity of astrocytes was revealed, and it was expressed in changes of morphological and morphometric parameters. Measurement of morphometric characteristics showed that after experimental orchidectomy there is an increase in cell sizes. Counting the number of astrocytes demonstrates their apparent proliferation in response to a decrease of the level of sex hormones in the group of orchidectomized animals.
Введение
Эпилепсия является хронической нейро-генной патологией, которая обычно спровоцирована нарушениями в центральной нервной системе (ЦНС). В иерархии общих и неврологических заболеваний эпилепсия занимает третье место [1, 5, 13]. Известно об эндокринологическом участии в регуляции возникновения абсансных эпилептических приступов [8].
Миндалевидный комплекс (МК) мозга обладает низким порогом чувствительности к судорожной активности [7]. Он участвует в ключевых механизмах регуляции широкого спектра физиологических процессов, а также играет ведущую роль в регуляции нейро-эндокринных процессов и поведения [2, 3, 4]. Как нейроэндокринный центр, выполняя регуляцию секреции гонадотропинов и участвуя в организации полового поведения, МК контролирует половое созревание организмов и взаимодействует с гипоталамиче-ской областью мозга [4, 14, 15].
Переднее кортикальное ядро (СОа) миндалевидного комплекса мозга является элементом нейроэндокринной системы мозга, так как нейроны СОа имеют рецепторы к половым стероидам и реагируют на их уровень изменением своей функциональной активности [2, 4]. В ранее проведенных электрофизиологических исследованиях было выявлено, что СОа является областью мозга, в которой регистрировались пик-волновые разряды (SWD), характерные для абсанс-эпилепсии [10].
Всё вышеизложенное объясняет повышенный интерес к изучению изменений мор-фофункциональных характеристик астроци-тов СОа МК мозга при абсансной эпилепсии, которые обусловлены влиянием на них половых гормонов.
Материалы и методы. Исследование было проведено на половозрелых самцах крыс линии WAG/Rij (п=24) с массой тела 250-300 г, в возрасте шести месяцев, являющихся инбредной линией с абсансной эпилепсией. Крысы были разделены на две группы: контрольную и группу орхидэктомирован-ных животных. Животные были выращены в стандартных условиях вивария кафедры
80
физиологии и общей биологии БашГУ, характеризующихся постоянством комнатной температуры (20°-22°С) и уровнем влажности.
С целью моделирования дефицита половых гормонов была проведена орхидэктомия самцов [4]. После операции крыс помещали в чистую клетку и содержали при обычных условиях. Через месяц были произведены декапитация животных и извлечение головного мозга для изготовления микропрепаратов исследуемой нами структуры МК. В течение всего эксперимента контрольных и опытных животных содержали без стрессовых и медикаментозных воздействий. Работа с экспериментальными животными, а также выведение их из эксперимента проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР от 12.08.1977 № 755).
Образцы фиксировались в 10 % забуфе-ренном формалине, далее заливались в парафиновые блоки по общепринятой методике. Изготовление серийных срезов во фронтальной плоскости толщиной 4 мкм проводилось на микротоме Leica RM 2145 (Германия).
Далее срезы окрашивали с помощью иммуногистостейнера Leica Microsystems BONDTM (Германия). Иммуногистохимиче-ским методом выявляли содержание маркера глиальных клеток - высокоспецифичного кислого глиального фибриллярного белка (GFAP) на парафиновых срезах согласно протоколу, указанному производителем: использовали мышиные моноклональные антитела (Santa Cruz Biotechnology) и универсальную систему вторичной детекции для визуализации (NovocastraTM). Исследовали СОа МК мозга крыс линии WAG/Rij до и после орхи-дэктомии. После проведения иммуногисто-химической реакции ядра клеток докрашивались гематоксилином.
Оценку структурных изменений астро-цитов проводили с помощью микроскопа МИКМЕД-5 (ЛОМО) и камеры Levenhuk C510 при увеличении х400. С помощью специализированного программного обеспечения PhotoM и ToupView производились измерение площади и подсчёт клеток глии.
Математико-статистическую обработку данных проводили с помощью программы «STATISTICA» v.10.0 (Stat Soft Inc., США). Для оценки различий в независимых группах использовался непараметрический критерий Манна-Уитни (Mann-Whitney U test). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты исследования и обсуждение
В ходе иммуногистохимического исследования было отмечено, что астроциты СОа МК головного мозга крыс реагируют на изменение уровня половых гормонов. На гистологических препаратах было выявлено изменение степени экспрессии GFAP в СОа МК мозга крыс линии WAG/Rij до и после орхидэктомии (рис. 1-2).
На контрольных препаратах выявлялись астроциты различной полигональной формы: звездчатые, веретеновидные, пирамидо-образные и т.д. (рис. 1).
Контуры астроцитов определялись четко, количество отростков незначительное. GFAP умеренно экспрессировался в телах и отростках астроцитов. Клетки можно охарактеризовать как гипохромные, с хорошо определяющимися ядрами, имеющими центральное положение.
После орхидэктомии (рис. 2) клетки астро-глии в экспериментальной группе характеризовались как гиперхромные, клеточные ядра
плохо визуализировались. Определяется густая сеть толстых древовидных отростков астроцитов, происходит резкое повышение уровня GFAP. Форма астроцитов стала исключительно звездоподобной. Нечеткость и расплывчатость границ клеток объясняется их гипертрофией - ответной реакцией на повреждение, проявляющейся признаками ци-тотоксического отека, повреждающего белки промежуточных филаментов в телах и отростках.
Наши результаты коррелируют с литературными данными, в которых астроциты в ответ на выраженное ограничение кровотока в головном мозге иммунопозитивно реагировали на GFAP [6; 19], что объясняется их повышенной активностью.
Следующим этапом после визуального анализа морфологической картины стало проведение морфометрического анализа астроцитов на микрофотографиях (табл. 1).
Результаты измерения морфометрических параметров показали, что экспериментально вызванный дефицит половых стероидов стимулирует увеличение размеров клеток на 37,43 % по сравнению с интактной группой.
Подсчет количества астроцитов демонстрирует их явную пролиферацию в ответ на понижение уровня половых гормонов: количество клеток увеличилось на 57,32 %.
Таким образом, уровень функциональной активности астроцитов определяется их
Рис. 1. Экспрессия кислого глиального фибриллярного белка (коричневый цвет) в СОа МК мозга крыс линии WAG/Rij в контрольной группе. Непрямой иммунопе-роксидазный метод с подкраской гематоксилином. Ув. х400.
Рис. 2. Экспрессия кислого глиального фибриллярного белка (коричневый цвет) в СОа МК мозга крыс линии WAG/Rij после орхидэктомии. Непрямой иммунопе-роксидазный метод с подкраской гематоксилином. Ув. х400.
81
Таблица 1
Динамика площади и числовых показателей астроцитов в переднем кортикальном ядре МК мозга при дефиците тестостерона у самцов крыс (M±m)
Исследуемый параметр Контроль Орхидэктомия Достоверность различий
Площадь астроцитов, мкм2 380,68±15,84 523,17±20,03 р<0,05
Количество астроцитов 15,37±0,92 24,18 ±1,26 р<0,05
морфологическими и численными изменениями, которые зависят от их окружения, так как они меняют свою форму на звездчатую только при активном контакте с соседними клетками.
Морфоструктурные параметры могут быть использованы в качестве критериев при исследовании нейропатологических процессов [9, 11, 12]. Влияние дефицита андрогенов, являющегося травматичным фактором для нервной системы, на морфофункциональное состояние астроцитов проявляется астроцитарной реакцией: гипертрофией и гиперплазией клеток, в связи с чем увеличивается число синаптических контактов, из-за чего астроциты приобретают форму звезды с большим числом крупных отростков. Такая реакция астроцитов на изменение уровня половых гормонов подтверждает данные об их влиянии на морфологию структур головного мозга [4, 14, 15].
Список литературы
1. Авакян Г. Н. Репродуктивные нарушения у мужчин с эпилепсией / Г. Н. Авакян, О. Л. Бадалян, Е. В. Крикова, А. С. Чуканова, С. Г. Бурд // Эпилепсия и пароксизмальные состояния. 2010. №1. С. 30-36.
2. Ахмадеев А. В. Нейробиологические основы девиантного поведения при алкоголизме / А. В. Ах-мадеев, Л. Б. Калимуллина // Вестник Башкирского государственного университета. 2015. № 2.
3. Ахмадеев А. В. Нейроэндокринная регуляция функций миндалевидного тела мозга: роль половых стероидов и норадреналина / А. В. Ахмадеев, Л. Б. Ка-лимуллина // Морфология. 2010. № 5. С. 73-77.
4. Бабичев В. Н. Нейроэндокринный эффект половых гормонов / В. Н. Бабичев // Успехи физиологических наук. 2005. №1. С. 54-67.
5. Блинов Д. В. Общность ряда нейробиологиче-ских процессов при расстройствах деятельности ЦНС /Д. В. Блинов // Эпилепсия и пароксизмальные состояния. 2011. № 2. С. 28-33.
6. Воронков Д. Н. Иммуноцитохимические и мор-фометрические изменения астроглии в перифокаль-ной зоне моделируемого инфаркта миокарда мозга / Д. Н. Воронков, О. В. Сальникова, Р. М. Худоерков // Анналы клинической и экспериментальной неврологии. 2017. № 1. С. 40-46.
7. Ильюченок Р. Ю. Миндалевидный комплекс (связи, поведение, память). / Р. Ю. Ильюченок. Новосибирск: Наука, 1981.
8. Кабак Я. М. Практикум по эндокринологии. / Я. М. Кабак. М.: Изд-во МГУ, 1968.
9. Наумов Н. Г. Реактивные изменения нейронов и астроцитов прилежащего ядра головного мозга после ограничения кровотока у крыс / Н. Г. Наумов, А. В. Дробленков // Вестник Новгородского государственного университета. 2016. № 6. С. 143-147.
10. Садртдинова И. И. Стероидная регуляция нейронной возбудимости в переднем кортикальном ядре миндалевидного комплекса мозга у крыс линии WAG/ Rij / И. И. Садртдинова, З. Р. Хисматуллина // Биомедицина. 2014. № 2. С. 64-72.
11. Резников А. Г. Половые гормоны и дифференциация мозга. / А. Г. Резников. Киев: Наук. думка, 1982.
12. Рыжавский Б. Я. Развитие головного мозга: отдаленные последствия влияния некомфортных условий. / Б. Я. Рыжавский. Хабаровск: Изд-во ДВГМУ, 2009.
13. Толмачева Е. А. Роль половых стероидов в регуляции спайк-волновой активности у крыс линии WAG/Rij. Автореф. ... дис. канд. биол. наук. / Е. А. Толмачева. М., 2006.
14. Montouris G. Reproductive and sexual disfunction in men with epilepsy / Montouris G., Morris G. // Epilepsy & Behavior. 2005. № 7. Р. 7-14.
15. Wang Q. The roles of estrogen and progestin in epileptogenesis and their mechanisms of action / Wang Q. // Sheng Li KeXueJin Zhan. 2000. № 3. Р. 231-233.
Подписной индекс журнала «Актуальные вопросы ветеринарной биологии»:
Агентство «Роспечать» - 33184
