CC BY
12
УДК 577.152.3:579.234
ВЛИЯНИЕ БЛОК-СОПОЛИМЕРОВ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ НА ВТОРИЧНУЮ СТРУКТУРУ И СТАБИЛЬНОСТЬ СТАФИЛОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА LYSK
Л.Ю. Филатова1*, Д.М. Донован2, И.А. Новожилов1, Т.А. Чубарь1, Н.Г. Балабушевич1, В.Г. Пугачев3, Н.Л. Клячко1
(1Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет; Институт природных ресурсов, Сельскохозяйственный центр Бельствилля, США; 3Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биоинженерии «Вектор», Новосибирск; *e-mail: luboff.filatova@gmail.com)
Разветвленный блок-сополимер полиэтиленимина и полиэтиленгликоля (ПЭИ-ПЭГ) и линейный блок-сополимер полилизина и полиэтиленгликоля (ПЛЛ-ПЭГ) образуют комплексы со стафилолитическим ферментом LysK, включение в которые происходит с увеличением эффективности лизиса (в 1,5-2 раза) и времени полуинактивации фермента (в 2-20 раз). Стабилизирующие эффекты блок-сополимеров зависят от температуры, концентрации NaCl и соотношения полимер/фермент. Линейный ПЛЛ-ПЭГ, будучи более эффективным стабилизатором, обеспечивает увеличение стабильности LysK, отвечающее требованиям к материалам биомедицинского назначения (сохранение 100%-й активности фермента через 4 месяца при 4 °С).
Ключевые слова: Staphylococcus aureus, литические ферменты бактериофагов, полимеры, стабильность, структура.
Грамположительная бактерия Staphylococcus aureus проявляет себя по отношению к организму человека как опасный патоген, быстро вырабатывающий устойчивость к антибиотикам. Очевидно, что помимо совершенствования существующих методов лечения стафилококковых инфекций необходим поиск альтернативных способов противо-бактериального лечения. К одним из таких способов можно отнести использование цитолитиче-ских ферментов бактериофагов, которые называют лизинами или лизоцимами [1, 2]. Эти ферменты разрушают клеточную стенку патогенов за счет гидролиза химических связей в пептидогликане на начальной (лизис снаружи) и конечной (лизис изнутри) стадиях литического цикла бактериофагов. Лизин фага K (LysK), лизирующий клетки антибиотикорезистентных штаммов S. aureus [3], представляет интерес как потенциальная основа для разработки лекарственных препаратов, однако недостаточная стабильность (при хранении) снижает возможность практического использования LysK [4].
Ранее был обнаружен эффект существенной стабилизации LysK положительно заряженными линейными полимерами за счет формирования комплексов [5, 6]. Однако из-за токсичности поликатионов предпочтительнее использовать блок-сополимеры, содержащие заряженный и неионо-генный полимерные блоки.
В настоящей работе для изучения влияния природы заряженного фрагмента блок-сополимера на антимикробную активность, стабильность и структуру LysK использовали блок-сополимеры, содержащие положительно заряженный блок и полиэтиленгликоль (ПЭГ). Это блок-сополимер полиэтиленимина и ПЭГ ПЭИ-ПЭГ (молекула содержит разветвленный положительно заряженный блок из полиэтиленимина и ПЭГ), блок-сополимер полилизина и ПЭГ ПЛЛ-ПЭГ (молекула содержит линейный положительно заряженный блок из полилизина и ПЭГ).
Экспериментальная часть
Реагенты. Рекомбинантный LysK получали в соответствии с методикой [3], очищенный препарат фермента хранили в буферном растворе (50 мМ фосфата натрия, 300 мМ хлорида натрия, 250 мМ имидазола, 30% глицерина, pH 8,0) в концентрации 11,0 мг/мл при -20 °С.
Культуру бактерий Staphylococcus aureus выращивали на L-бульоне до экспоненциальной фазы (4,0x10 кл./мл), автоклавировали в течение 30 мин при 0,6-0,7 атм, остывшую суспензию осаждали центрифугированием при 9000 rpm в течение 20 мин, осадок клеток промывали дважды физиологическим раствором. Полученную суспензию проверяли на наличие живых бактерий путем высева образцов на агаризованные питательные
среды. Автоклавирование клеток S. aureus проводили для обеспечения безопасности работы с данным микроорганизмом. Сохранение целостности клеточных стенок S. aureus было подтверждено методом электронной микроскопии. Идентичность кинетических параметров фермента при использовании для измерения его активности живых и автоклавированных клеток подтверждена экспериментально [7, 8].
Для проведения экспериментов использовали полимер ПЛЛ-ПЭГ (9,9 кДа, 30 первичных аминогрупп) фирмы «Alamanda Polymers» и блок-сополимер ПЭИ-ПЭГ (12,6 кДа), любезно предоставленный сотрудниками медицинского центра Небраски, его молекула содержит 17 первичных, 16 вторичных и 13 третичных аминогрупп.
Получение комплексов LysK с блок-сополимерами. Раствор фермента LysK (11,0 мг/мл, 50 мМ фосфата натрия, 300 мМ хлорида натрия, 250 мМ имидазола, 30% глицерина, рН 8,0) разбавляли раствором положительно заряженного блок-сополимера ПЛЛ-ПЭГ или ПЭИ-ПЭГ (20 мМ глицин, рН 9,0) с заданной концентрацией NaCl (0-500 мМ) до установления концентрации фермента 0,4 мг/мл. Для образования комплексов полученные образцы инкубировали 30 мин при 22 °С.
Получены образцы комплексов с концентрацией фермента 0,4 мг/мл, молярным соотношением зарядов полимер/фермент (Z), равным 1:1 и 10:1, концентрацией хлорида натрия 10-500 мМ, значением рН среды, равным 9,0.
Изучение влияния полимеров на активность LysK. Измерение активности проводили на спектрофотометре «Jen-way 6405 UV/Vis», используя стандартную спектрофотометрическую кювету объемом 0,5 мл (длина оптического пути 1 см).
В 20 мМ калий-фосфатном буфере (pH 7,5) готовили суспензию клеток S. aureus (A600 = 0,6 ед. оптической плотности). Суспензию клеток (0,5 мл) нагревали до 37 °С с последующей
регистрацией фонового лизиса. Затем к суспензии S. aureus добавляли 5-10 мкл раствора фермента или смеси фермента и полимера (LysK 0,4 мг/мл) с последующей регистрацией изменения оптической плотности в течение 10-15 мин. Скорость реакции определяли как изменение оптической плотности в единицу времени, нормировали на единицу массы фермента LysK и выражали в ед. погл./смг.
Изучение влияния полимеров на стабильность LysK. Растворы LysK в смеси с полимерами инкубировали при значениях температуры 4 и 22 °С в течение выбранных промежутков времени с последующим отбором аликвот растворов для измерения активности в стандартных условиях. Концентрация фермента в инкубируемых растворах составляла 0,4 мг/мл.
Исследование вторичной структуры LysK в комплексах с полимерами методом ИК-спектроскопии. ИК-спектры водных растворов LysK в комплексах с полимерами регистрировали согласно писанной ранее методике [6].
Определение размеров частиц комплексов LysK с полимерами. Размер и заряд частиц LysK после добавления полимеров (рН 9,0, концентрация фермента 0,4 мг/мл, температура 22 °С, Z = 1:1 и Z = 10:1) определяли с помощью оборудования «Zetasizer Nano ZS» (He-Ne-лазер, 5 мВ, 633 нм). Для интерпретации результатов использовали number particle size distribution.
Результаты и их обсуждение
В качестве надежного способа контроля процессов взаимодействия фермента с полимерами можно использовать слежение за размерами образующихся частиц с помощью динамического рассеяния света. Значение эффективного гидродинамического радиуса (Rh) частиц активного фермента LysK при рН 9,0 из-за его склонности к агрегации (ввиду близости значения выбранного рН к значению изоэлектрической точки pI) доста-
Т а б л и ц а 1
Влияние положительно заряженных блок-сополимеров на величины эффективного гидродинамического радиуса (нм) частиц фермента ЬузК
Полимер Z Z, мВ CNaC1, мМ Активность, %
10 300 500
- - -21±10 600±25 650±50 670±60 100*
ПЛЛ-ПЭГ 10:1 6±2 60±5 160±20 100±20 180
ПЭИ-ПЭГ 10:1 5±2 200±20 170±20 230±20 200
*100%-я активность - активность LysK без добавления блок-сополимеров.
Т а б л и ц а 2
Влияние блок-сополимеров на стабильность LysK при 22 °С
Полимер С (NaCl), мМ Z Порядок инактивации Константа инактивации
10 - 2,0 0,5 М-1 с-1
300 - 2,0 1,5 М-1 с-1
500 - 2,0 1,5 М-1 с-1
ПЭИ-ПЭГ 10 1:1 1,0 1,0х10-6 с-1
10:1 1,0 5,5х10-6 с-1
300 1:1 1,3 4,0х10-5 М~°,3с-1
10:1 1,2 1,5х10-5 М~°,2с-1
500 1:1 1,3 5,4х10-7 М~°,3с-1
10:1 0,5 5,4х10-7 М0,5с-1
ПЛЛ-ПЭГ 10 1:1 0,8 6,6х10-8 М0,2с-1
10:1 1,3 4,1х10-11 М~0,3с-1
300 1:1 1,3 6,8х10-11 М-0,3с-1
10:1 1,2 1,5х10-11 М-0,2с-1
500 1:1 1,2 2,0х10-11 М~0,2с-1
10:1 1,2 2,0х10-11 М~0,2с-1
ствия. Электростатическое отталкивание между одноименно заряженными молекулами полимеров, адсорбированных на поверхности белковых агрегатов, обусловливает их «растаскивание» и, как следствие, формирование более мелких частиц (комплексов Ьу8К-полимер). Эти частицы менее склонны к агрегации из-за сил электростатического отталкивания и пространственных затруднений, создаваемых адсорбированными на их поверхности молекулами блок-сополимеров.
Положительно заряженные фрагменты молекул блок-сополимеров ПЛЛ-ПЭГ или ПЭИ-ПЭГ находятся в непосредственном контакте с отрицательно заряженными молекулами Ьу8К, в то время как цепи ПЭГ обращены в сторону водной фазы. По этой причине частицы комплексов имеют близкое к нулю значение ^-потенциала, в то время как агрегаты молекул фермента отрицательно заряжены (рН > р1). Радиусы комплексов Ьу8К с блок-сополимерами практически не изменяются с увеличением концентрации соли, что свидетельствует о прочности электростатических взаимодействий (табл. 1).
Как показано в табл. 1, взаимодействие лизина с положительно заряженными блок-сополимерами приводит к небольшому увеличению активности Ьу8К (в 1,5-2 раза). Этому можно дать два объ-
точно велико и составляет величину порядка 600 нм (табл. 1) независимо от концентрации соли в растворе. Величины эффективных гидродинамических радиусов частиц блок-сополимеров при этих же условиях равны приблизительно 1-4 нм. Добавление 1- и 10-кратных избытков (по зарядам) ПЛЛ-ПЭГ или ПЭИ-ПЭГ к Ьу8К приводит к значительному уменьшению размеров частиц фермента до 100-200 нм (в табл. 1 приведены значения радиусов частиц при Z = 10:1). Это может быть вызвано тем, что молекулы положительно заряженных блок-сополимеров адсорбируются на отрицательно заряженных агрегатах фермента Ьу8К за счет сил электростатического взаимодей-
Е, мВ
Рис. 1. Взаимодействие ПЛЛ-ПЭГ с клетками S. aureus при 37 °C (pH 7,5)
яснения. Во-первых, клетки Staphylococcus aureus имеют отрицательный заряд, который формируют карбоксильные группы d-изоглутаминовой кислоты, терминальные остатки d-аланина пептидных субъединиц пептидогликана и тейхоевые кислоты. Клетоки Staphylococcus aureus имеют Z-потенциал с отрицательным значением; при добавлении к клеткам блок-сополимера ПЛЛ-ПЭГ наблюдается увеличение заряда клеток с последующей сменой знака заряда их поверхности (рис. 1), что может быть вызвано адсорбцией полимера на поверхности клеток. Во-вторых, положительный заряд комплексов фермент-полимер обеспечивает увеличение связывания LysK с отрицательно заряженными клетками S. aureus, что может быть причиной увеличения скорости лизиса.
Положительно заряженные блок-сополимеры оказывают влияние не только на активность, но и на стабильность фермента (при температуре хранения 4 и 22 °С). На активность фермента ПЭИ-ПЭГ и ПЛЛ-ПЭГ влияют практически одинаково, а стабилизирующие эффекты у них различаются. В табл. 2 приведены значения порядков и констант инактивации LysK при 22 °С в комплексах с ПЭИ-ПЭГ и ПЛЛ-ПЭГ в зависимости от концентрации хлорида натрия и зарядового соотношения полимер/фермент. Из табл. 2 видно, что при 22 °С происходит уменьшение значений порядка реакции инактивации фермента со второго до первого. Образование комплексов между молекулами положительно заряженного блок-сополимера и отрицательно заряженного фермента ведет к подавлению межмолекулярных взаимодействий типа фермент-фермент, LysK инактивируется внутри полимер-
ной капсулы в соответствии с мономолекулярным механизмом.
Для оценки стабилизационного эффекта полимера обычно проводят сравнение констант инактивации нативного фермента и биокатализатора в комплексе с полиионом, но для LysK сопоставление величин констант инактивации невозможно, так как они соответствуют разным порядкам. Для количественной оценки стабилизационного эффекта блок-сополимеров использовали значения времени полуинактивации фермента (т1/2) в комплексах с ними и индивидуального (рис. 2, а, б).
Как видно из рис. 2, а, время полуинактивации LysK в присутствии блок-сополимера ПЭИ-ПЭГ увеличивается и стабилизационный эффект начинает отчетливо проявляться уже при Z = 1:1 (значение т1/2 возрастает с 1-3 до 9-13 сут.) При Z = 10:1 время полуинактивации LysK на 2-3 сут. больше такового для соотношения 1:1, т.е. максимальный стабилизационный эффект достигается уже при Z = 1:1. С увеличением содержания хлорида натрия от 10 до 300-500 мМ стабилизирующее влияние блок-сополимера ПЭИ-ПЭГ усиливается. По данным рис. 2, а можно оценить величину стабилизационного эффекта разветвленного блок-сополимера: при концентрации NaCl, равной 10 мМ, время полуинактивации LysK возрастает в 3-4 раза, при концентрации NaCl, равной 300 и 500 мМ, время полуинактивации LysK возрастает в 10-12 и 13-16 раз соответственно. При низкой концентрации NaCl проявляется слабый эффект экранирования зарядов разветвленного полимера. Заряды находятся на максимальном расстоянии друг от друга, и жесткость полимерной цепи до-
Рис. 2. Влияние блок-сополимеров ПЭИ-ПЭГ (а) и ПЛЛ-ПЭГ (б) на стабильность ЬуБК при концентрации №С1, мМ: 1 - 10, 2 - 300, 3 - 500, (22 °С, концентрации фермента 0,4 мг/мл, рН 9,0)
Т а б л и ц а 3
Влияние блок-сополимеров на стабильность ЬузК при 4 °С
Полимер Z Порядок инактивации Константа инактивации
- 2,0 0,5 М-1 с-1
10 1:1 1,8 1,1х10-2 М-0,8с-1
10:1 1,6 5,1х10-4 М-0,6с-1
- 2,0 0,03 М-1 с-1
ПЭИ-ПЭГ 300 1:1 1,9 1,6х10-2 М-0,9с-1
10:1 1,8 4,5х10-3 с-1 М-0,8
- 2,0 0,06 М-1 с-1
500 1:1 1,0 1,0х10-7 с-1
10:1 1,0 1,0х10-7 с-1
ПЛЛ-ПЭГ 10-500 1:1-10:1 - 4 мес. 70-100% активности
статочно высока, что приводит к более слабому связыванию полимера и Ьу8К.
При взаимодействии фермента с линейным блок-сополимером ПЛЛ-ПЭГ, также как и с разветвленным, происходит резкое увеличение стабильности при зарядовом соотношении полимера и фермента 1:1, время полуинактивации Ьу8К возрастает с 1-3 до 15 сут. (рис. 2, б). Стабилизирующее влияние линейного блок-сополимера, как и разветвленного, усиливается с увеличением концентрации соли ^ = 1:1). Это можно объяснить возрастанием гибкости цепи (что облегчает связывание с ферментом) за счет экранирования положительных зарядов полимера при возрастании ионной силы. Увеличение с ростом концентрации №01 стабилизационного эффекта можно также объяснить наличием между блок-сополимерами и Ьу8К гидрофобных взаимодействий.
Процесс инактивации Ьу8К в комплексах с ПЭИ-ПЭГ при 4 °С сопровождается понижением порядка реакции до величин, близких или равных единице (табл. 3). Наблюдаемые при 4 и 22 °С закономерности стабилизации Ьу8К блок-сополимером ПЭИ-ПЭГ в целом схожи, за исключением того, что при 4 °С стабилизационный эффект отсутствует в случае низкой концентрации №01. Из рис. 3 видно, что при 4 °С и 500 мМ №С1 добавление к Ьу8К ПЭИ-ПЭГ приводит к росту значения времени полуинактивации фермента при зарядовом соотношении блок-сополимера и Ьу8К, равном 1:1, далее оно остается постоянным (как и при 22 °С). В присутствии 10 мМ №С1 время полуинактивации Ьу8К уменьшается по сравнению с
нативным ферментом, т.е. имеется незначительная дестабилизация Ьу8К.
Линейный блок-сополимер ПЛЛ-ПЭГ проявляет мощное стабилизирующее влияние на Ьу8К при 4 °С - фермент сохраняет 70-100% активности после 4 месяцев хранения при выбранных концентрациях хлорида натрия и зарядовых соотношениях полимер/фермент (табл. 3). Таким образом, можно заключить, что при использовании в качестве стабилизатора блок-сополимера ПЛЛ-ПЭГ можно добиться показателей инактивации фермента, оптимальных для его хранения.
Для понимания причин, вызывающих изменение кинетических свойств ферментов при взаимодействии с полимерами, был использован метод ИК-спектроскопии. ИК-Фурье-спектроскопия -хорошо известный метод для определения вторич-
10
Ъ (ПЭИ-ПЭГ/ЬувК)
Рис. 3. Влияние блок-сополимера ПЭИ-ПЭГ на стабильность ЬуБК при концентрации №С1, мМ: 1 - 10, 2 - 300, 3 - 500, (4 °С, концентрации фермента 0,4 мг/мл, рН 9,0)
T а б л и ц а 4
Влияние полимеров и концентрации NaCl на вторичную структуру LysK (22 °C, Z = 10:1)
Образец NaCl, мМ Альфа-спирали, % Бета-структуры, % Неупорядоченные структуры, %
LysK 10 15,6 34,2 50,2
500 19,3 35,5 45,2
ПЛЛ-ПЭГ/LysK 10 16,8 37,7 45,5
500 18,0 35,8 39,2
ПЭИ-ПЭГ/LysK 10 23,2 29,3 47,5
500 16,6 32,6 50,8
ной структуры белка. Элементы вторичной структуры белка и их содержание в общей вторичной структуре могут быть определены на основании анализа поглощения белка в области валентных колебаний карбонильной группы пептидной связи (полоса Амид I), если использовать способы улучшения разрешения и разложения спектров.
ИК-спектры фермента Ьу8К показаны на рис. 4. Хорошо видны полосы Амид I (17001600 см-1), Амид II (1480-1580 см-1), Амид III (1229-1301 см-1), характерные для белков. В области 1700-1600 см-1 спектра фермента Ьу8К полоса поглощения Амид I имеет максимум в районе 1640 см-1.
Количественное содержание элементов вторичной структуры фермента при разных кон-
Рис. 4. ИК-спектр фермента LysK при 22 °C, 10 мМ NaCl, рН 9,0
центрациях №С1 было определено по процедуре разложения пика Амид I. Количественный анализ полосы Амид I показал (табл. 4), что блок-сополимеры ПЛЛ-ПЭГ и ПЭИ-ПЭГ при Ъ = 10:1 и концентрациях хлорида натрия 10 и 500 мМ практически не оказывают влияния на вторичную структуру Гу8К. Изменения в содержании различных элементов вторичной структуры не превышают величины порядка 5%, из чего можно заключить, что фермент находится в комплексах в каталитически активной конформации, а это наряду с подавлением агрегации также может обеспечить стабилизационный эффект.
Заключение
1. Разветвленный ПЭИ-ПЭГ и линейный ПЛЛ-ПЭГ (положительно заряженные блок-сополимеры) образуют комплексы с LysK, включение в которые сопровождается увеличением в 1,5-2 раза эффективности лизиса и в 2-20 раз стабильности фермента (2 = 1:1, Z = 10:1).
2. Стабилизирующие эффекты блок-сополимеров зависят от температуры, концентрации №С1, зарядового соотношения полимера и фермента. Линейный блок-сополимер ПЛЛ-ПЭГ более эффективен по сравнению с разветвленным блок-сополимером ПЭИ-ПЭГ и является высокоэффективным стабилизатором для LysK при 4 °С.
3. Стабилизационный эффект блок-сополимеров ПЭИ-ПЭГ и ПЛЛ-ПЭГ по отношению к ферменту LysK можно объяснить закреплением его каталитически активной конформации при включении в полимерную оболочку.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Rodriguez-Rubio L., Martinez B., Donovan D.M., Rodri- 2. Schmelcher M., Donovan D.M., Loessner M. // Future
guez A., Garcia P. // Critical Reviews in Microbiology. Microbiology. 2012. Vol. 7. P. 1147. 2013. Vol. 39. P. 427.
3. Becker S.C., Foster-Frey J., Donovan DM. // FEMS Microbiol. Lett. 2008. Vol. 287. P. 185.
4. FilatovaL.Yu., BeckerS.C., DonovanD.M., GladilinA.K., Klyachko N.L. // Biochimie. 2010. Vol. 92. P. 507.
5. Filatova L.Yu., Bekker C.C., Donovan D.M., Gladilyn A.K., Klyachko N.L. // Moscow University Chemistry Bulletin. 2009. Vol. 64. P. 382.
6. Filatova L.Y., Donovan D.M., Becker S.C., Lebedev D.N., PriymaA.D., KoudriachovaH.V., KabanovA.V., Klyachko N.L. // Biochimie. 2013. Vol. 95. P. 1689.
7. Filatova L.Y., Donovan D.M., Foster-Frey J., Pugachev V.G., Dmitrieva N.F., Chubar T.A., Klyachko N.L., Kabanov A.V // Enzyme and Microbial Technology. 2015. Vol. 73-74C. P. 51.
8. Filatova L.Y., Donovan D.M., Ishnazarova N.T., Foster-Frey J.A., Becker S.C., Pugachev V.G., Balabushevich N.G., Dmitrieva N.F., Klyachko N.L. // Applied Biochemistry and Biotechnology. Part A. Enzyme Engineering and Biotechnology. 2016. Vol. 180. P. 544.
Поступила в редакцию 09.01.18
INFLUENCE OF BLOCK-COPOLYMERS OF DIFFERENT NATURE ON STAPHYLOLYTIC LYSK ENZYME SECONDARY STRUCTURE AND STABILITY
Filatova L.Y.1*, Donovan D.M.2, Novozhilov I.A.1, Chubar T.A.1, Balabushevich N.G.1, Pugachev V.G.3, Klyachko N.L.1
(1 Department of Chemical Enzymology, Faculty of Chemistry, M.V. Lomonosov Moscow State University; Animal Biosciences and Biotechnology Laboratory, Beltsville Agricultural Research Center, NEA, ARS, USDA, Beltsville, MD, USA; 3Federal Scientific Center of Virology & Bioengineering "Vector", Novosibirsk, Russia;*e-mail: luboff.filatova@gmail.com)
The branched block-copolymer of polyethyleneimine and polyethylene glycol PEI-PEG and the linear block copolymer of polylysine and polyethylene glycol PLL-PEG forms complexes with the staphylolytic LysK enzyme. Complexing between LysK and cationic block-copolymers causes 1.5-2 times increase of the enzyme lytic activity. Block-copolymers stabilize LysK at the temperatures of storage (4 and 22 °C), and the half-inactivation time increases by 2-20 times. Stabilizing effects of block copolymers depend on temperature, NaCl concentration, polymer/enzyme ratio. Linear PLL-PEG provides an increase in LysK stability suitable for biomedical materials (LysK retains 100% activity after 4 months at 4 °C).
Key words: Staphylococcus aureus, lytic enzymes of bacteriophages, polymer, structure, stability.
Сведения об авторах: Филатова Любовь Юрьевна - науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, канд. хим. (luboff.filatova@gmail.com); Донован Давид - сотр. Института природных ресурсов (Сельскохозяйственный центр Бельствилля, США); Новожилов Игорь Александрович - студент химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова; Чубарь Татьяна Анатольевна - ассистент кафедры химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук (tchubar@gmail.com); Балабушевич Надежда Георгиевна - ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук (nbalab2008@gmail.com); Пугачев Владимир Георгиевич - зав. сектором отдела биофизики и экологических исследований ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (pugachev@vector. nsc.ru); Наталья Львовна Клячко - профессор кафедры химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, докт. хим. наук (nlklyacko@gmail.com).
