CC BY
35
DOI: 10.23868/202110010
ВЛИЯНИЕ БЕСКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА ПУПОВИНЫ ЧЕЛОВЕКА НА ДИНАМИКУ РОСТА И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ EX VIVO
Л.И. Калюжная1*, М.О. Соколова1, В.Е. Чернов1, Д.А. Земляной2, Шстутт-. 18.05.2021
С.В. Чеботарев1, Н.И. Чалисова^ 3, А.А. Кондратенко\ п Принята к печа™: 04102021
f ' _ X с Опубликована on-line: 08.10.2021
Ю.С. Гречаная4, 6, Н.В. Едоменко5, 6, Э.И. Александер-Синклер6
1 Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет, Санкт-Петербург, Россия
3 Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург, Россия
4 Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия
5 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
6 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
THE EFFECT OF THE CELL-FREE MATRIX OF THE HUMAN UMBILICAL CORD ON THE GROWTH DYNAMICS AND VIABILITY OF CULTURED HUMAN AND ANIMAL CELLS EX VIVO
L.I. Kalyuzhnaya1*, M.O. Sokolova1, V.E. Chernov1, D.A. Zemlyanoy2, S.V. Chebotarev1, N.I. Chalisova1, 3, A.A. Kondratenko1, Yu.S. Grechanaya4, 6, N.V. Edomenko5, 6, E.I. Alexander-Sinclair6
1 S.M. Kirov Military Medical Academy, Saint-Petersburg, Russia
2 St. Petersurg State Pediatric Medical University, Saint-Petersburg, Russia 31.P. Pavlov Institution of Physiology of the RAS, Saint-Petersburg, Russia
4 Peter the Great StPetersburg Polytechnic University, Saint-Petersburg, Russia
5 Saint Petersburg State University, Saint-Petersburg, Russia
6 Institute of Cytology of the RAS, Saint-Petersburg, Russia
e-mail: terrestra@mail.ru
Благодаря своему внеэмбриональному происхождению, пуповина сохраняет регенеративные молекулы фетального фенотипа. Бесклеточный матрикс пуповины человека как основа различных тканеинженерных конструкций для регенеративной медицины может способствовать репопуляции трансплантируемых матриксов пациент-специфическими клетками.
Цель работы: изучение в условиях ex vivo цитотоксичности тканеинженерного лиофилизированного бесклеточного матрик-са, изготовленного детергентным методом из Вартонова студня пуповины человека, на культуре фибробластов кожи человека, исследование влияния матрикса на жизнеспособность и динамику роста клеток разных органов различных лабораторных животных, а также способности клеток адгезировать к матриксу. С помощью МТТ-теста было выявлено, что тканеинженерный бесклеточный лиофилизированный матрикс пуповины человека не токсичен для дермальных фибробластов человека. При использовании метода органных культур были обнаружены различия по влиянию тканеинженерного матрикса на миграцию клеток из эксплантов тканей разных органов различных лабораторных животных, динамику их роста и жизнеспособность, что может быть связано с видовой специфичностью, которую необходимо учитывать при выборе тест-систем. Был установлен наиболее выраженный положительный эффект матрикса на динамику роста и жизнеспособность клеток эксплантов суставного хряща. Выявлена адгезия к матриксу клеток коры головного мозга вьетнамской вислобрюхой свиньи и селезенки морской свинки. Бесклеточный матрикс пуповины человека может быть использован при создании тканеинженерной конструкции для лечения глубоких повреждений кожи и суставного хряща.
Ключевые слова: культивирование клеток, децеллюляри-зация, Вартонов студень пуповины человека, ацеллюлярный ма-трикс, тканевая инженерия.
Due to its extraembryonic origin, the umbilical cord retains regenerative molecules of the fetal phenotype The cell-free matrix of the human umbilical cord as the basis of various tissue-engineering structures (TES) for regenerative medicine can contribute to the repopulation of transplanted matrices by patient-specific cells. The aim of the work was to study in vitro the cytotoxic properties of a tissue-engineered lyophilized cell-free matrix made by the detergent method from the human umbilical cord Warton jelly with respect to human skin fibroblasts, as well as the effect of this matrix on the viability and growth of cells of the cerebral cortex, liver, spleen, articular cartilage, heart and skin of various laboratory animals during organotypic cultivation. Using the MTT test, it was revealed that the tissue-engineered acellular lyophilized matrix of the human umbilical cord does not show a toxic effect on human dermal fibroblast. When using the method of organ cultures, differences were revealed in the influence of the tissue-engineered matrix on the migration of cells from explants of tissues of different organs of various laboratory animals, their growth dynamics and viability, which may be due to species specificity, which must be taken into account when choosing test systems. The most noticeable positive effect of the matrix on the growth dynamics and viability of articular cartilage explant cells was found. Adhesion to the matrix of cells of the cerebral cortex of the Vietnamese lop-bellied pig as well as cells of the spleen of a guinea pig was revealed. The cell-free human umbilical cord matrix can be used in the creation of acellular matrices for the treatment of deep dermal and articular cartilage damages.
Keywords: cell culture, decellularization, human umbilical cord Warton jelly, acellular matrix, tissue engineering.
Введение
Из-за дефицита органов и тканей для трансплантологии появился и активно развивается в настоящее время альтернативный подход для восстановления повреждённых органов и тканей — тканевая инженерия, направленная на создание вне организма человека
тканеинженерных конструкций (ТИК), трансплантация которых будет создавать в зоне дефекта условия для стимуляции регенерации поврежденных тканей и способствовать не только устранению дефектов поврежденных тканей, но и восстановлению их биологических функций. Одной из ключевых стратегий при создании
ТИК является поиск высоко функциональных биосовместимых материалов, которые будут придавать ТИК структурные свойства живых тканей, выступая в роли матрикса для клеток, обеспечивающего поддержание их пролиферации и дифференцировки в процессе реконструкции поврежденной ткани.
В качестве подходящего источника для изготовления трансплантатов на основе тканеинженерных матриксов нами была выбрана пуповина человека, благодаря ее гомологичному происхождению и сохранности в ней регенеративных компонентов. Кроме того, пуповина — это внеэмбриональный орган, который утрачивает свою значимость для плода сразу после рождения и поэтому доступна в неограниченном количестве.
Пристальный интерес к пуповине человека как биоматериалу для тканевой инженерии появился после публикации данных об отсутствии воспалительной реакции при повреждении кожных покровов и мягких тканей плода, а также об их способности полностью восстанавливаться без рубцевания или с формированием нежного эластичного рубца [1, 2]. Известны особенности архитектоники и состава внеклеточного матрикса тканей фетального фенотипа: количество факторов роста TGF-ß3, ассоциированных с безрубцовым заживлением ран, намного превосходит количество профибротиче-ских факторов роста TGF-ß1 и TGF-ß2, свойственных постнатальным тканям [3]; во внеклеточном матриксе присутствует фактор роста эндотелия сосудов VEGF, обеспечивающий на этапах гестации интенсивный рост сосудов пуповины; коллаген III типа со слабой связью между волокнами доминирует над коллагеном I типа, а гиалуроновая кислота с высоким молекулярным весом — над низкомолекулярной. В фибробластах плода синтезируется в 2-4 раза больше рецепторов к гиа-луроновой кислоте высокого молекулярного веса, чем в постнатальных фибробластах, что, вероятно, ускоряет их миграцию в очаг повреждения. Продукция специфических поверхностных рецепторов фибробластов семейства тирозинкиназы (discoid domain receptors, DDR-1), регулирующих пролиферацию, дифференцировку и синтез коллагена III типа, способствует заживлению фетальных ран с образованием нежной соединительной ткани [1]. Пуповина относится к внеэмбриональным тканям с фетальным фенотипом, следовательно, во внеклеточном матриксе ее соединительной ткани должны сохраняться регенеративные молекулы.
Постнатальные ткани подвергаются воздействию многих факторов (стрессов, перенесенных заболеваний, возрастных перестроек), что отражается на структуре и композиции внеклеточного матрикса, поэтому биоматериал аллогенных и кадаверных тканей не оптимален для тканевой биоинженерии. Внеэмбриональные структуры не подвергаются постнатальным изменениям, следовательно, есть основания полагать, что регенеративные компоненты в составе матрикса пуповины будут способствовать его заселению клетками реципиента, созданию благоприятных условий для их функционирования по ремоделированию матрикса и, в конечном итоге, регенерации тканей.
В наших предыдущих экспериментах in vivo было показано положительное влияние бесклеточного матрикса, изготовленного детергентным методом из Вартонова студня пуповины человека, на регенерацию поврежденного гиалинового суставного хряща кролика [4, 5]. Для выяснения механизмов, лежащих в основе этого эффекта, а также возможности использования тканеинженерного бесклеточного матрикса пуповины человека при создании ТИК для репарации не только
хряща, но и других тканей, необходимы дополнительные исследования ex vivo.
Цель исследования: изучение цитотоксических свойств тканеинженерного лиофилизированного бесклеточного матрикса пуповины человека на культуре фибробластов кожи человека, исследование влияния матрикса на жизнеспособность и динамику роста клеток при органотипи-ческом культивировании эксплантов суставного хряща, селезенки, коры полушарий головного мозга, кожи и при культивировании диссоциированных клеток, выделенных ферментативным способом из печени и сердца различных лабораторных животных (кролик, морская свинка, вьетнамская вислобрюхая свинья, крыса], а также оценка способности клеток адгезировать к матриксу.
Материал и методы
Изготовление бесклеточного матрикса пуповины
Пуповины человека были получены от здоровых доношенных новорожденных после самопроизвольных родов и подписания информированного согласия донорами-роженицами, с использованием руководящих принципов, утвержденных Этическим Комитетом при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (протокол № 230 от 17.12.2019, Санкт-Петербург, Россия]. В стерильных условиях осторожно удаляли сосуды пуповины, ткань измельчали и гомогенизировали в гомогенизаторе фирмы Gentle MACSTM Dissociator Milteniy Biotech (Германия]. Клетки удаляли с помощью 0,05% раствора додецилсульфата натрия (SDS, Биолот, Россия]: инкубация в течение 24 ч. при комнатной температуре на шейкере со скоростью вращения 140 об/мин. (Biosan, Латвия] с последующей отмывкой SDS фосфатно-соле-вым буфером (Биолот, Россия]. Продукт лиофилизиро-вали в течение 48 ч. в лиофильной сушке (Zirbus VaCo5II, Германия]. Бесклеточный матрикс хранили герметично упакованным при температуре -200С, перед внесением в культуральный флакон стерилизовали облучением в ультрафиолетовом свете в боксе II класса микробиологической безопасности (Lamsystems, Россия] мощностью потока UV-C излучения 12 Вт в течение 15 мин.
Эффективность децеллюляризации оценивали с помощью сравнительного анализа качественных и количественных показателей содержания ядерного материала в образцах матрикса и нативной пуповины.
ДНК экстрагировали с использованием реактивов коммерческого набора Сорб-ГМО-Б (Синтол, Россия] в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Количественный анализ ДНК и ее фрагментов выполняли на спектрофотометре (NanoPhotometer™ NP80 Touch IMPLEN GMBH, Германия]: 20 последовательных измерений для каждого образца. Качественный анализ на наличие цельной ДНК и ее крупных фрагментов проводили методом электрофореза в агарозном геле в течение 90 мин. Результат фиксировали и анализировали в ультрафиолетовом свете с помощью гель-документирующей системы ChemiDoc MP (BioRad, США].
В соответствии с общепринятыми методами, отсутствие ядер клеток в децеллюляризованных тканях определяли окрашиванием препаратов гематоксилином и эозином и ядерным флуоресцентным красителем 4,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 1:1000, Invitrogen, Paisley, Великобритания] с концентрацией DAPI в рабочем растворе 0,01 мг/мл. Препараты анализировали в видимом проходящем свете на флюоресцентном микроскопе AxioImager 2M (объективы EC Plan Neofluar, камера цветная Axiocam MRC5, Carl Zeiss, Германия].
Таблица 1. Источник клеток и методы культивирования
Источник клеток Метод культивирования
Хрящ коленного сустава морская свинка Эксплант
вьетнамская свинья Эксплант
кролик Эксплант
Селезенка морская свинка Эксплант
вьетнамская свинья Эксплант
крыса Эксплант
Кора головного мозга морская свинка Эксплант
вьетнамская свинья Эксплант
крыса Эксплант
Кожа морская свинка Эксплант
вьетнамская свинья Эксплант
крыса Эксплант
Печень морская свинка Первичная культура клеток
вьетнамская свинья Первичная культура клеток
Сердце морская свинка Первичная культура клеток
вьетнамская свинья Первичная культура клеток
Оценка цитотоксичности бесклеточного матрикса пуповины человека на культуре клеток
Цитотоксичность лиофилизированного бесклеточного матрикса изучали на культуре дермальных фибробластов (ДФ) человека, выделенных из кожи лица взрослых доноров после косметологических операций (все доноры подписывали информированное согласие) в Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки культивировали в С02-инкубаторе при 37 °С в атмосфере 5% С02 в питательной среде йМЕМ/П2 №со, США), содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (НуС1опе, США) и 1% пенициллина-стрептомицина (Э1Ьсо, США).
Влияние образцов бесклеточного лиофилизирован-ного матрикса пуповины человека на жизнеспособность ДФ оценивали с использованием кондиционированных питательных сред, полученных прединкубацией исследуемого матрикса в питательной среде. Для получения сред, кондиционированных матриксом, была выбрана концентрация лиофилизированного бесклеточного матрикса пуповины человека 1мг на 1 мл питательной среды: 10 мг стерильного матрикса помещали в контейнеры с крышкой, в каждый контейнер добавляли 10 мл полной питательной среды 0МЕМ/И2 и инкубировали в течение 1 сут. при 4 °С в холодильной камере.
Жизнеспособность клеток оценивали с использованием МТТ-теста: митохондриальные ферменты жизнеспособных клеток изменяют исходный цвет реактива на пурпурный за счет образования формазана, оптическая плотность которого линейно зависит от количества живых клеток. Изменение оптической плотности опытных проб относительно контрольных свидетельствует о влиянии исследуемого агента на культивируемые клетки.
Для Мтт-анализа ДФ человека высевали в лунки 96-луночных планшетов в концентрации 7х103 клеток на лунку в 200 мкл питательной среды. После адгезии клеток стандартную питательную среду заменяли на кондиционированную в 2 вариантах для каждого образца: в первом варианте кондиционированная
среда составляла 50% от объема питательной среды; во втором варианте — 100%. Контролем служили ДФ, культивируемые в стандартных условиях.
Клетки в кондиционированных и параллельно в стандартных средах культивировали в течение 72 ч., среды заменяли на среду с добавлением 200 мкл на лунку реагента МТТ в концентрации 0,5 мг/мл, инкубировали в течение 4 ч. в атмосфере 5% СО2, среду с МТТ удаляли, в каждую лунку добавляли 100 мкл диметилсульфоксида, инкубировали в течение 20 мин. при постоянном перемешивании и измеряли оптическую плотность экстрагированного формазана в диметилсульфоксиде на анализаторе Fluorofot «Charity» (Россия) при длине волны 570 нм и референсной длине волны 630 нм. Оптическую плотность в контрольных лунках со стандартной средой принимали за 100% жизнеспособность клеток.
Оценка влияния бесклеточного матрикса
пуповины человека на динамику роста
и жизнеспособность культивируемых клеток
В эксперименте в условиях ex vivo изучали влияние лио-филизированного бесклеточного матрикса на жизнеспособность и динамику роста клеток при органотипическом культивировании эксплантов суставного хряща, селезенки, коры полушарий головного мозга, кожи, и при культивировании диссоциированных клеток, выделенных ферментативным способом из печени и сердца различных лабораторных животных (кролик, морская свинка, вьетнамская вислобрюхая свинья, крыса). Биоптаты органов получали с использованием руководящих принципов, утвержденных Этическим Комитетом при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (протокол № 203 от 20.03.2018, Санкт-Петербург, Россия). Кролика и вьетнамскую вислобрюхую свинью выводили из эксперимента инъекцией 1% раствора пропофола, морскую свинку и крысу — эфиром. Клетки органов выделяли методом органотипического культивирования эксплантов и ферментативной диссоциации тканей (клеточная культура) (табл. 1).
Для ферментативного выделения клеток печени использовали смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена (ЭДТА) в соотношении 1:10. Для ферментативного выделения клеток сердца применяли раствор коллагеназы из гепатопанкреаса краба для культур клеток (Биолот, Россия) в концентрации 0,0075 г/10 мл. Клетки печени и сердца после ферментативной диссоциации тканей высаживали с плотностью 3х103 кл/см2 во флаконы площадью 25 см2 и в экспериментальные флаконы вносили по 5 мг стерильного лиофилизата матрикса. Все клетки культивировали в С02-инкубаторе при 37 °С, в атмосфере 5% С02 в питательной среде DMEM (Биолот, Россия), содержащей 1 0% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (HyClone, США) и 1% пенициллина-стрептомицина (Gibco, США), в течение 21 сут.
Для получения эксплантов органов использовали набор инструментов для микрохирургии глаза; органы извлекали в стерильных условиях и разделяли на фрагменты величиной около 1 мм3. По 8-10 эксплантов органов крысы помещали в чашки Петри, дно которых предварительно было покрыто полилизином, на расстоянии 3 мм друг от друга, инкубировали в термостате при температуре 37 °С в течение 30 мин. для прикрепления эксплантов к подложке; в контрольные чашки Петри с прикрепленными эксплантами заливали 3 мл питательной среды, в экспериментальные — вносили по 3 мг лио-филизата матрикса и заливали 3 мл питательной среды, культивировали в течение 3 сут. и оценивали динамику роста площади эксплантов в контроле и в присутствии матрикса с помощью фазово-контрастной микроскопии (микроскоп CKX53 Olympus, Япония) морфометри-ческим методом с использованием пакета программ PhotoM1.2. С целью унификации конечных показателей применяли относительный критерий — индекс площади (ИП): отношение площади всего экспланта, включая периферическую зону роста, к площади центральной зоны. Контрольное значение ИП принимали за 1 00%, все остальные значения ИП выражали в процентах к контролю. о величине и направленности действия бесклеточного матрикса пуповины судили по значению АИП: АИП=ИП опыт-ИП контроль (%).
Экспланты органов кролика, вьетнамской свиньи и морской свинки культивировали аналогично эксплан-там органов крысы во флаконах площадью 25 см2 в С02-инкубаторе в питательной среде следующего состава: 35% раствора Хенкса, 35% среды Игла (Биолот, Россия), 20% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (HyClone, США), 0,6% глюкозы, 0,5 ЕД/мл инсулина, 100 ЕД/мл гентамицина (Биолот, Россия), рН 7,2.
Клетки, выделенные с помощью ферментов, и экс-планты органов культивировали в 2 вариантах: в присутствии матрикса (концентрация матрикса 1 мг/мл, группа «Матрикс») и в отсутствие матрикса (группа «Контроль»).
Клетки первичных культур с поверхности культу-рального пластика снимали смесью 0,25% раствора трипсина (Биолот, Россия) и 0,02% раствора Версена (ЭДТА, Биолот, Россия) в соотношении 1:3, окрашивали 0,4% раствором трипанового синего для выявления нежизнеспособных клеток и считали в камере Горяева. Жизнеспособность клеток рассчитывали как отношение неокрашенных клеток к окрашенным и выражали в процентах.
Динамику роста клеток первичных культур, полученных ферментативной диссоциацией или методом органотипического культивирования эксплантов органов кролика, морской свинки и вьетнамской свиньи оценивали визуально на разных сроках наблюдения, а через 21 сут.
культивирования — количественно по отношению разницы между количеством клеток в группе «Матрикс» и группе «Контроль» к количеству клеток в группе «Контроль».
Адгезию клеток к волокнам матрикса оценивали после органотипического культивирования в течение 21 сут. на микроскопе Axio Primovert (Carl Zeiss, Германия).
Статистический анализ
Статистическую обработку полученных результатов осуществляли в программе StatSoft Statistica 6.1. В случае распределения признака, отличного от нормального, результаты представлены в виде медианы, 25 и 75 пер-центилей: Ме (Р25; Р75). Сравнение относительных частот внутри двух групп проводили с помощью проверки гипотезы о равенстве относительных частот в двух популяциях, сравнение абсолютных величин — с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. За уровень значимости «p» принимали значение <0,05. Определение 95% доверительных интервалов относительных величин (95%CI) производили методом Клоппер-Пирсона.
Результаты и обсуждение
Эффективность децеллюляризации
Вартонова студня пуповины человека
В настоящее время не существует единых стандартизированных критериев оценки качества децеллюляризации. Широко применяемым подходом к определению эффективности удаления антигенного материала является гистологическое исследование матрикса на наличие остаточных ядер. Более качественные методы оценки ацеллюлярности матрикса должны включать количественный анализ содержания ДНК и определение длины остаточных фрагментов ДНК. Общими критериями минимального приемлемого уровня ацеллюлярности могут считаться концентрация двухцепочечной ДНК в сухой массе внеклеточного матрикса <50 нг/мг; длина остаточных фрагментов ДНК менее 200 пар оснований [6]; отсутствие видимого ядерного материала в срезах тканей, окрашенных DAPI или гематоксилином и эозином.
Гистологическое исследование показало, что после децеллюляризации ядра в биоматериале отсутствовали (рис. 1).
Среднее содержание ДНК в нативной пуповине составило 486,750 нг/мкл, в бесклеточном продукте после децеллюляризации SDS — 8,975 нг/мкл. Снижение концентрации нуклеиновых кислот оказалось статистически значимым, p <0,001. Качественный анализ ДНК методом электрофореза в агарозном геле продемонстрировал отсутствие цельных молекул и крупных фрагментов ДНК в бесклеточном продукте пуповины [4].
Таким образом, с помощью использованного в нашей работе метода децеллюляризации удалось практически полностью удалить клетки и ядерный материал из биоматериала пуповины и обеспечить неиммунногенность продукта.
Цитотоксичность бесклеточного
матрикса пуповины человека
Важным требованием, предъявляемым к имплан-тационным материалам, является их биологическая совместимость: отсутствие токсичности, мутагенности и канцерогенности. Цитотоксичность материала оценивают в опытах in vitro по его влиянию, в частности, на жизнеспособность клеток.
При культивировании ДФ в кондиционированных матриксом средах жизнеспособность клеток статистически значимо не отличалась от контроля. Статистически достоверная разница была обнаружена при сравнении жизнеспособности фибробластов после культивирования в 100% и 50% кондиционированных средах (рис. 2).
- □ Контроль
I Кондиционированная в присутствии матрикса среда составляла 100% от объема
I Кондиционированная в присутствии матрикса среда составляла 50% от объема
Рис. 2. Жизнеспособность дермальных фибробластов человека при культивировании в кондиционированных средах (М±о), Мтт-тест. *-различия статистически значимы, р<0,05
Таким образом, с помощью МТТ-теста было обнаружено, что тканеинженерный бесклеточный лиофили-зированный матрикс пуповины человека не токсичен для ДФ человека и степень биосовместимости носит дозозависимый характер.
Влияние бесклеточного матрикса пуповины на динамику роста и жизнеспособность клеток разных органов различных животных
В процессе прижизненного наблюдения за культивируемыми клетками и эксплантами тканей было выявлено, что присутствие в культуральной среде бесклеточного матрикса пуповины влияет на динамику роста и жизнеспособность клеток разных органов различных видов животных (табл. 2).
Влияние матрикса на динамику роста клеток хрящевой ткани было наиболее выражено у кролика, клеток кожи и коры головного мозга — у вьетнамской свиньи, клеток печени и сердца — у морской свинки. Количество жизнеспособных хрящевых клеток, культивированных в присутствии матрикса, было выше, чем в контроле, у всех видов животных. Кроме того, матрикс
способствовал увеличению количества жизнеспособных клеток коры головного мозга и селезенки вьетнамской свиньи; коры головного мозга, печени и селезенки морской свинки.
В ходе исследований с помощью визуальной оценки были выявлены различия в скорости роста популяций клеток различных органов одного и того же лабораторного животного: в процессе культивирования клеток вьетнамской вислобрюхой свиньи скорость роста клеток хряща в группе «Матрикс» отставала от скорости роста клеток в группе «Контроль» на 8 сут., клеток селезенки на 15 сут., кожи на 11 сут. и опережала скорость роста клеток коры полушарий на 11 сут. и клеток печени на 6 сут. в группе «Контроль». К 21 сут. культивирования скорость роста в группах «Матрикс» и «Контроль» во всех популяциях клеток сравнялась. В популяции клеток сердца динамика роста была одинакова на всем протяжении эксперимента.
Изучение влияния бесклеточного продукта из пуповины человека на рост и жизнеспособность клеток разных органов различных животных мы проводили как в диссоциированной, так и в органотипической культурах, которая позволяет исследовать влияние матрикса на ткань органа в целом.
В отдельной серии экспериментов было обнаружено значимое увеличение площади эксплантов селезенки (АИП 15%), коры головного мозга (ЛИП 44%) и кожи (ЛИП 25%) крысы при их культивировании в присутствии матрикса (рис. 3).
Рост популяций клеток может быть связан с влиянием матрикса пуповины человека как на миграцию клеток из эксплантов, так и на их пролиферацию. Для выяснения механизмов роста популяций необходимо проведение серии дополнительных исследований.
Использование разных технологий культивирования позволило выявить общую тенденцию влияния матрикса из пуповины на увеличение количества жизнеспособных клеток различных животных.
Ранее в эксперименте in vivo нам удалось показать, что применение инъекционного продукта из бесклеточного матрикса пуповины в терапии повреждения гиалинового суставного хряща кролика привело к восстановлению дефекта [5]. Мы предположили, что заселение клетками зоны дефекта хряща может быть связано со стимулирующим влиянием матрикса на направленную миграцию и(или) усиление пролиферации. Исследование ex vivo с использованием методов культивирования эксплантов и клеточных культур позволило проверить нашу гипотезу о способности
Таблица 2. Динамика роста и жизнеспособность клеток разных видов животных: культивирование в присутствии матрикса пуповины человека в течение 21 сут.
Количество клеток на 21 сут. Жизнеспособ культивирования, Me Р25; P75) х106 ность клеток, % (95%^) Источник клеток -
Контроль, клеток/мл Матрикс, клеток/мл % Контроль Матрикс
Хрящ вьетнамской 2,64 2,93 +10,00 45,00 88,204
коленного свиньи (2,14; 3,04) (2,34; 3,89) (38,95-50,74) (85,03-90,66)
сустава кролика 3,12 4,62 +48,001 88,00 92,005
(2,78; 3,35) (3,28; 5,74) (84,03-91,51) (89,13-94,30)
морской 2,99 2,72 -10,00 46,00 64,604
свинки (2,51; 3,36) (2,10; 2,78) (40,40-51,99) (58,71-70,38)
Селезенка вьетнамской 4,59 4,27 -6,97 84,00 92,904
свиньи (4,08; 5,18) (3,83; 4,78) (81,48-86,22) (90,97-94,46)
морской 4,91 4,34 -11,60 90,60 100,004
свинки (4,80; 5,16) (3,57; 5,39) (87,70-93,06) (99,15-100,00)
Печень вьетнамской 3,43 3,21 -6,41 81,30 73,405
свиньи (2,78; 3,52) (2,79; 3,47) (77,59-84,54) (69,14-77,24)
морской 2,16 3,66 +69,442 73,50 90,004
свинки (1,93; 2,23) (2,51; 4,73) (67,20-79,36) (86,34-92,78)
Кора вьетнамской 5,57 9,15 +64,272 87,00 95,004
головного свиньи (5,02; 6,42) (8,10; 0,06) (84,90-88,87) (93,92-95,94)
мозга морской 4,76 3,99 -16,18 53,00 100,004
свинки (3,05; 5,20) (3,30; 4,50) (48,35-57,50) (99,15-100,00)
Кожа вьетнамской 1,99 2,58 +30,003 52,00 37,506
свиньи (1,59; 2,05) (2,08; 2,58) (44,81-59,21) (31,55-43,74)
морской 2,68 2,86 +6,70 71,00 62,505
свинки (2,15; 3,62) (2,26; 3,20) (65,06-76,26) (56,70-68,21)
Сердце вьетнамской 2,40 2,72 +13,33 60,00 59,00
свиньи (2,25; 2,54) (1,71; 3,72) (55,46-64,41) (54,74-63,17)
морской 1,93 2,46 +27,46 50,00 69,004
свинки (1,92; 2,06) (1,98; 3,13) (42,99-57,52) (62,50-74,44)
Примечание: выявлены статистически значимые различия при сравнении изменения количества клеток в группе «Контроль» и в группе «Матрикс»: 1 — р=0,0035; 2 — р <0,001; 3 — р=0,03 и при сравнении жизнеспособности клеток в группе «Контроль» и в группе «Матрикс»: 4 — р <0,001; 5 — р=0,003; 6 — р=0,002
бесклеточного матрикса из пуповины стимулировать направленную миграцию хондроцитов кролика, их жизнеспособность и динамику роста. В эксперименте с хон-дроцитами кролика, а также вьетнамской вислобрюхой свиньи было обнаружено увеличение количества клеток в присутствии матрикса пуповины человека, жизнеспособность которых была выше, чем в контроле. По-видимому, механизм регенеративного восстановления повреждения гиалинового хряща под влиянием инъекционного продукта из бесклеточного матрикса пуповины обеспечивают клетки реципиента, рекрутируемые регенераторными компонентами матрикса [5].
Влияние матрикса на пролиферацию клеток может быть предположительно связано с сохранностью на его компонентах факторов роста, молекул клеточной адгезии, свойственных фетальным тканям и провизорным органам [3]. Повышенный уровень Т6Р-Р3 и более высокое соотношение Т8Р-р3/ТбР-р1 в тканях с фетальным фенотипом, к которым относится пуповина, могут иметь решающее значение для ускорения заживления; воздействие Т6Р-Р3 на взрослые фибробласты усиливает их миграцию и синтез ими структурных компонентов, обеспечивающих эластичное рубцевание [7].
В экспериментальном исследовании Ксю с соавт. (2017) стволовые клетки нервной системы, выросшие в виде кластеров с нечеткими границами на фидере из продукта пуповины, через 7 дней синтезировали ранний нейрональный маркер 1\1Р70, а спустя 14 дней — пролиферировали и дифференцировались в нейрональ-ные клетки, положительные на нейрональный маркер МАР2 [8]. Очевидно, дифференцировочные возможности клеток определяются сохранностью в матриксе или фидере факторов регенерации. Показано, что даже изолированные компоненты тканей, например, гиалуроновая кислота в виде гидрогеля, активированная плазмидной ДНК с геном фактора роста эндотелия сосудов, способна индуцировать репарацию объемного повреждения мышц и ангиогенеза [9].
Адгезия клеток к матриксу
На 21 сут. органотипического культивирования эксплантов было выявлено прикрепление к матриксу пуповины клеток коры головного мозга вьетнамской вислобрюхой свиньи и селезенки морской свинки (рис. 4), что позволяет предположить способность матрикса
Рис. 3. Экспланты органов крысы: 1 — селезенка, 2 — кора головного мозга, 3 — кожа. Органотипическое культивирование: А — контроль, В — в присутствии матрикса. Ув. х70
пуповины рекрутировать клетки реципиента, обеспечивать их фиксацию к волокнам матрикса, стимулировать их пролиферацию и дифференцировку. Совокупность этих свойств в дальнейшем сможет обеспечить временное функционирование матрикса в месте трансплантации. Адгезии других типов клеток, используемых в настоящем исследовании, к этому сроку обнаружено не было. Это
может быть связано с видовыми и гистологическими различиями тканей. Необходимо дополнительно изучать свойства бесклеточного матрикса, изготовленного детергентным методом из Вартонова студня пуповины человека, на клетках тканей различного происхождения.
Ограничением нашего исследования является непродолжительный срок наблюдения, не позволивший
Рис. 4. Адгезия клеток к волокнам матрикса (стрелки) на 21 сут. культивирования: А — клетки коры мозга вьетнамской вислобрюхой свиньи; Б — клетки селезенки морской свинки. Ув. х400
документировать прикрепление клеток других органов к структурам матрикса.
Заключение
Изготовленный бесклеточный матрикс из Вартонова студня пуповины человека был практически полностью лишен антигенных компонентов, что позволило обеспечить его неиммунногенность.
Наши исследования показали, что тканеинженер-ный бесклеточный лиофилизированный матрикс пуповины человека не токсичен для фибробластов кожи человека, в различной степени способствует усилению миграции клеток из эксплантов тканей разных органов различных лабораторных животных, динамике их роста и жизнеспособности, что дает основания предполагать сохранность в продукте из пуповины молекул-стимуляторов клеточной пролиферации. Было установлено наиболее выраженное положительное влияние матрикса на динамику роста и жизнеспособность клеток
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:
1. Leung А., Crombleholme T.M., Keswani S.G. Fetal wound healing: Implications for minimal scar formation. Curr. Opin. Pediatr. 2015; 24(3): 371-8.
2. Rowlatt U. Intrauterine Wound Healing in a 20 Week Human Fetus. Virchows Arch. A Path. Anat. and Histol. 1979; 381: 353-61.
3. Lo D.D., Zimmermann A.S., Nauta A. et al. Scarless fetal skin wound healing update. Birth Defects Research 2012; 96(PtC): 237-47.
4. Калюжная Л.И., Чернов В.Е., Фрумкина А.С. и соавт. Изготовление тканеинженерного бесклеточного матрикса пуповины человека. Вестник Российской Военно-медицинской академии 2020; 1(69): 124-30. [Kalyu-zhnaya L.I., Chernov V.E., Frumkina A.S. et al. Production of tissue-engineered cell-free matrix of the human umbilical cord. Bulletin of the Russian Military Medical Academy 2020; 1(69): 124-30].
5. Калюжная Л.И., Хоминец В.В., Чеботарёв С.В. и соавт. Применение биоматериала из пуповины человека для восстановления повреждений суставного хряща. Профилактическая и клиническая медицина 2019; 4(73): 45-52. [Kalyuzhnaya L.I., Khominets V.V., Chebotarev S.V. et al. The use of biomaterial from the human umbilical cord for the restoration
эксплантов суставного хряща. Выявленные различия могут быть связаны с видовой специфичностью, что необходимо учитывать при выборе тест-систем при проведении исследований.
Адгезия клеток коры головного мозга вьетнамской вислобрюхой свиньи и селезенки морской свинки к волокнам матрикса, по-видимому, свидетельствует о сохранности в нем молекул, стимулирующих направленную миграцию клеток и их прикрепление к структурным элементам матрикса.
Перспективные исследования должны быть направлены на определение в матриксе пуповины человека факторов роста, скорости деградации матрикса и эффективности применения бесклеточного матрикса пуповины в составе ТИК для заживления глубоких ран кожи и суставного хряща in vivo.
Конфликт интересов
Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.
of articular cartilage damage. Preventive and clinical medicine 2019; 4(73): 45-52].
6. Crapo P.M., Gilbert T.W., Badylak S.F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials 2011; 32: 3233-43.
7. Gupta A., El-Amin S.F., Levy H.J. et al. Umbilical cord-derived Wharton's jelly for regenerative medicine applications. Journal of Orthopaedic Surgery and Research 2020; 15(49): 1-9.
8. Koci Z., Vyborny K., Dubisova J. et al. Extracellular Matrix Hydrogel Derived from Human Umbilical Cord as a Scaffold for Neural Tissue Repair and Its Comparison with Extracellular Matrix from Porcine Tissues. Tissue engineering. Part C-methods 2017; 23(6): 333-45.
9. Деев Р.В., Бозо И.Я., Мавликеев М.О. и соавт. Регенерационный гистогенез в области дефекта скелетной мышцы при местном введении ген-активированного гидрогеля на основе гиалуроновой кислоты в эксперименте. Гены & Клетки 2020; XIV(2): 66-72. [Deev R.V., Bozo I.Ya., Mavlikeev M.O. et al. Regenerative histogenesis in the area of a skeletal muscle defect with local administration of a gene-activated hydrogel based on hyaluronic acid in an experiment. Genes & Cells 2020; XIV(2): 66-72].
