CC BY
63
Физиология
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2011, № 2 (2), с. 237-242
УДК 612.014:616.831.01.6-074(021)
ВЛИЯНИЕ BDNF НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ НЕЙРОННОЙ СЕТИ ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ГИППОКАМПА В УСЛОВИЯХ ГЛЮКОЗНОЙ ДЕПРИВАЦИИ
12 12 12 1 © 2011 г. М.В. Ведунова 1, Т.А. Сахарнова 1, С.А. Коротченко 1, А.Н. Балашова ,
И.В. Мухина 1,2
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
2 Нижегородская государственная медицинская академия
Поступила в редакцию 03.06.2011
Изучено влияние глюкозной депривации на функционирование нейронной сети диссоциированных культур гиппокампа. Показано усиление спонтанной биоэлектрической активности во время кратковременной глюкозной депривации и резкое необратимое снижение электрической активности, усиление свободнорадикального окисления и дисбаланс в соотношении лактат/глюкоза после нее. Установлено, что введение в культуральную среду BDNF (1 нг/мл) снижало последствия глюкозной депривации, вызванные дефицитом энергетического субстрата. Эффект BDNF проявлялся в нормализации показателей биоэлектрической и метаболической активности нейронной сети первичной культуры гиппокампа как в процессе глюкозной депривации, так и в отдаленный период.
Ключевые слова: диссоциированная культура гиппокампа, BDNF, глюкозная депривация.
Введение
В настоящее время глюкозная депривация рассматривается как один из основных факторов повреждения клеток головного мозга при ишемическом воздействии и других патологических состояниях, связанных с нарушением метаболизма глюкозы [1]. Длительное нарушение энергетического обмена нейронов приводит к изменению процессов синаптической передачи, гибели клеток и разрушению нейронных сетей головного мозга [2, 3]. Таким образом, одной из актуальных проблем современной биологии и медицины является поиск веществ, способных защитить клетки головного мозга от повреждающего действия глюкозной депривации. ВDNF (brain-derived neurotrophic factor), как нейротрофический фактор, участвует не только в дифференцировке нейронов и формировании синаптических контактов в процессе развития головного мозга, но и является активным корректором метаболизма зрелых нейронов [4, 5], модулятором синаптической пластичности [6]. В связи с этим, целью наших исследований являлось изучение влияния BDNF на спонтанную электрическую и метаболическую активность первичной культуры гиппокампа в условиях кратковременной глюкозной депривации in vitro.
Материалы и методы
В исследовании использованы первичные культуры клеток гиппокампа, полученные от 18-дневных эмбрионов мышей линии СВА. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, данным в Приказе Минздрава России № 708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации» и были согласованы с этическим комитетом при ГОУ ВПО НижГМА Мин-здравсоцразвития. Диссоциирование клеток достигалось путем обработки ткани гиппокампа 0.25%-ным трипсином. Клетки ресуспендирова-ли в нейробазальной среде NeurobasalTM (Invi-trogen) в комплексе с биоактивной добавкой В27 (Invitrogen), глутамином (Invitrogen), эмбриональной телячьей сывороткой (ПанЭко) и культивировали, согласно ранее разработанному протоколу, в течение 37 дней in vitro (DIV) на мультиэлектродной матрице системы MED64 (Alpha MED Sciences, Japan), содержащей 64 микроэлектрода. Предварительно матрицу стерилизовали УФ-облучением и обрабатывали полиэтиленимином, служившим опорным субстратом для культивируемых клеток. Исходная плотность культуры на матрице составляла 2000 кл/мм2. Поддержание жизнеспособности культуры осуществлялось в условиях СО2-ин-
кубатора при температуре 35.5оС и газовой смеси, содержащей 5% СО2. Кратковременную глюкозную депривацию (ГД) (2 часа) проводили на 30-й день культивирования путем полной замены культуральной среды на среду (DMEM/F12 1:1, ПанЭко) без глюкозы. Для поддержания осмолярности раствора использовали сахарозу. В части экспериментов в среду без глюкозы добавляли ВDNF (0.1 и 1 мг/мл). После окончания ГД безглюкозную среду замещали на культуральную питательную среду с глюкозой. Контролем служили культуры, в которых среду полностью заменяли на культуральную, содержащую глюкозу.
Биоэлектрическая активность нейронной сети в первичной культуре клеток гиппокампа оценивалась по параметрам сетевой пачечной активности (количеству сетевых пачек спайков/мин, средней продолжительности пачки импульсов, средней частоте спайков в пачке импульсов, среднему межпачечному интервалу) [3]. Показателями метаболизма клеток культуры являлось содержание глюкозы, лактата и общего белка (Vital Diagnostic, Россия) в культуральной среде. Параллельно определяли интенсивность свободнорадикальных процессов методом индуцированной биохемилюминес-ценции. Информативным показателем считается Imax - максимальная интенсивность свечения исследуемой пробы, отражающая свободнорадикальную активность образца. Показатель S -светосумма хемилюминесценции за определенное время - обратно пропорционален антиокси-дантной активности (АОА) пробы.
АОА - суммарная физико-химическая величина, характеризующая способность данного субстрата тормозить реакции окисления. AOA зависит от относительного количества и физико-химических параметров каждого из биоантиоксидантов, имеющихся в анализируемой смеси, их взаимного влияния друг на друга, от присутствия веществ, способных усиливать или ослаблять действие биоантиоксидантов. Также оценивалось содержание окислительно модифицированных белков (ОМБ) [7]. Окислительная модификация белков приводит к образованию карбонильных производных, которые в присутствии 2,4-ДНФГ (0.01М) образуют окрашенные соединения - 2,4-динитро-фенил-гидразоны. Оптическую плотность образовавшихся соединений регистрируют при длине волны 363 нм. При расчете уровня ОМБ оптическую плотность 2,4-динитрофенилгидра-зонов относят к концентрации общего белка в пробе (Vital diagnostic). Для количественной
обработки и анализа полученных данных использовался набор программного обеспечения Conductor™ (Alpha MED Sciences, Japan) и пакет прикладных программ Matlab.
Результаты и их обсуждение
Диссоциированные культуры гиппокампа проявляли стабильную спонтанную биоэлектрическую пачечную активность, начиная с 8 дня культивирования. Развитие культуры in vitro сопровождалось изменением уровня потребления глюкозы из культуральной среды и накопления в среде лактата - одного из промежуточных участников энергетического обмена. При этом спонтанная электрическая активность культуры коррелировала с накоплением лактата в среде культивирования (коэффициент корреляции 0.871), что позволяет рассматривать лактат как один из основных показателей метаболической активности диссоциированной культуры гиппокампа. К 21-25 дню культивирования наблюдалась стабилизация метаболической и электрической активности диссоциированных культур.
Показано, что двухчасовая глюкозная депривация на 30 день культивирования приводила к повышению биоэлектрической активности нейронной сети первичной культуры гиппокампа, запуская при этом каскад реакций, вызывающих в дальнейшем гибель части функционально активных нейронов. Паттерн спонтанной активности, регистрируемый мультиэлект-родной матрицей, изменялся за счет увеличения количества сетевых пачек в минуту до 1.5 часов ГД в среднем в 3.14 раза при уменьшении количества спайков в пачке в 53 раза (рис. 1). Через
2 часа глюкозной депривации наблюдалось изменение биоэлектрической активности, связанное с исчезновением пачечной активности, что обусловлено, вероятно, истощением внутриклеточных запасов энергетических субстратов. Введение BDNF в безглюкозный среду предотвращало усиление биоэлектрической активности сети нейронов, вызванное глюкозной депривацией (более чем в 3 раза уменьшалось количество пачек импульсов при увеличении продолжительности пачек в 1 . 7 раза и межпачечно-го интервала в 7.7 раза) (рис. 1).
Через 2 часа после глюкозной депривации в контрольной серии в диссоциированных культурах гиппокампа возобновлялась пачечная активность, однако количество пачек импульсов и количество спайков (рис. 1 б) в пачке импульсов (рис. 1 а) было достоверно ниже исходных значений.
250
150
5 100
с
и
Я
со
о
Й 50 О
*11 * * * * * *
до ГД 5
35
95
120 2 часа 1 сут 6 сут
ГД, мину ты После ГД
ГД ГД + ВБОТ 1 нг/мл ГД + ВБОТ 0,1 нг/мл
1600 1400 « 1200 I 1000
та
с
к 800
| 600 О
400
200
0
до ГД
* * * * * * * * * *
35
95
120
2 часа
1 сут 6 сут
ГД, минуты
ГД ГД + ВБОТ 1 нг/мл
После ГД ГД + ВБОТ 0,1 нг/мл
Рис. 1. Влияние двухчасовой глюкозной депривации на биоэлектрическую активность нейронной сети диссоциированной культуры гиппокампа мышей (Е18): а - количество сетевых пачек импульсов; б - количество спайков в пачке (шеап±ББ)
* Статистически значимые различия по сравнению с исходными значениями, p < 0.05 (критерий Крускала - Уоллиса).
її 200
0
б
5
Таким образом, изменения биоэлектической активности, возникающие в культуре в процессе глюкозной депривации, носили необратимый характер. Исследование спонтанной биоэлектрической активности в течение 6 суток после глюкозной депривации показало, что несмотря на восстановление количества и длительности пачек импульсов, количество спайков в пачке оставались достоверно ниже исходных значений (рис. 2). Введение в безглюкозную среду ВБКБ (в концентрации 1 нг/мл) во время глю-
козной депривации предотвращало не только усиление биоэлектрической активности во время глюкозной депривации, но и угнетение биоэлектрической активности, наблюдаемое в отдаленный период в контрольной серии.
Повышенная активность и изменение паттерна сетевых пачек во время глюкозной депривации обусловлены, вероятно, усиленным высвобождением возбуждающего нейротрансмиттера глутамата из пресинаптических термина-лей пирамидных нейронов, входящих в состав
25
20
15
и о
а з 10
глюкоза
лактат
контроль ГД ГД + BDNF ГД + BDNF
1 нг/мл 0,1 нг/мл
Рис. 2. Влияние ВБОТ на содержание глюкозы и лактата в культуральной среде через сутки после глюкозной депривации. Диссоциированная культура гиппокампа мышей (Е18) (шеап±ББ)
* Статистически значимые различия по сравнению с контролем,p < 0.05;
“ статистически значимые различия по сравнению с глюкозной депривацией, p < 0.05.
нейронной сети первичной культуры гиппокампа. Усиление высвобождения глутамата может происходить вследствие стимуляции экзоцитоза повышенной концентрацией внутриклеточного кальция [Са2+] в пресинаптических терминалях в результате его дополнительного выброса из внутриклеточных депо, в частности, из митохондрий. Известно, что ГД приводит к падению мембранного потенциала митохондрий за счет ингибирования КАТФ-каналов и, как следствие, к снижению аккумулирующей способности митохондрий и усилению выброса Са2+ в цитоплазму [8]. Данный механизм может являться критическим фактором развития эксайтотоксичности, опосредуемой повышением [Са2+]1 и запуском каскада патологических метаболических реакций на постсинаптическом уровне, приводящих к гибели нейронов не только во время ГД, но и в течение 6 дней после глюкозной депривации [9].
О глубоких внутриклеточных изменениях метаболизма, вызванных ГД, свидетельствовали снижение метаболической активности и активация свободнорадикальных процессов в отдаленном периоде после глюкозной депривации. Глюкозная депривация приводила к уменьшению концентрации промежуточного продукта энергетического обмена лактата в культуральной среде. При этом концентрация глюкозы в культуральной среде оставалась достоверно выше, чем в контрольных культурах, что говорило о снижении поглощения глюкозы клетка-
ми. Динамика изменения лактата и глюкозы в среде коррелировала с меньшим количеством клеток в отдаленный период после глюкозной депривации. Добавление в безглюкозную среду ББКБ в концентрации 1 нг/мл, но не 0.1 нг/мл, во время глюкозной депривации предотвращало изменение соотношения глюкоза/лактат (рис. 2), что было обусловлено сохранением жизнеспособности большей части клеток. Двухчасовая ГД вызывает увеличение количества некра-тически отмирающих клеток в диссоциированной культуре гиппокампа. В контроле количество мертвых клеток не превышает 0.3% от общего числа клеток, через сутки после ГД количество мертвых клеток увеличивается до
0.8-1.2%. Этот процесс продолжается на протяжении 6 суток после ГД и может вызвать гибель 30% клеток культуры. Введение BDNF при ГД снижает цитотоксический эффект, вызванный глюкозным голоданием.
Окислительная модификация белка (ОМБ) -один из показателей, свидетельствующих о функциональном состоянии белковых систем клеток. Усиление ОМБ может быть показателем активации свободнорадикальных процессов и снижения антиоксидантной активности, что приводит к нарушению работы многих ферментов и рецепторов. Экспериментальные данные свидетельствовали о том, что глюкозная депривация активирует свободнорадикальные процессы (рис. 3) в первичной культуре гиппокампа.
5
0
1 нг/мл 0,1 нг/мл
Рис. 3. Уровень окислительной модификации белков в культуральной среде через сутки после глюкозной депривации. Диссоциированная культура гиппокампа мышей (Е18) (шеап±ББ)
* Статистически значимые различия по сравнению с контролем, p < 0.05;
** статистически значимые различия по сравнению с глюкозной депривацией, p < 0.05.
Таблица
Показатели биохемилюминограммы (БХЛ) в культуральной среде через сутки после глюкозной депривации (шеап±8Б).
Диссоциированная культура гиппокампа мышей (Е18)
Показатели БХЛ 5 -^шах tg2a
Контроль 8.56±0.82 2.30±0.11 0.90±0. 14
ГД 10.90±0.65* 2.65±0.14* 1.22±0.11
ГД + BDNF (1 нг/мл) 9.06±0.72“ 2. 3 8±0.13 0. 96±0. 11
ГД + ВБОТ (0.1 нг/мл) 11.00±0.91* 2.67±0.14* 1.30±0.05*
* Статистически значимые различия по сравнению с контролем, p < 0.05;
“ статистически значимые различия по сравнению с глюкозной депривацией, p < 0.05.
Активация данных процессов может быть связана с разобщением реакций окислительного фосфорилирования на мембране митохондрий из-за нарушения поступления достаточного количества НАДН в условиях дефицита энергетического субстрата при нормоксии и снижением активности внутриклеточных антиоксидантных энергозависимых ферментатных систем.
ББКР (1 нг/мл) вызывает достоверное (р < < 0.05) снижение уровня ОМБ в отдаленном периоде после ГД по сравнению с культурами, подвергшимися двухчасовой глюкозной депривации в контрольной серии. Об усилении свободнорадикальных процессов свидетельствовали и показатели биохемилюминесценции (таблица).
Было отмечено, что антиоксидантное действие ББКБ имело дозозависимый характер. В минимальной концентрации 0.1 нг/мл ББКБ не оказывало влияния на показатели биохемилю-минесценции и содержание ОМБ.
Заключение
Двухчасовая ГД приводит к повышению биоэлектрической активности нейронной сети первичной культуры гиппокампа, запуская при этом каскад метаболических реакций, провоцирующих в дальнейшем гибель части функционально активных нейронов. Кроме того, ГД активирует свободнорадикальные процессы диссоциированной культуры гиппокампа.
Введение ББКБ (1 нг/мл) во время глюкоз-ной депривации предотвращает чрезмерную активацию спонтанной биоэлектрической активности сети нейронов во время глюкозной депривации, что опосредует снижение цитотоксичности ГД и последующей летальности клеток. При этом сохраняется метаболическая активность и активность свободнорадикальных реакций первичной диссоциированной культуры гиппокампа на уровне культур, не подвергавшихся ГД.
Применение ББКБ в концентрации 0.1 нг/мл изменяет электрическую активность нейронной сети первичных культур гиппокампа, подвергшихся ГД, но не оказывает влияния на метаболическую активность и состояние свободнорадикальных реакций в отдаленном периоде.
Список литературы
1. Мухина И.В., Казанцев В.Б., Хаспеков Л.Г. и др. Мультиэлектродные матрицы - новые возможности в исследовании пластичности нейрональной сети // Современные технологии в медицине. 2009. № 1. С. 8-15.
2. Мухина И.В., Хаспеков Л.Г. Новые технологии в экспериментальной нейробиологии: нейронные сети на мультиэлектродной матрице // Анналы клинической и экспериментальной неврологии. 2010. № 2. С. 44-51.
3. Коротченко С.А., Ведунова М.В., Коряги-на Е.А. и др. Модуляция спонтанной биоэлектрической активности нейронной сети первичной культуры гиппокампа глутаматом и №арахидоноилдо-фамином // Матер. Всерос. конф. с междунар. участием «Современные направления исследований функциональной межполушарной асимметрии и пла-
стичности мозга», Москва, 2-3 декабря 2010 г. С. 390-394.
4. Almedia R.D., Manadas B.J., Melo C.V. et al. Neuroprotection by BDNF against glutamate-induced apoptotic cell death is mediated by ERK and PI3 -kinase // Cell Death and Differentation. 2005. V. 12. P. 13291343.
5. Huang E.J., Reichardt L.F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction // Annu. Rev. Biochem. 2003. V. 72. P. 609-642.
6. Chao M.V. Neurotrophins and their receptors: a convergence point for many signaling pathways // Nat. Rev. Neurosci. V. 4. P. 299-309.
7. Дубинина Е.Е., Бурмистров С.О. Ходов Д.А., Поротов И.Г. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения // Вопросы медицинской химии. 1995. Т. 41. № 1. С. 24-26.
8. Kahlert S., Zundorf G. and Reiser G. Glutamate-mediated influx of extracellular Ca2+ is coupled with reactive oxygen species generation in cultured hippocampal neurons but not in astrocytes // J. Neurosci. Res. 2005. V. 79. P. 262-271.
9. Stelmashook E.V., Lozier E.R., Goryacheva E.S., et al. Glutamine-mediated protection from neuronal cell death depends on mitochondrial activity // Neurosci. Lett. 2010. V. 482. № 2. P. 151-155.
BDNF EFFECT ON THE FUNCTIONING
OF A PRIMARY HIPPOCAMPAL CULTURE NEURON NETWORK IN GLUCOSE DEPRIVATION
M. V. Vedunova, T.A. Sakharnova, S.A. Korotchenko, A.N. Balashova,
I.V. Mukhina
The effect of glucose deprivation on the functioning of a dissociated hippocampal culture neural network has been studied. We have observed an enhancement of spontaneous bioelectrical activity during short-term glucose deprivation and an abrupt irreversible decrease of bioelectrical activity, intensification of free radical oxidation and imbalance in the lactate/glucose ratio after it. Application of BDNF (1 ng/ml) in the culture has been found to reduce dramatic consequences of glucose deprivation caused by the deficiency in the energy substrate. The effect of BDNF was manifested in the normalization of the bioelectric and metabolic activity of the neural network of the primary hippocampal culture both during glucose deprivation, and in the distant recovery period.
Keywords: dissociated hippocampal culture, BDNF (brain-derived neurotrophic factor), glucose deprivation.
