CC BY
55
лабораторные и экспериментальные исследования
УДК: 616-006-097-092.9:615.37:615.28
влияние бактериальной вакцины на противоопухолевый иммунитет и функциональную активность мононуклеаров, супрессированную цисплатином
Н.К. Ахматова1, Е.А. Лебединская2, О.М. Кузьменко1, О.В. Лебединская2,
ф.В. Доненко3, М.В. Киселевский3
ГУ «нии вакцин и сывороток им. Н.Н. мечникова РАЫИ», г. москва1
ГоУ ВПо «Пермская государственная медицинская академия мз РФ», кафедра гистологии2 ГУ «Российский онкологический научный центр им. н.н. Блохина РАмн», г. москва3 105064, г. москва, пер. малый казенный, 5-а, e-mail: anelly@mail.ru
Оценивали влияние Иммуновак-ВП-4 на развитие метастазов у мышей линии С57В1/6, которым была имплантирована карцинома легких Льюиса. С этой целью внутрибрюшинно вводили Иммуновак-ВП-4 в дозе 400 мкг по различным схемам: (1) - за 7, 5, 3 сут до имплантации опухоли в подушечку лапки; (2) - на 0, 1, 3, 5-е сут после имплантации опухоли; (3) - за 7, 5, 3 сут до имплантации и на 0, 1, 3, 5-е сутки после имплантации опухоли. Введение по схемам 1 и 3 было более эффективным, поскольку количество животных с метастазами сокращалось в 2 раза и 1,7 раза соответственно, а количество метастазов - в 5,6 и 4,8 раза. При комбинированной терапии мышей циклофосфаном и Иммуновак-ВП-4 продолжительность жизни увеличивалась с 1,19 до 1,37 раза по сравнению с контрольными дозами циклофосфана. При этом удлинение продолжительности жизни коррелировало со снижением численности метастазов в легких. Иммуновак-ВП-4 также защищал МЛПК от токсического действия цитостатика, при этом наблюдалась не только отмена иммуносупрессии, но и усиление функциональной активности МЛПК. Таким образом, поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4, обладающая иммуномодулирующими свойствами и несущая различные комбинации PAMPs, через их взаимодействие с TLR приводит к усилению противоопухолевого иммунитета путем повышения и/или восстановления эффекторного механизма врожденного иммунитета (вероятно, прежде всего NK-опосредованной цитотоксичности) и модификации других биологических аспектов взаимоотношений организма-носителя и опухоли.
Ключевые слова: поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4, иммуномодуляция, химиотерапия, перевиваемые опухоли.
EFFECT OF BACTERIAL VACCINE ON ANTI-TUMOR IMMUNITY AND CISPLATIN-SUPPRESSED FUNCTIONAL
ACTIVITYOF MONONUCLERS N.K. Akhmatova1, E.A. Lebedinskaya2, O.M. Kuzmenko1, O.V Lebedinskaya2, F.V Donenko3, M.V Kiselevsky3 I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, RAMS, Moscow1 Histology Department, Perm State Medical Academy2 N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS, Moscow3 5-aMalyi Kazyenyi Street, Moscow-105064, e-mail: anelly@mail.ru
Effect of bacterial vaccine Immunovak-VP-4 on metastasis development in C56B1/6 mice implanted with Lewis lung carcinoma was evaluated. Immunovak-VP-4 at a dose of 400 mkg was injected intraperitoneally according to 3 regimens: 1) 7, 5 and 3 days before tumor implantation; 2) 0,1, 3 and 5 days after tumor implantation; 3) 7, 5 and 3 days before implantation and 0,1, 3 and 5 days after tumor implantation. Administration of the 1-st and the 3-rd regimens produced 2- and 1.7-fold reductions in the number of animals with metastases, and 5.6-and 4.8-fold reductions in the number of metastases, respectively. When Immunovak-VP-4 was combined with cyclophosphane, life time of mice was 1.19-1.37 times longer as compared to the control doses of cyclophosphane. Life time prolongation correlated with the reduction in the number of lung metastases. Immunovak-VP-4 protected peripheral blood
mononuclears against toxic effect of cytostatic agent, showing not only immunosupression disappearance, but also enhancement of functional activity of peripheral blood mononuclears. Thus, polycomponent vaccine Immunovak-VP-4, having immunomodulating properties and carrying various combinations of PAMPs through their interraction with TLR, results in the enhancement of antitumor immunity by means of increase and/or recovery of effector mechanisms of inherent immunity (likely, mainly NK-mediated cytotoxicity) and modification of other biological aspects of interaction between the host and the tumor.
Key words: polycomponent vaccine immunovak-VP-4, immunomodulation, chemotherapy, inoculated tumors.
В настоящее время в литературе обсуждается вопрос о возможности регуляции врожденных иммунных механизмов при помощи препаратов, несущих в своем составе патоген-ассоцированные молекулярные структуры (PAMPs) микроорганизмов. Учитывая прорыв знаний в области врожденного иммунитета и огромный наплыв препаратов, предлагаемых фармакологической и биологической индустрией, остро стоит вопрос об изучении влияния данных медикаментозных средств на иммунную систему. Особенно это касается иммуномодуляторов, содержащих в своем составе данные микробные компоненты, распознаваемые паттерн-распознающими рецепторами (PRR) эффекторов врожденного иммунитета.
Важным свойством некоторых иммуномодулирующих препаратов является их способность уменьшать иммуносупрессию, вызываемую цитостатиками [3, 9, 10, 18]. В ряду большого перечня иммуномодулирующих средств, предлагаемых отечественными и зарубежными производителями, перспективными являются бактериальные препараты из антигенов или лизатов условнопатогенных микроорганизмов (рибомунил, бронхо-ваксом, респивакс, поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4 и др.), а также их синтетические аналоги (ликопид). Изучение свойств данных препаратов представляет большой интерес, так как они содержат лиганды к Toll-like рецепторам, активирующим эффекторные механизмы врожденного иммунитета. Эти препараты уже зарекомендовали себя как эффективные средства коррекции вторичных иммунодефицитов. Клинико-иммунологические исследования показывают, что иммуномодуляторы микробного происхождения оказывают положительное влияние при хронических воспалительных и аллергических заболеваниях различной локализации [6]. Однако в настоящее время ощущается существенный недостаток знаний о механизме действия различных бактериальных препаратов на систему противоопухолевого надзора. Это
касается, в первую очередь, влияния иммуномодуляторов микробного происхождения на функциональную активность эффекторов врожденного иммунитета, осуществляющих первую линию защиты. В настоящее время наиболее эффективным фактором в защите от опухолей рассматривается именно система врожденного иммунитета и, прежде всего, натуральные киллеры [19]. Данные факты явились основанием для проведения исследований механизмов действия иммуномодулятора микробного происхождения Иммуновак-ВП-4 на противоопухолевый иммунитет.
Цель работы - изучить влияние Иммуновак-ВП-4 на развитие метастазов у мышей с карциномой легких Льюиса, а также на пролиферативную и цитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов человека и сплено-цитов мыши, супрессированную цисплатином.
Материал и методы
В работе использовали коммерческий химиотерапевтический противоопухолевый препарат, содержащий платину - цисплатин (Bristol-Myers Squibb), циклофосфан («Лэнс», Россия) и по-ликомпонентную вакцину Иммуновак-ВП-4 из антигенов условно-патогенных микроорганизмов (ГУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН), содержащую липополисахарид (ЛПС), ассоциированный с белком наружной мембраны грамотрицательных микроорганизмов, пеп-тидогликан, тейхоевые кислоты и лабильные белковые компоненты стафилококка.
В опытах in vivo оценивали влияние Иммуновак-ВП-4 на развитие метастазов у мышей линии С57В1/6, которым была имплантирована карцинома легких Льюиса. С этой целью внутрибрю-шинно вводили Иммуновак-ВП-4 в дозе 400 мкг по следующим схемам: (1) - за 7, 5, 3 сут до имплантации опухоли в подушечку лапки (группа 2); (2) - на 0, 1, 3, 5-е сут после имплантации опухоли (группа 3); (3) - за 7, 5, 3 сут до имплантации и на 0, 1, 3, 5-е сут после имплантации опухоли (группа 4).
Клетки карциномы перевивали мышам в количестве 1х106 клеток в подушечку лапки. На 12-е сут под эфирным наркозом у животных ампутировали лапку вместе с опухолью в стерильных условиях. В опытах с циклофосфаном цитостатик вводили мышам через сутки после удаления опухоли (13-е сут после имплантации), затем еще через 1 сут однократно вводили Иммуновак ВП-4. На 18-й день животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Затем подсчитывали количество и размеры метастазов в легких по стандартной методике. Каждая группа мышей состояла из 10 особей.
Выделение мононуклеарных лейкоцитов периферической крови (МЛПК). МЛПК выделяли из стабилизированной гепарином (25 ед/мл) периферической крови 15 здоровых доноров. Кровь, разведенную в два раза средой 199, центрифугировали при 400 g в течение 30 мин в градиенте плотности фиколл-урогафина («Pharmacia», плотностью 1,077 г/см3), МЛПК, образовавшие интерфазное кольцо, собирали пипеткой и трехкратно отмывали средой 199. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждали центирифугированием при 200 g.
Получение суспензии спленоцитов мышей. Селезенки мышей гомогенизировали в среде 199, трижды осаждали центрифугированием и переводили в среду культивирования (106 клеток в 1 мл обогащенной среды RPMI-1640).
Культивирование клеток опухолевых линий К-562 и YAC-1. Клетки эритробластного лейкоза человека линии К-562 и мышиной лимфомы YAC-1 культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением глютамина, 5 % фетальной сыворотки крупного рогатого скота и гентамицина при 37°С в атмосфере 4 % СО2 .
Оценка пролиферативной активности МЛПК и спленоцитов мышей проводилась в колориметрическом тесте с использованием витального красителя AlamarBlue (США) в стерильных условиях, используя ламинарный бокс с горизонтальным потоком воздуха (Juan VFS 906). Среду с клеточной взвесью вносили в лунки 96-луночного плоскодонного планшета (Co-
star) по 200 мкл на лунку. Затем добавляли ВП-4 в диапазоне концентраций от 3 до 20 мкг/мл и/или цисплатин в концентрации 1 мкг/мл. Планшеты помещали в С02-инкубатор (37°С, 5 % СО2). Клетки инкубировали в присутствии этих препаратов в течение 72 ч. По окончании инкубации в лунки вносили краситель AlamarBlue (10 %) (Biosours, США). Флюоресценцию измеряли после четырехчасовой инкубации при 37°С, 5 % СО2 на флюориметре Versa Fluor V13 (Втокал) при длине волны возбуждения 530— 560 нм, эмиссии 590 нм и выражали в единицах оптической плотности (ОП). Рассчитывали индекс стимуляции (ИС), представляющий собой отношение пролиферативной активности МЛПК в стимулированной ВП-4 культуре, к пролиферативной активности МЛПК при действии цисплатина. Снижение пролиферативной активности клеток под действием цисплатина расценивали как цитопатогенное действие. Аналогичное исследование было проведено на мышах ex vivo. Для этого 10 мышей линии СВА иммунизировали ВП-4 однократно внутрибрю-шинно в дозе 400 мкг и получали спленоциты через 24 ч после введения препарата. Контролем служили 10 интактных животных.
Цитотоксический тест. Цитотоксическую активность МЛПК определяли на линии клеток эритробластного лейкоза человека К-562, а спленоцитов мышей (СВА) на NK-зависимой линии клеток мышиной лимфомы YA^l в тесте восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-тест) [17]. Опухолевые клетки (3*104 в 1 мл) инкубировали в культуральной среде с МЛПК в соотношении 1:5 в плоскодонных 96-луночных микропланшетах в присутствии ВП-4 и/или ци-сплатина (фирма Costar, Франция) 18 ч при 37°С и 4 % СО2. Затем в лунки добавляли витальный краситель МТТ (фирма Sigma, США). Результат оценивали спектрофометрически по оптической плотности, измеряемой при длине волны 540 нм на мультискане MS (фирма Labsystem, Финляндия) и рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности).
Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стъюдента, критерия Вилкоксона при помощи стандартного пакета статистических программ Windows (StatSoft 6.0).
Таблица 1
результаты терапии карциномы легких льюиса (LL) у мышей C57Bl/6, иммунизированных
иммуновак-вп-4
№ группы Количество мышей с метастазами Количество метастазов в легких, на 20-е сут наблюдения (M±m) Размер метастазов на 20-е сут наблюдения (мм3)
1 10/10 31,8 ± 0,8 1,7 ± 0,06
2 5/10 5,7 ± 1,9* 0,24 ± 0,08*
3 10/10 14,9 ± 0,9* 1,19 ± 0,11
4 6/10 6,6 ± 1,8* 0,21 ± 0,06*
Примечание: * - статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой (р<0,05) по критерию Вилкоксона и 1-критерию Стьюдента; между группами по количеству мышей с метастазами (по %2) р1н2<0,01, р1н3<0,05.
Результаты и обсуждение
Установлено, что у мышей при всех схемах введения Иммуновак-ВП отмечалось снижение количества и размеров метастазов. Обращает на себя внимание то, что введение по схемам 1 и 3 (группы 2 и 4) было более эффективным, поскольку количество животных с метастазами сокращалось в 2 раза и 1,7 раза соответственно, а количество метастазов снижалось в 5,6 и 4,8 раза. При этом у животных 3-й группы количество метастазов в легких также снижалось в 2 раза. Однако в показателе продолжительности жизни у леченых животных и нелеченых достоверных различий отмечено не было (табл. 1).
Следующей задачей нашего исследования явилось изучение ингибирующего влияния Иммуновак-ВП-4 на образование метастазов у мышей С57В1/6 с карциномой легких Льюиса (LL) на фоне введения циклофосфана. Цитостатик (табл. 2) в исследуемых концентрациях удлинял продолжительность жизни животных по сравнению с контрольной группой, при этом наблюдался дозозависимый эффект. При комбинированной терапии мышей циклофосфаном и Иммуновак-ВП-4 продолжительность жизни увеличивалась с 1,19 до 1,37 раза по сравнению с контрольными дозами циклофосфана. При этом удлинение продолжительности жизни коррелировало со снижением численности метастазов в легких. Количество метастазов при комбинированной терапии также уменьшалось при сочетании всех доз цитостатика и Иммуновак-ВП-4. Дозозависимый эффект противоопухолевого действия циклофосфана сохранялся и был более выраженным при комбинированном применении цитостатика и иммуномодулятора. Так, при введении Иммуновак-ВП-4 в комбинации с
циклофосфаном значимо увеличивалась продолжительность жизни мышей, уменьшалось количество особей с метастазами и снижалось количество метастазов в легких. Эффект возрастал при увеличении дозы циклофосфана на фоне введения 400 мкг/мышь иммуномодулятора
На следующем этапе работы была исследована пролиферативная активность МЛПК здоровых доноров in vitro при коинкубации Иммуновак-ВП-4 с платинолом (цисплатин), который по механизму противоопухолевого действия сходен с алкилирующими веществами, препарат угнетает синтез ДНК [8]. Спонтанная пролиферативная активность МЛПК доноров (табл. 3) в условиях данного опыта составляла 0,738 ± 0,280 ед. ОП (группа 1). Прибавление в среду культивирования платинола в концентрации 1 мкг/мл оказывало выраженное супрессивное действие на пролиферативный потенциал МЛПК (группа 2).
При культивировании МЛПК в присутствии ВП-4, наоборот, происходило повышение пролиферативной активности клеток до 1,572 ед. ОП (группа 3). В условиях инкубации клеток с ВП-4 и цисплатином наблюдали повышение пролиферативной активности по сравнению с группой 2, то есть отмечалась частичная отмена супрессии, вызванной цитостатиком. Восстановление угнетенной платинолом пролиферативной активности МЛПК носило дозозависимый характер. При использовании максимальной из испытанных доз ВП-4 супрессивное действие цисплатина уменьшалось и пролиферативная активность увеличивалась соответственно с 0,025 ± 0,006 до 0,236 ± 0,006 ед. ОП (р<0,001), при этом индекс стимуляции составил 9,4.
Таблица 2
Количество метастазов у мышей с карциномой легких льюиса при комбинированной терапии циклофосфаном и иммуновак-вп-4
Иммуно- модулятор Циклофосфан мг/кг Bыжило/всего Продолжительность жизни, дни Количество мышей с метастазами Количество метастазов в легких
абс %
- - 0/10 0 25,4 i 1,2 10/10 31,0 i 0,8
50 0/10 0 33,3 i 0,7 10/10 29,7 i 0,9
100 0/10 0 38,0 i 1,7 10/10 26,9 i 1,0*
150 1/10 10 39,7 i 2,1 S/10 19,1 i 3,2*
БП-4 (400 мкг/мышь) - 0/10 0 26,7 i 1,1 10/10 30,9 i 0,7
50 1/10 10 39,5 i 1,2* 9/10 12,7 i 2,3*
100 3/10 30 44,8 i 2,7* 7/10 4,9 i 1,1*
150 4/10 40 54,3 i 3,5* 5/10 2,4 i 0,8*
Примечание: * - достоверность различий по сравнению с соответствующими дозами циклофосфана (р<0,05); по числу выживших мышей между группами 1 и 2 (^=6,14, p<0,01); по количеству метастазов между группами 1 и 2 (х2=5,15, p<0,01).
Таблица 3
влияние иммуновак-вп-4 на пролиферативную активность млпК здоровых доноров (n=15) при коинкубации с платинолом in vitro
№ группы Kонцcнтрация компонентов в среде культивирования Пролиферативная активность MÜÜJK
ЫЛШ B^4, мкг/мл Платинол, мкг/мл Oптическая плотность ЮП„„ „„„) v 540-620' ИС
1 10б 0 0 0,738 i 0,280 -
2 10б 0 1,0 0,025 i 0,006# -
3 10б 15,0 0 1,572 i 0,043** -
4 10б 3,0 1,0 0,053 i 0,015 2,1
5 10б 5,0 1,0 0,122 i 0,041* 4,9
б 10б 10,0 1,0 0,223 i 0,003** 8,9
7 10б 15,0 1,0 0,233 i 0,004** 9,3
s 10б 20,0 1,0 0,236 i 0,006** 9,4
Примечание: # - ИС (индекс стимуляции/супрессии) - отношение пролиферативной/цитотоксической активности M.nRK, стимулированных BÜ-4, к пролиферативной/цитотоксической активности M.nRK при инкубации с платинолом (группа 2). Достоверность различий между группами: * - р2 и р5<0,05; ** - p1 и р3, р2 и р67 s<0,001.
Увеличение пролиферативной активности MЛПK, как правило, сопровождалось повышением цитотоксической активности этих клеток по отношению к опухолевым клеткам (табл. 4). Спонтанная цитотоксичность MЛПK здоровых доноров в отношении клеток линии K562 составляла 3S,40 i 1,5S % (группа 1). При инкубации MЛПK с платинолом цитотоксический эффект снизился - 1S,1S i 0,23 % (группа 2),
что было связано с токсическим действием пла-тинола на MЛПK. Поликомпонентная вакцина Иммуновак-BП-4 увеличивала цитотоксичность MЛПK в 1,6 раза - 60,10 i 1,02 % (группа 3). ^инкубация Иммуновак^П-4 (в концентрациях от 5 до 20 мкг/мл) с платинолом усиливала киллерные свойства MЛПK в отношении опухолевых клеток-мишеней, причем с увеличением дозы Иммуновак^П-4 цитотоксическая актив-
Таблица 4
влияние иммуновак-вп-4 на цитотоксическую активность млпК здоровых доноров (n=15) по отношению к клеткам К562 при коинкубации с платинолом in vitro
№ группы Kонцcнтрация компонентов в среде культивирования Цитотоксичность MüüiK, %
MЛ B^4, мкг/мл Платинол, мкг/мл
1 10б 0 0 38,40 i 1,58
2 10б 0 1,0 18,18 i 0,23
3 10б 15,0 0 60,10 i 1,02
4 10б 5,0 1,0 68,68 i 0,41*
5 10б 10,0 1,0 78,90 i 0,79*
б 10б 15,0 1,0 74,66 i 0,69*
7 10б 20,0 1,0 87,56 i 0,55*
Примечание: достоверность различий между группами: * - р2 и р45б7<0,001.
Таблица 5
пролиферативная и цитотоксическая активность спленоцитов мышей, однократно иммунизированных иммуновак-вп-4 на фоне иммуносупрессии, вызванной платинолом
(n=10)
Kонцентрация платинола в среде культивирования, мкг/мл Пролиферативная активность спленоцитов мышей (°П540-620) Цитотоксическая активность ЫЛ мышей в отношении клеток YÄC-1 (%)
Неиммуни- зированных Иммунизированных B^4 Неиммунизи- рованных Иммунизированных B^4
0 0,626 i 0,027 0,995 i 0,046* 42,88 i 4,09 85,01 i 2,11*
1,0 0,079 i 0,047 0,287 i 0,015* 25,26 i 1,38 89,70 i 2,11*
клеток, обработанных платинолом, полученных от
Примечание: * - достоверность различий между группами культур иммунизированных и неиммунизированных мышей (р<0,01).
ность возрастала и достигала 87,56 ± 0,55 % при концентрации 20 мкг/мл. Таким образом, иммуномодулятор Иммуновак-ВП-4 защищал МЛПК от токсического действия цитостатика, при этом наблюдалась не только отмена иммуносупрессии, но и усиление функциональной активности МЛПК. При этом отмена иммуносупрессии, индуцированной токсическим действием цитостатика, проявлялась отменой угнетения пролиферации и усилением цитоток-сической активности МЛПК.
Пролиферативную и цитотоксическую активность МЛ селезенок мышей линии СВА изучали ex vivo, после 1-кратной внутрибрю-шинной иммунизации Иммуновак-ВП-4 в дозе 400 мкг (табл. 5). Через 24 ч после иммунизации пролиферативная активность МЛ мышей увели-
чивалась с 0,626 ± 0,027 до 0,995 ± 0,046 ед. ОП. Внесение платинола в среду культивирования оказывало выраженное цитотоксическое действие на МЛ интактных мышей, что проявлялось в снижении пролиферативной активности в 7,9 раза, до 0,079 ± 0,047 ед. ОП. Иммунизация мышей Иммуновак-ВП-4 уменьшала супресси-рующее действие платинола, и пролиферативная активность МЛ восстанавливалась до 0,287 ± 0,015 ед. ОП (р<0,01). В этом тесте вновь подтверждена частичная отмена супрессивного эффекта платинола на МЛ селезенок мышей под действием Иммуновак-ВП-4.
МЛ селезенок интактных мышей обладали спонтанной цитотоксичностью в отношении NK-чувствительной мышиной опухолевой линии YАС-1, которая составляла 42,88 ± 4,09 %.
У иммунизированных мышей цитотоксическая активность МЛ была в 1,98 раза выше, чем у интактных, и достигала 85,01 ± 2,11 % (р<0,01). Прибавление в среду инкубации МЛ интактных мышей платинола в концентрации 1 мкг/мл снижало их цитотоксичность до 25,26 ± 1,38 %. У иммунизированных мышей цитотоксическая активность МЛ повышалась до 85,01 ± 2,11 % и практически не изменялась при прибавлении платинола 89,7 ± 2,11 %.
Многие исследователи считают, что важную роль в развитии опухолей играет снижение активности иммунной системы организма [4, 13]. Формирование злокачественных новообразований может наблюдаться при некоторых естественно возникших (СПИД) или искусственно спровоцированных (трансплантация органов и тканей) состояниях иммунодепрессии. Однако в литературе на этот счет имеются неоднозначные данные, поскольку опухоли могут регистрироваться на фоне, казалось бы, нормальных значений иммунограммы, поэтому само по себе обнаружение иммунных нарушений не дает оснований прогнозировать возможность возникновения опухоли. С другой стороны, растущая опухоль вырабатывает вещества, угнетающие активность иммунной системы, и тем самым «защищает» себя от противоопухолевого иммунитета. Несмотря на разноречивость взглядов, большинство авторов считает, что опухоли сопровождаются формированием вторичных иммунодефицитных состояний [7, 16].
В последние годы ведутся исследования по разработке методов биотерапии опухолей, и многие крупные онкологи высказывают мнение, что именно биотерапия станет одним из основных элементов в программах лечения злокачественных новообразований в XXI веке [15]. Чрезвычайно активизировались поиски и создание новых иммуномодулирующих активных субстанций и препаратов на их основе. Создаются препараты, повышающие способность организма переносить тяжелое лечение в процессе противоопухолевой терапии и обладающие минимальными побочными эффектами. В настоящее время в поисках повышения эффективности комплексной терапии онкологических заболеваний внимание исследователей привлекают иммуномодуляторы, восстанавливающие функциональную актив-
ность иммунной системы, сниженную на фоне опухолевого процесса, оперативного вмешательства, лучевой и химиотерапии [5, 14].
В наших предыдущих работах выявлена способность поликомпонентной вакцины Иммуновак-ВП-4 потенцировать систему врожденного иммунитета [1, 2, 11]. В частности, выраженная стимуляция активности NK-клеток доноров под воздействием Иммуновак-ВП-4, отмеченная в этих экспериментах [2], послужила предпосылкой для изучения способности данного иммуномодулятора влиять на течение опухолевого процесса у мышей in vivo в сочетании с цитостатиком и без него.
Настоящие исследования показали, что внутрибрюшинное введение Иммуновак-ВП-4 мышам снижает количество и размеры метастазов. Особенно этот факт представляет интерес при введении этого препарата после имплантации опухоли, так как в клинической практике приходится сталкиваться именно с уже сформировавшимися опухолевыми узлами. Несмотря на то, что схема введения иммуномодулятора после имплантации опухоли оказалась менее эффективной, чем при профилактическом введении, количество метастазов в легких у мышей после введения Иммуновак-ВП-4 на фоне опухоли снижалось в 2 раза по сравнению с нелечеными животными, что свидетельствует о противоопухолевой активности Иммуновак-ВП-4. Одним из механизмов антиметастатиче-ского действия Иммуновак-ВП-4, возможно, является усиление цитотоксического действия лейкоцитов, в особенности NK-клеток. Известно, что важным свойством NK является их способность уничтожать клетки-мишени с любыми нарушениями, а также лизировать опухолевые клетки [19] без участия специфических рецепторов и главного комплекса гистосовместимости, поэтому эти клетки представляются более важными в осуществлении первой и наиболее эффективной линии противоопухолевой защиты. Также известно, что NK, являясь эффекторами врожденного иммунитета, несут на своей поверхности TLR, реагирующие с патоген-ассоциированными структурами иммуномодуляторов и микробов.
В настоящее время в лечении онкологических больных предпринимаются попытки использо-
вания методов, основанных на рациональном сочетании химиотерапии и иммуномодуляторов, что позволяет снизить дозу вводимого цитостатика [9]. Поэтому следующей задачей нашего исследования явилось изучение ингибирующего влияния Иммуновак-ВП-4 на образование метастазов у мышей С57В1/6 с карциномой легких Льюиса (LL) на фоне введения циклофосфана. Этот эксперимент подтвердил наши предположения о возможности Иммуновак-ВП-4 оказывать защитное действие на жизнеспособность и активность иммуноцитов, в обычных условиях подвергающихся ингибирующему действию цитостатика. При комбинированной терапии мышей циклофосфаном и Иммуновак-ВП-4 дозозависимо снижалось количество метастазов в легких мышей и увеличивалась продолжительность их жизни по сравнению с контрольными группами животных, которым вводили только циклофосфан. Также выявлено. что Иммуновак-ВП-4 усиливал цитотоксичность МЛПК и спленоцитов иммунизированных мышей по отношению к NK-зависимым клеткам эритробластного лейкоза человека К562 и клеток мышиной лимфомы YAC-1 соответственно, а также потенцировал действие цисплатина. Предварительные исследования [1] показали, что поликомпонентная вакцина оказывает опосредованный мононуклеарами эффект, при этом не обладая токсическим действием на опухолевые клетки.
В последние годы появились данные, свидетельствующие о противоопухолевом действии бактериальных лизатов. Показано, что перо-ральное введение бронхо-ваксома и респивакса приводило к уменьшению числа и размеров метастазов имплантированной карциномы Льюиса у мышей. Комбинация бронхо-ваксома или ре-спивакса с химиотерапией усиливала противоопухолевый эффект [18]. В механизме действия бактериальных лизатов участвуют различные иммунологические механизмы, включающие продукцию цитокинов IL-1, IL-2, TNF-a, IFN-y, активацию макрофагов [20], натуральных киллеров (NK-клетки) и др. [9, 24]. Также установлено, что некоторые цитостатические препараты влияют на активность NK-клеток. Так, в опытах in vitro было показано увеличение активности по отношению к опухолевым клеточным линиям
NK-клеток, полученных от здоровых доноров при коинкубации с цитостатиками [21-23].
Таким образом, наши эксперименты показали, что Иммуновак-ВП-4 оказывает дозозависимый стимулирующий эффект in vitro на пролиферативный потенциал МЛПК здоровых доноров и МЛ мышей, иммунизированных Иммуновак-ВП-4, в присутствии платинола exvivo. Также Иммуновак-ВП-4 усиливает цитотоксичность МЛПК и МЛ иммунизированных мышей по отношению к NK-чувствительным клеткам К562 и YA^1 соответственно и потенцирует цитотоксическое действие платинола. Это согласуется с данными других авторов, показавших снижение иммуносупрессии при включении в комплексную противоопухолевую терапию иммуномодулирующего препарата имунофан [12]. В экспериментальных исследованиях установлено, что введение цитоста-тиков с синтетическим иммуномодулятором N-ацетилглюкозаминил-мурамилдипептидом (ГМДП) обеспечивало большую выживаемость мышей-опухоленосителей, чем при использовании одних цитостатиков [3].
Резюмируя вышеизложенное, можно сделать заключение о том, что поликомпонент-ная вакцина Иммуновак-ВП-4, обладающая иммуномодулирующими свойствами и несущая различные комбинации PAMPs, через их взаимодействие с TLR приводит к усилению противоопухолевого иммунитета путем повышения и/или восстановления эффекторного механизма врожденного иммунитета (вероятно, прежде всего NK-опосредованной цитотоксичности) и модификации других биологических аспектов взаимоотношений организма-носителя и опухоли.
ЛИТЕРАТУРА
1. АхматоваН.К., СеменоваИ.Б., Доненко Ф.В. и др. Микробные иммуномодуляторы усиливают цитотоксичность мононуклеарных лейкоцитов человека и уменьшают метастазирование легочной карциномы Льюиса у мышей // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2006. № 6. С. 35-40.
2. Ахматова Н.К., Шубина И.Ж., Киселевский М. В., Семенов Б.Ф. Влияние поликомпонентной вакцины ВП-4 на цитотоксическую активность мононуклеаров периферической крови здоровых доноров // Аллергология и иммунология. 2004. Т. 5, № 1. С. 47.
3. Валякина Т.И., ПетроваЕ.Э., СимоноваМА. и др. Комбинация ГМДП и TNF-a обладает противоопухолевым действием и влияет на иммунный статус мышей опухоленосителей // Мед. иммунол. 2003. Т. 5, № 3-4. С. 350.
4. Воробьев А.А., Киселевский М.В., Титов К.С. и др. Концепция адоптивной иммунотерапии у больных раком желудка после радикального хирургического лечения // Вестник РАМН. 2003. № 6. С. 16-19.
5. Добрица В.П., Ботерашвили Н.М., Добрица Е.В. Современные иммуномодуляторы для практического применения. СПб.: Политехника, 2001. 200 с.
6. Егорова Н.Б., Ефремова В.Н., Курбатова Е.А., Кузьмина Л.А. Итоги экспериментального и клинического изучения поликомпонентной вакцины из антигенов условно патогенных микроорганизмов // Журн. микробиол. 1997. № 6. С. 96-101.
7. Камарли З.П., Анкудинова СА. Влияние иммунотерапии рофероном А на функциональное состояние печени и почек // Вестник КРСУ 2002. № 1.
8.МашковскийМ.Д. Лекарственные средства. Т 2. М.: Медицина, 2001. 576 с.
9. Петрова Е.Э., Валякина Т.Н., Несмеянова ВА. ГМДП потенцирует цитотоксическое действие ТОТ-а и цитостатиков на опухолевые клетки // Мед. иммунол. 2002. Т. 4, № 2. С. 304-305.
10. Петрунов Б., Ненков П. Исследование воздействия на иммунную систему респивакса - полибактериальной вакцины для пероральной иммунотерапии и иммунопрофилактики неспецифических инфекций дыхательного тракта // Журн. микробиол. 1991. № 4. С. 34-35.
11. Семенов Б.Ф., Ахматова Н.К., Киселевский М.В. и др. Клеточные и молекулярные события при введении поликомпонентной бактериальной вакцины и заражении S. 1ур^ тигшт // Молек. мед. 2005. № 4. С. 48-54.
12. Тутельян А.В. Иммунорегуляторная оценка естественных и синтетических препаратов в системе прайминга лейкоцитов // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2003. Т. 5, № 12. С. 55-57.
13. Чикилева Н.О., Халтурина Е.О., Киселевский М.В. Современные подходы и направления в иммунотерапии и иммунопрофилактике злокачественных новообразований // Молек. мед. 2003. № 2. С. 40-47.
14. Ярилин А.А. Принципы иммунодиагностики и иммунотерапии // Основы иммунологии. М.: Медицина, 1999. С. 543-560.
15. Biological therapy of cancer / Eds V. De Vita, S. Hellman, S. Rosenberg. 2nd Ed. 1995. P. 853-862.
16. ChangD. H., OsmanK., Connoly J. et al. Sustained expansion of NKT cells and antigen-specific T cells after injection of -galactosyl-ceramide loaded mature dendritic cells in cancer patients // JEM. 2005. Vol. 201, № 9. P. 1503-1517.
17. Fields R.D., Lancaster M.V. Dual attribute continuous monitoring of cell proliferation/cytotoxity // Am. Biotech. Lab. 1993. Vol. 11, № 4. P 48-50.
18. KassabovK., Stoychkov Y. Inhibitory of spintaneus metastases of Lewis carcinoma by oral treatment with Respivax and Broncho-vaxom // Cancer Immunol. Immunother. 1991. Vol. 33. P. 307-313.
19. Maeda Y., Kimura Y. Antitumor effects of various low-molecular-weight chitosans are due to increased natural killer activity of intestinal intraepithelial lymphocytes in sarcoma 180-bearing mice // J. Nutr. 2004. Vol. 134, № 4. P 945-950.
20. Mauel J. Stimulation of immunoprotective mechanisms by OM-85 BV // Respiration. 1994. Vol. 61, № 1. P. 8-15.
21. Petersson E., Qi Z., Ekberg H. et al. Activation of alloreactive natural killer cells is resistant to cyclosporine // Transplantation. 1997. Vol. 63, № 8. P 1138-1144.
22. Sudo T., Kobayashi Y., Matsushita N. et al. Phenotypical analysis of effector cells on nonspecific cancer cell therapy // Gan To Kagaku Ryoho. 2003. Vol. 30, № 11. P. 1817-1822.
23. UnoM., Tsuchiyama J.,Moriwaki A. et al. In vitro induction of apoptosis for nasal angiocentric natural killer cell lymphoma-derived cell line, NK-YS, by etoposide and cyclosporine A // Br. J. Haematol. 2001. Vol. 113, № 4. P. 1009-1014.
24. Wybran J., LibinM., SchandeneL. Activation of natural killer cells and cytokine production in man by bacterial extracts // Immu-nopharmacol. Immunotoxicol. 1989. Vol. 11. P 17-32.
Поступила 9.04.08
