CC BY
27
УДК 612.015.35: 612.172 + 612.111: 599.323.4
ВЛИЯНИЕ БАД «Ко Qio» НА ОБМЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ В ЭРИТРОЦИТАХ И МИОКАРДЕ КРЫС, СОДЕРЖАВШИХСЯ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРНЫХ РЕЖИМАХ
© 2007 г. З.И. Микашинович, Е.С. Белоусова
It was established that addition of BAS "CoQ10" to rat's ration at comfortable temperature resulted in the increase of erythrocytes functional activity and power elevation of cardiomyocytes. Administration of BAS "CoQ10" at uncomfortable temperature (leading to tissue hypoxia) optimized intracellular compensation mechanisms avoid tissue damage. High dosage and prolonged treatment by BAS "CoQ10" made these effects more remarkable.
Одной из важнейших социальных и медицинских проблем является изменение структуры и характера питания населения. В основе этой проблемы лежит множество факторов, среди которых можно выделить изменение технологий производства и хранения продуктов питания; загрязнение их токсическими элементами, пестицидами, антибиотиками, радионуклидами; применение генетически модифицированных компонентов. Следствием этого является снижение содержания витаминов, микроэлементов, минорных компонентов пищи, что способствует снижению резистентности организма к действию патогенных факторов и повышает риск развития многих заболеваний.
Кроме того, современный человек подвергается действию множества факторов, требующих формирования адаптационно-компенсаторных реакций, что также истощает функциональные резервы организма. В рамках этого положения можно выделить проблему изменения среднесуточных температур в летнее и зимнее время в ряде регионов. Многочисленными исследованиями показано, что и снижение, и повышение температуры внешней среды за пределы так называемой «зоны комфорта» вызывает интенсификацию свободнорадикальных процессов, истощение механизмов антиоксидантной защиты, перераспределение и постепенное истощение энергетических ресурсов [1].
Создавшаяся ситуация способствовала поиску новых профилактических технологий, направленных на повышение резистентности организма. На современном этапе в качестве такой технологии наиболее перспективным представляется использование биологически активных добавок (БАД) к пище [2].
Появление широкого спектра БАД на мировом рынке ставит вопрос об адекватном выборе методических подходов для оценки состояния функциональных систем организма, изучении характера изменений
обменных процессов в органах и тканях организма с разной функциональной специфичностью после приёма БАД. Поиск и отбор информативных лабораторных критериев позволит создать алгоритм, необходимый для объективной оценки целесообразности и эффективности применения БАД.
Цель исследования - выяснение характера метаболической реакции миокарда и эритроцитов периферической крови крыс под влиянием БАД «Ко 01о» при изменении функционального состояния организма при повышенной температуре окружающей среды.
Материалы и методы исследования
Эксперименты проведены на 60 белых беспородных крысах самцах массой 180 ± 15,5 г.
В первой серии исследованы 30 животных, содержавшихся при температуре 18±0,1 °С, что соответствует так называемой зоне комфорта [3]. Крысы разделены на 2 группы: 1-я (контрольная) - 15 животных, содержавшихся на общевиварийном рационе; 2-я - 15, получавших в составе рациона БАД «Ко р10» (производства компании ВитаЛайн (США)) в рекомендуемой дозировке - 10-5 М, что соответствует 30 мг/кг [4].
Рацион включал в себя основные продукты питания в произвольных количествах.
Во второй серии исследованы 30 крыс, содержавшихся в условиях перегревания за счёт повышения температуры окружающей среды за пределы «комфортной зоны». Для этого животных выдерживали в суховоздушном термостате по 8 ч ежедневно при температуре 40±0,5 °С в течение 14 дней. Воздух вентилировали через отверстия в дверце. В этой серии экспериментальные крысы также были разделены на 2 группы по 15 в каждой: 3-я (группа сравнения) - об-щевиварийный рацион питания; 4-я - в составе рациона БАД «Ко р10» в рекомендуемой дозировке (10-5 М) в пересчёте на 100 г массы.
БАД «Ко Q10» животные получали в течение 21 дня и по истечении этого срока были декапитирова-ны. Для исследования использовались гомогенаты желудочков сердца и эритроциты крови.
Для определения активности ферментов углеводного обмена и антирадикальной защиты в тканях готовили гомогенат в соотношении 1 г ткани: 9 мл охлаждённого физиологического раствора [5]. Для удаления ядерной фракции гомогенаты центрифугировали в холодовой центрифуге при температуре 0-4 0С при 3000 об/мин в течение 5-7 мин [6].
Митохондрии клеток выделяли дифференциальным центрифугированием после гомогенизации на холоду в солевом растворе (0,15 М KCl и 10 мМ трис-HCl). Для удаления ядерной фракции гомогенаты центрифугировали 15 мин при 2400 об/мин. Фракцию митохондрий выделяли в течение 25 мин при 8-105 об/мин с двукратным промыванием средой выделения.
Активность ферментов в эритроцитах и гомогена-тах тканей исследовали спектрофотометрическими методами. Для определения активности сукцинатде-гидрогеназы (СДГ) и цитохромоксидазы (ЦХО) использовали гомогенат митохондрий (400-500 мг белка в 0,2 мл суспензии). Активность ферментов гликолиза и гексозомонофосфатного шунта, а также антиокси-дантной защиты определяли в надосадочной жидкости. Для определения активности ферментов в эритроцитах использовали 20 -%-й гемолизат, приготовленный на бидистиллированной воде. Активность ЦХО определяли в реакции с диметил-п-фениленом по принципу метода Р. С. Кривченковой (1977) в описании З.И. Микашинович [7]. Активность СДГ определяли методом, основанном на использовании тетра-золиевого синего C40H32O2Cl2 и феназинметасульфата для создания системы переноса электронов от субстрата дегидрогеназной реакции к соли тетразолия с образованием формазана (Nordmann et al. (1951) [7]. Активность ферментов выражали в нмоль/мг белка в мин. Активность гексокиназы определяли по прописи И.С. Лугановой (1971) [5], активность фосфогексоизо-меразы определяли по методу Р.Ф. Езерского (1960) [7], фосфорилазы - Д.Л. Фердмана и Е.Ф. Сонина (1957) [5], глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - Л. Корн-берга в модификации Ю.Л. Захарьина (1967) по степени восстановления НАДФ в ферментативной реакции с глюкозо-6-фосфатом в присутствии ионов магния [5]. Активность ферментов выражали в мкмоль/мг белка.
Для изучения состояния газотранспортной функции эритроцитов определяли концентрацию 2,3-дифосфо-глицерата (ДФГ) методом Dyse, Bessman в модификации И.С. Лугановой, М.Н. Блинова (1975), пировино-градной кислоты - по Фридеману и Хаугену в модификации П.М. Бабаскина [8], молочной кислоты - по реакции с параоксидифенилом, описанной в [9].
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили согласно общепринятым методам с определением средней арифметической ошибки с использованием программы STATISTICA, версия 6.0. О достоверности отличий учитываемых показателей сравниваемых групп судили по величине t-критерия Стьюдента после проверки распределения на нормальность. Статистически достоверными считали от-
личия, соответствующие оценке ошибки вероятности р < 0,05.
Результаты и их обсуждение
Представленный фактический материал показал, что в эритроцитах крыс, содержавшихся в условиях, соответствующих «зоне комфорта» (группа 2) - после введения в рацион БАД «Ко Ои^» достоверно увеличилась концентрация 2,3-ДФГ на 61,04 % (р<0,001) и соотношение лактат/пируват на 249,48 за счёт увеличения концентрации лактата на 179,01 % (р<0,001) относительно животных контрольной группы. Выявленные изменения указывают на необходимость формирования адаптационно-компенсаторной реакции, направленной на улучшение оксигенации тканей.
Особенность обменных процессов в эритроцитах -отсутствие митохондрий, поэтому энергетические потребности этих клеток покрываются за счёт окисления глюкозы в ходе гликолиза. У животных обсуждаемой группы после введения в рацион БАД «Ко Риз» активность ключевого фермента гликолиза - гексокиназы (ГК) достоверно не изменилась по сравнению с группой 1 (интактные животные, содержавшиеся на общевиварийном рационе), при достоверном снижении активности фосфогексоизомеразы (ФГИ) на 29,58 % (р<0,05), гл-6ф-ДГ - на 92,79 (р<0,001), фосфорилазы - на 55,16 % (р<0,001) по сравнению с контрольной группой.
После введения в рацион БАД «Ко Ои^» в миокарде животных, содержавшихся в комфортных температурных условиях (группа 2), наблюдается достоверное увеличение соотношения лактат/пируват на 59,76 % (р<0,001) за счёт увеличения концентрации лактата на 34,97 (р<0,001) и снижения уровня пирува-та на 16,24 % (р<0,01) относительно животных, содержавшихся при тех же температурных условиях на общевиварийном рационе (контрольная группа). Выявленные изменения свидетельствуют об изменении направленности обменных реакций в сторону превалирования их анаэробной фазы.
Изменение кислородного режима в сердечной мышце влечёт за собой резкое изменение активности энергопродуцирующих систем. Прежде всего, в миокарде животных исследуемой группы зарегистрировано выраженное увеличение активности ферментов дыхательной цепи: СДГ - на 278,76 % (р<0,001), ЦХО - на 144,58 (р<0,001) по сравнению с контрольной группой, что указывает на высокий уровень окислительного фосфорилирования.
Кроме того, в миокарде животных группы 2 регистрируется достоверное увеличение активности ГК на 114,68 % (р<0,001) и ФГИ - на 243,68 (р<0,001), что является отражением активного включения глюкозы в окислительно-восстановительные процессы. Адекватный уровень глюкозы обеспечивается в реакциях глюконеогенеза и гликогенолиза. После введения в рацион БАД «Ко Ои^» животным исследуемой группы и в миокарде, и в эритроцитах выявлено накопление лактата, приводящее к снижению уровня рН и изменению активности ферментов глюконеогенеза. В этих условиях потребности организма в глюкозе обеспечиваются за счёт распада гликогена, на что указывает достоверное увеличение активности фосфорилазы на
200,99 % (р<0,001) по сравнению с контрольной группой. По мнению В.И. Соболевского и В.В. Елисеева [10], усиление активности фосфорилазы также указывает на усиление анаэробного метаболизма и, в частности, гликогенолиза.
Увеличение ферментов обмена глюкозы может свидетельствовать о переориентации метаболизма миокарда на преимущественное окисление углеводов. Особенность метаболизма миокарда - преобладание аэробного окисления и углеводов, и жирных кислот, однако в сложившихся условиях превалирование окисления углеводов позволяет обеспечить синтез аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), адекватный уровню потребляемого кислорода. Кроме того, в пересчёте на 1 моль потреблённого кислорода энергетический выход от расщепления глюкозы гораздо выше, чем при окислении жирных кислот. Следовательно, при физиологическом течении обменных процессов БАД «Ко Р10» способствует повышению мощности энергосистем миокарда при снижении уровня потребляемого кислорода.
Введение в рацион «Ко Р10» сопровождается снижением активности гл-6ф-ДГ на 52,82 % (р<0,001) относительно контрольной группы, что может не носить принципиального характера, так как у интактных животных основной вклад в формирование фонда НАДФН+Н+ вносят изоцитратдегидрогеназа и малат-дегидрогеназа [6].
При оценке состояния кислородтранспортной функции крови у животных, содержавшихся при температуре 40±0,5 0С на общевиварийном рационе (группа 3), выявлено увеличение концентрации 2,3-дифосфоглицерата (ДФГ) на 219,56 % (р<0,001), соотношения лактат/пируват - на 281,78 (р<0,001), что связано с повышением в эритроцитах этих животных концентрации лактата на 170,03 % (р<0,001) и снижение уровня пировиноградной кислоты (ПВК) на 65,50 (р<0,001) по сравнению с животными контрольной группы. Комплекс этих изменений указывает на формирование гипоксии у экспериментальных животных, что соответствует данным, представленным в обзоре литературы.
При содержании животных в условиях, моделирующих гипоксию (группа 3), выявлен комплекс изменений, характерных для гипоксического повреждения: увеличение интенсивности включения глюкозы в окислительные процессы (увеличение активности фосфогексомзомеразы (ФГИ) на 105,81 % (р<0,001)), активация гликогенолиза (увеличение активности фосфорилазы на 25,19 % (р<0,001)) и пентозофосфат-ного шунта (увеличение активности гл-6ф-ДГ на 150,44 % (р<0,001)) относительно животных контрольной группы.
После введения в рацион БАД «Ко Рш» в эритроцитах животных, содержавшихся в условиях превышения температурного комфорта (группа 4), наблюдается достоверное снижение величины соотношения лактат/пируват 85 % (р<0,001), что возможно за счёт снижения концентрации лактата на 87,24 % (р<0,001); а также концентрации 2,3-ДФГ - на 46,07 (р<0,02) относительно группы 3 (животные, содержавшиеся на общевиварийном рационе при повышенной температуре). Полученные данные позволяют высказать
предположение, что в условиях превышения температуры «комфорта» введение в рацион БАД «Ко р10» способствует снижению тяжести гипоксии, что связано со снижением пагубного влияния высоких концентраций молочной кислоты, а также нормализацией кислородтранспортной функции крови.
Нельзя не отметить, что после введения в рацион исследуемой БАД уровень молочной и пировиноградной кислот значительно ниже физиологических показателей, но при этом величина соотношения лактат/пируват превышает контрольное значение на 17,42 % (р<0,02). Концентрация 2,3-ДФГ сохраняется на уровне, превышающем контрольный на 72,34 % (р<0,001). По некоторым данным тепловое воздействие сопровождается снижением эритроцитов и гемоглобина, являющимся результатом гемолиза под влиянием токсических продуктов обмена даже в период, когда действие температурного фактора уже отсутствует [11]. Задержка созревания эритроцитов в этот период связана с торможением функций кроветворной системы. По-видимому, сохраняющийся лактоацидоз и высокий уровень 2,3-ДФГ могут указывать на повышение функциональной активности эритроцитов и формирование модуляционного механизма адаптации, связанного со снижением сродства гемоглобина к кислороду.
Введение в рацион БАД «Ко в условиях моделируемой гипоксии приводит к резкому угнетению активности ГК на 81,80 % (р<0,001), в то время как активность ФГИ увеличилась на 101,79 % (р<0,001) относительно животных группы 3. Разнонаправленные изменения активности ферментов гликолиза могут указывать на особенности механизмов адаптации в эритроцитах. Снижение активности ГК может служить отрицательным прогностическим признаком, так как скорость гексокиназной реакции в эритроцитах является одним из звеньев, лимитирующих метаболизм глюкозы. В то же время увеличение активности ФГИ свидетельствует о высокой интенсивности использования глюкозо-6-фосфата в реакциях гликолиза, являющегося поставщиком промежуточных продуктов обмена, и этот факт может рассматриваться как приспособительный в стрессовой ситуации.
Важно отметить, что введение в рацион БАД «Ко Р10» животным, содержавшимся при повышенной температуре, способствует снижению активности гл-6ф-ДГ на 69,66 % (р<0,001) относительно животных группы 3, что также, на наш взгляд, отражает включение метаболических механизмов адаптации, так как активация начальных этапов пентозофосфатного шунта (ПФШ) рассматривается как неблагоприятная реакция на гипоксию.
Вместе с тем после введения в рацион БАД «Ко Рш» животным, содержавшимся в условиях, моделирующих гипоксию (группа 4), выявлено увеличение активности фосфорилазы на 154,86 % (р<0,001) относительно группы 3 (животные, содержавшиеся в таких же температурных условиях на общевиварий-ном рационе), что свидетельствует о необходимости мобилизации глюкозы из резервного фонда и сохранении анаэробной ориентации метаболизма.
При повышении температуры среды обитания в миокарде животных происходит достоверное увели-
чение соотношения лактат/пируват на 78,18 % (р<0,001), уровня лактата - на 57,66 (р<0,001); концентрация пирувата достоверно не изменилась по сравнению с животными контрольной группы, что свидетельствует о формировании тканевой гипоксии. В условиях гипоксии ряд ключевых позиций в поддержании энергетического гомеостаза в сердечной мышце принадлежит гликолизу и гликогенолизу. Однако в нашем эксперименте в миокарде животных анализируемой группы выявлено угнетение реакций метаболизма глюкозы и гликогена, о чём свидетельствует снижение активности ГК на 89,91 % (р<0,001), ФГИ - на 31,03 (р<0,001), гл-6ф-ДГ - на 91,95 (р<0,001), фосфорилазы - 21,75 % (р<0,001) относительно животных контрольной группы.
При исследовании активности ферментов терминального окисления в миокарде животных, содержавшихся при температуре 40 0С, выявлена весьма характерная реакция на гипоксию со стороны дыхательной цепи, т.е. выраженное достоверное увеличение активности СДГ на 64,76 % (р<0,001), угнетение активности ЦХО - на 64,99 (р<0,001) (биохимические «ножницы») относительно контрольной группы.
После введения в рацион БАД «Ко Ою» в условиях моделируемой гипоксии регистрируется выраженное снижение соотношения лактат/пируват на 50,77 % (р<0,001), уровня лактата - на 75,97 (р<0,001), пирувата -на 56,49 % (р<0,001) относительно группы 3. Снижение соотношения лактат/пируват указывает на уменьшение тяжести гипоксии и степени выраженности анаэробной направленности обменных процессов. При этом необходимо отметить, что несмотря на положительное влияние, относительно контрольной группы концентрация лактата и ПВК снижена на 62,12 (р<0,001) и 61,62 % (р<0,001), хотя величина соотношения лактат/пируват достоверно не отличалась, что свидетельствует о неполноценности механизмов адаптации к тепловой гипоксии после введения исследуемой БАД.
В условиях гипоксии введение экзогенного уби-хинона способствует усилению интенсивности реакций гликогенолиза (повышение активности фосфорилазы на 148,75 % (р<0,001) по сравнению с животными группы 3).
По данным литературы, в условиях гипоксии переориентация метаболизма миокарда с аэробного окисления жиров и углеводов на более экономный анаэробный гликолиз способствует существенному улучшению работы сердца в постгипоксическом периоде [12]. Под влиянием БАД в миокарде животных 4-й группы определяли достоверное снижение активности ферментов гликолиза - ГК на 20 % (р<0,02), ФГИ - на 43,33 (р<0,001) относительно группы 3.
Одновременно у животных группы 4 выявлено достоверное снижение активности гл-6ф-ДГ на 18,46 % (р<0,001) относительно животных группы 3.
После введения исследуемой БАД в миокарде животных регистрируется тенденция к снижению активности СДГ на 5,78 % (0,05<р<0,1) относительно группы 3. Активность ЦХО после приёма БАД снизилась на 22,04 % (р<0,001) относительно животных группы 3.
В условиях разобщения окисления и фосфорилиро-вания, сопровождающего гипоксию, активация СДГ
Ростовский государственный медицинский университет
будет свидетельствовать о мобилизации резервов. По мнению М.Н. Кондрашовой [13, 14], такая реакция является «реакцией тревоги» на ферментативном уровне и эффективным механизмом адаптации к изменению кислородного режима. Что касается снижения активности ЦХО, то можно сказать, что это липидзависимый фермент и уменьшение его активности может свидетельствовать об активации ПОЛ [15].
Таким образом, на основании представленного фактического материала можно сделать вывод, что введение в рацион БАД «Ко Q10» животным, содержавшимся при температуре, соответствующей «зоне комфорта», способствовало изменению обменных процессов в эритроцитах, характеризующихся повышением их функциональной активности. На это указывает увеличение концентрации лактата и 2,3-дифосфоглицерата. В миокарде животных с физиологическим течением обменных процессов «Ко Q10» способствовал значительному усилению реакций метаболизма глюкозы, что может свидетельствовать об увеличение мощности энергосистем органа. При содержании животных в условиях, моделирующих тепловую гипоксию, «Ко Q10» способствует снижению тяжести гипоскии, на что указывает снижение концентрации лактата во всех исследуемых органах по сравнению с животными, не получавшими БАД. Полученные данные позволяют предположить, что увеличение дозировки убихинона или длительности его приёма, а также комбинация с препаратом анти-гипоксантом позволит получить более выраженный протекторный эффект.
Литература
1. Барабой В.А., Орёл В.Э., Карнаух И.М. Перекисное окисление и радиация. Киев, 1991.
2. Тутельян В.А., Спиричев В.Б., Шатнюк Л.Н. // Вопросы питания. 1999. Т. 68. № 1. С. 3 - 11.
3. Колбанов В.В. Валеология. СПб., 2000.
4. Виноградова Л.Ф. и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1994. Т. 57. № 6. С. 54 - 57.
5. Саркисян О.Г. Особенности изменений метаболических процессов при атрофических кольпитах и их коррекция: Дис... канд. мед. наук. Ростов н/Д, 2000.
6. Черникова Л.М. Состояние энергетического метаболизма миокарда кроликов при длительном сдавлении мягких тканей конечности: Дис. ... канд. биол. наук. Ростов н/Д, 1985.
7. Микашинович З.И. Общие и частные закономерности изменений в эндокринных органах и крови при разной тяжести травматического шока и острой кровопотери: Дис. ... д-ра. биол. наук. Ростов н/Д, 1989.
8. А.с. № 877436 СССР. 1981. Способ определения пиро-виноградной кислоты в крови.
9. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. М., 1987.
10. Соболевский В.И., Елисеев В.В. // Кардиология. 1984. № 4. С. 98 - 99.
11. Горизонтов П.Д., Сиротинин Н.Н. Патологическая физиология экстремальных состояний. М., 1973.
12. Liu B. et al. // Circ. Res. 1996. Vol. 79. P. 940-948.
13. Кондрашова М.Н. Терапевтическое действие янтарной кислоты. Пущино, 1976.
14. Кондрашова М.Н. и др. Митохондрии: Биохимия и ультраструктура. М., 1975.
15. Чесникова А.И. Клинико-патогенетические особенности хронического легочного сердца и их медикаментозная коррекция: Дис. канд. мед. наук. Ростов н/Д, 1998.
_6 декабря 2006 г.
