CC BY
29
Влияние аттенуированных штаммов сальмонелл на лимфоидную ткань тонкого отдела кишечника при формировании специфического иммунитета у песцов против сальмонеллеза
И.И. Окулова, соискатель, З.Н. Бельтюкова, к.в.н, ст.н.с, Ю.А. Березина, кв.н, ст.н.с., И.А. Домский, д.в.н., ГНУ ВНИИОЗ им. проф. Б.М. Житкова
Профилактика сальмонеллеза в звероводческих хозяйствах всегда была актуальной проблемой. В борьбе с сальмонеллезом животных важное место занимает вакцинопрофилактика. Современное звероводство нуждается в разработке и освоении новых эффективных средств, методов и схем профилактики сальмонеллеза пушных зверей, обеспечивающих высокую эффективность иммунизации при значительном снижении производительности и трудовых затрат. Разработка вакцин из аттенуированных штаммов сальмонелл решила проблему эффективной профилактики сальмонеллеза у пушных зверей [1]. Применение живых вакцинных штаммов сальмонелл дает возможность апробировать разные способы профилактики заболевания, например, перораль-ный, когда вакцинные антигены вводятся в организм животных с кормом.
Получение экспериментальных данных, характеризующих иммуногенную активность вакцинного препарата, является важным этапом в проведении исследований формирования иммунного ответа в органах и тканях иммунной системы у песцов. Следовательно, морфофункциональное изучение органов и тканей иммунной системы актуально и является важной частью комплекса мероприятий, направленных на выяснение характера поствакцинальных изменений.
Целью нашей работы стало изучение гематологических и иммуноморфологических показателей у песцов при вакцинации вакциной из аттенуированных штаммов сальмонелл при перораль-ном методе ее введения.
Материалы и методы исследования. В работе были использованы пушные звери семейства Canidae — песцы вуалевые (Aloplex lagopus) в возрасте 5 месяцев. Было сформировано 2 группы по 20 зверей: опытная и контрольная (не вакцинированные). Материалом для исследований служили кровь и лимфоидная ткань тонкого отдела кишечника: кусочки двенадцатиперстной, тощей и подвздошной кишок.
Животных опытной группы иммунизировали перорально вакциной из аттеинуированных штаммов сальмонелл трех серотипов: Sal. tipimurium №3; Sal.choleraesuis № 9; Sal. dublin № 6. Для скармливания зверям была использо-
вана суточная культура вакцинных штаммов сальмонелл. Вакцинный препарат добавляли в корм с мясо-рыбно-зерновым фаршем в дозе 50 млрд. микробных клеток на голову с интервалом 10—14 дней. С целью активного поедания кормовой смеси зверей предварительно выдерживали на суточной голодной диете.
Животных контрольной группы не вакцинировали, их использовали для анализа полученных данных.
Методы исследования
Гематологические методы. Кровь у подопытных животных брали из вены задней конечности (V. saphena) до начала опытов и через 7, 14, 21, 28 дней после иммунизации. Определение гематологических показателей проводили согласно общепринятым методикам, описанным в соответствующих руководствах В.А. Берестова (1980, 2005) [2]. Кровь использовали также для выделения лимфоцитов и их популяций [3, 4].
Биохимические методы. Белковые фракции в сыворотке крови определяли нефелометрическим методом.
Иммунологические методы. В качестве тест-микроорганизма был использован полевой вирулентный штамм Salmonella typhimurium, что выгодно характеризовало специфичность выявленных изменений. Для оценки опсоно-фагоци-тарной реакции использован числовой показатель Штритера.
Морфологические методы. Кусочки органов фиксировали в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина. Материал обрабатывали по общепринятым методикам [5]. Морфометрические измерения органов иммунной системы проводили с использованием окуляр-микрометра МОВ-1-15 (мкм 15) по Г.Г. Автандилову (1993). Подсчет клеточного состава производили в 50 полях зрения на микроскопе МБИ-3У42, объектив 100/ 1.25.OIL, окуляр WF 10 18, окулярной измерительной сеткой для цито-стереометрических исследований, предложенной Г.Г. Автандиловым [6]. Идентификацию клеток проводили по Г.С. Кати-нас (1981) [7]. Обнаруженные изменения фотографировали с использованием видеосистемы DIGITAL (Japan), микроскопа JENAVAL (ГДР).
Статистические методы обработки материала. Полученный цифровой материал статистически обрабатывали с вычислением среднеарифметических показателей (М), среднеквадратических ошибок (м) и определения уровня достоверности
различия результатов (Р) с последующей оценкой по критическим значениям t-образного критерия Стьюдента. Все указанные вычисления производили на персональном компьютере, в программе Microsoft Excel. Разница в показателях принята значимой при Р<0,05, что соответствует достоверности разницы в 95% и более.
Результаты исследований. исследования показали поствакцинальный лейкоцитоз и лимфоцитоз уже на 7-й день после иммунизации. Количество лейкоцитов увеличилось на 42% (Р<0,05), лимфоцитов — на 23% (Р<0,001), сегментоядерных нейтрофилов — на 5% (Р<0,05), при уменьшении палочкоядерных нейтрофилов
— в 3,2 раза (Р<0,001). Выраженный лейкоцитоз и лимфоцитоз отмечались до 14 дня после вакцинации, количество лейкоцитов было увеличено на 80% — 7,75±0,56 тыс/мкл. (Р<0,05) по сравнению с контролем (5,37±0,47 тыс/мкл.). Количество лимфоцитов увеличились на 24,5%
— 70,0±0,14% (Р<0,001), в контроле этот показатель равен 56,2±182%. Через 28 дней после иммунизации содержание лимфоцитов оставалось выше, чем в контроле, на 15% (Р<0,001), а количество лейкоцитов у животных опытной группы сравнялось с контрольной. По результатам исследований можно сделать заключение о высокой иммуногенной активности вакцинного препарата.
Максимально высокий уровень (Р<0,001) количества Т-лимфоцитов наблюдается на 21-й день после иммунизации (65,0±0,91%), что на 12,7% выше по сравнению с контрольной группой (52,3±2,76%). Достоверное увеличение В-лимфоцитов наблюдается во все сроки исследования, но максимальное его значение отмечено на 28 день (50,75±2,56%) при Р<0,001 (увеличение на 27,5%) по сравнению с контролем (23,25±2,65%).
При биохимическом исследовании сыворотки крови у песцов максимальное увеличение показателей было отмечено на 14-й день после иммунизации. Количество общего белка увеличилось на 31%, что составило 8,5±0,27% (Р<0,001), в контроле этот показатель равен 6,46±0,05%, содержание -глобулинов повысилось на 64% (21,0±0,87%) (Р<0,001), в контрольной группе животных этот показатель равен 12,8±0,2%, показатель -глобулинов увеличился на 6%, что составило 17,1±0,16% (Р<0,001), при уменьшении альбуминов — на 13% (Р<0,05). На 21-й день после иммунизации сохраняется увеличение количества общего белка на 16% (Р<0,001), -глобулинов — на 50% (Р<0,001), -глобулинов — на 10% (Р<0,05). К 28-му дню после введения антигена сохраняется увеличение количество общего белка на 31% (Р<0,05), -глобулинов — на 47%, -глобулинов — на 10% (Р<0,05) при уменьшении альбуминов на 15% (Р<0,01).
35 30 25 20
%
15 10 5 0
7 дней 14 дней 21 день 28 дней
♦ опыт —*—контроль
Рис. - Опсоно-фагоцитарная активность нейтрофилов
Опсоно-фагоцитарная активность нейтрофилов увеличилась на 7-й день после иммунизации на 79% по сравнению с контрольной группой зверей и составила 30,0+1,22 (Р<0,001). К 28-му дню показатель фагоцитарной активности снизился до уровня показателя группы не вакцинированных животных (рис.).
Иммуноморфогенез в лимфоидной ткани тонкого отдела кишечника В лимфоидной ткани тонкого отдела кишечника выраженные изменении наблюдались в тощей и подвздошной кишках, было отмечено формирование как одиночных, так и групповых лимфоидных узелков. Лимфоидные узелки тощей и подвздошной кишок встречались округлой или овальной формы. На 14-й день после вакцинации появляются скопления лимфоидных узелков, которые в большинстве с герминативным центром. В них хорошо видно, как лимфоциты из купола лимфоидного узелка мигрируют в толщу эпителия навстречу антигенам, которые находятся в просвете желудочно-кишечного тракта. В тощей и подвздошной кишках было отмечено скопление иммунобластов и плазмобластов как в центре лимфоидных узелков, так и в куполе лимфоидных узелков. В лимфоидных узелках тощей и подвздошной кишках количество иммунобластов увеличилось в 1,9 раза: в тощей кишке — до 23,1+0,31 (Р<0,001) при контроле (12,0+0,21 штук) и плазмобластов 19,1+0,23 (Р<0,001) в контроле (10,1+0,14 шт.), в подвздошной кишке: иммунобластов 21,3+0,23 (Р<0,001) при контроле (11,2+0,21 шт.). В собственной пластинке слизистой оболочки отмечено скопление нейтрофи-лов, клеток с митотическим делением.
На 21-й день после иммунизации в собственной пластинке слизистой оболочки тощей и подвздошной кишок по сравнению с контролем увеличилось количество проплазмоцитов в 2 раза: в тощей — 30,2+0,47 при контроле (14,6+0,24 шт.), в подвздошной 39,2+0,36 (Р<0,001) в контроле (19,0+0,31 шт.). Максимальное увеличение зрелых плазматических клеток отмечено на 28-й день после вакцинации в тощей кишке — в 2,7 раза
34,2+0,31 (Р<0,001) в контроле (12,4+0,27 шт.), в подвздошной — в 2 раза 35,8+0,31 (Р<0,001) по сравнению с контролем (17,4+0,24 шт.). Зрелые плазматические клетки в основном были расположены скоплениями в собственной пластинке слизистой оболочки по 3—4 штуки.
В результате исследований установлено достоверное увеличение в крови количества лейкоцитов, лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов, что указывает на высокую иммуногенность живой вакцины. Иммунизация животных сопровождается достоверным увеличением общего белка, - и -глобулинов. Полученные данные свидетельствуют о том, что пероральное введение вакцины стимулирует клеточные иммунные реакции в виде увеличения розеткообразующих лимфоцитов — Т-лимфоцитов, отвечающих за клеточный иммунитет.
Увеличение количества иммуннобластов и плазмобластов у вакцинированных зверей напрямую связано с увеличением в эти в сроки опсоно-фагоцитарной активности нейтрофилов. Показатель опсоно-фагоцитарной активности нейтрофилов на протяжении всего срока исследований поствакцинального иммунного ответа у иммунизированных животных оставался выше, чем в контрольной группе зверей.
Проведенные исследования указывают на то, что значительная часть антигенов попадает из ротовой полости в кровь и в лимфоидную ткань кишечника, иммунная функция которой обеспечивается многочисленными лимфоидными узелками (какодиночными, таки сгруппированными), вызывая изменения в лимфоидной ткани кишечника в ответ на пероральное введение антигена.
Литература
1. Домский, И.А. Оральная вакцинация пушных зверей против сальмонеллеза / И.А. Домский // Мат. межд. науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию ВНИИОЗ. 28-31.05. Киров, 2002. С. 548-551.
2. Берестов, В.А. Картина крови норок, песцов и лисиц / В.А. Берестов, A.A. Берестова // Вопросы звероводства. Петрозаводск, 1971. T. X. Вып. 4. С. 11—20.
3. Jondall М. Surface markers of human В- and T-lymphocytes. I. A large population of lymphocytes forming nonimmunerosettes with sheep red blood cells / M. Jondall, J. Holm, H.Wogzell // J. Exp. Med., 1972, vol, 136, № 2, p. 207-215.
4. Bianco С Population of lymphocytes bearing a membrane receptor for antigenantibody complex /С.Bianco, R. Prilrick, V. A. Nussenzweig // J. Exp. Med, 1970, Vol, 134, № 4, p. 702-720.
5. Меркулов, Г.А. Курс патологогистологической техники // Г.А. Меркулов. Л.: Медицина, 1969. 326 с.
6. Автандилов, Г.Г. Системное исследование морфологии иммунных и эндокринных органов при инфекционном процессе / Г.Г. Автандилов, B.C. Барсуков // Архив патологии. 1993. № 1. С. 7.
7. Катинас, Г.С. Динамика количественного состава клеток лимфоидного ряда в паракортикальной зоне лимфатических узлов у мышей С57 В // Пространственная и временная организация тканей. Л.: Изд. 1-го Ленинградского мед. ин-та, 1981. С. 47-54.
