CC BY
90
УДК 612.014.576.33
ВЛИЯНИЕ АТОРВАСТАТИНА НА ЛИПИДЫ
СЫВОРОТКИ КРОВИ МЫШЕЙ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЛИПЕМИИ
Виктория Михайловна ЛОГИНОВА1, Федор Васильевич ТУЗИКОВ23, Наталья Александровна ТУЗИКОВА23, Марина Станиславовна ЧЕРКАНОВА1, Елена Евгеньевна ФИЛЮШИНА1, Татьяна Александровна КОРОЛЕНКО1
1НИИ физиологии СО РАМН 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4
Институт катализа СО РАН
630090, г. Новосибирск, пр. Лаврентьева, 5
3ГОУ ВПОНовосибирский государственный университет 630090, г. Новосибирск, ул. Пирогова, 2
Исследовано влияние аторвастатина (75 мг/кг, двукратно) на фракционный и субфракционный состав липо-протеинов сыворотки крови при липемии, вызванной однократным введением неионного детергента тритона WR 1339 (500 мг/кг) самкам мышей ICR. Состав различных фракций и субфракций липопротеинов (ЛП) определяли методом малоуглового рентгеновского рассеяния с использованием дифрактометра фирмы Siemens. Липемия у животных характеризовалась резким повышением содержания общего холестерина и особенно триглицеридов в сыворотке крови спустя 24 ч после введения тритона WR 1339; обнаружено значительное повышение концентрации атерогенных холестерина липопротеинов очень низкой плотности (ХС-ЛПОНП) за счет субфракции ХС-ЛНОНП3-5 и холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛПНП) за счет субфракции холестерина липопротеинов промежуточной плотности (ХС-ЛППП). Гиполипидемическое влияние аторвастатина включало снижение концентрации проатерогенных фракций — ХС-ЛПОНП (за счет субфракций ХС-ЛПОНП1-2, ХС-ЛПОНП3-5), ХС-ЛПНП (за счет субфракции ХС-ЛППП). Одновременно отмечено увеличение концентрации антиатерогенной фракции холестерина липопротеинов высокой плотности (за счет субфракции ХС-ЛПВП3).
Ключевые слова: аторвастатин, тритон WR 1339, липемия, фракции и субфракции липопротеинов, макрофаги печени.
Введение
Развитие и прогрессирование атеросклероза и его осложнений значительно зависят от уровня холестерина (ХС), триглицеридов (ТГ) сыворотки крови, что обусловило целенаправленный поиск и разработку лекарственных препаратов, влияющих на содержание и метаболизм липидов. Среди разных групп медикаментозных средств, обладающих гипо-липидемическим действием, ингибиторы фермента 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы) — статины — оказались самыми эффективными препаратами, стабильно снижающими уровень ХС, а также ТГ крови [1-3].
Первые ингибиторы ГМГ-Ко-А-редуктазы были производными грибков («естественные» статины) — ловастатин («MSD», США), симвастатин («MSD», США), правастатин («BMS», США). Позднее появились синтетические статины (флувастатин, «Novartis Pharma», Швейцария); церивастатин («Bayer», Гер-
мания) и аторвастатин («Pfizer», США), зарегистрированные в России. Возрастающий интерес к ста-тинам объясняется недостаточной изученностью их плейотропных свойств.
Липемия является одним из важнейших факторов риска развития атеросклероза и ряда сердечнососудистых и цереброваскулярных заболеваний [4]. Модель липемии, воспроизводимая у экспериментальных животных при введении тритона WR 1339, используется для изучения механизма развития атеросклероза [5, 6]. Механизм защитного влияния различных доз аторвастатина при гиперлипемии, особенно на состав субфракций липопротеинов сыворотки крови, исследован недостаточно. Остаются неясными соотношения различных субфракций липопро-теинов — липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), ответственных за проатерогенный эффект, и липо-протеинов высокой плотности (ЛПВП) с защитным антиатерогенным эффектом в эксперименте,
Логинова В.М. — аспирант, e-mail: [email protected]
Тузиков Ф.В. — д.б.н., e-mail: [email protected]
Тузикова Н.А. — н.с., e-mail: [email protected]
Черканова М.С. — к.м.н., мл.н.с., e-mail: [email protected]
Филюшина Е.Е. — к.м.н., ст.н.с., e-mail: [email protected]
Короленко Т.А. — д.м.н., проф., e-mail: [email protected]
г ^штш Лг 1
у,- • - ^ Л У
5 Je эдп^"«!' s
И
i>v -tfilii 'МД '""1 чу '•-* j
г нпшш
Рис. 1. Печень мыши, Тритон WR 1339, 500 мг/кг, 24 ч. В просвете печеночного синусоида расположена крупная макрофагальная клетка, цитоплазма которой заполнена большим количеством крупных светлых гранул (Гр.)
Цель работы — оценить влияние аторвастатина на фракционный и субфракционный состав ли-попротеинов (ЛП) сыворотки крови у мышей при развитии липемии, вызываемой с помощью однократного введения животным тритона WR 1339. Материал и методы
Использовали самок мышей ICR (виварий Института цитологии и генетики СО РАМН). Атор-вастатин («Аторис», «КРКА», Словения) вводили внутрижелудочно с помощью зонда в дозе 75 мг/кг двукратно за 24 ч до инъекции тритона. Тритон WR 1339 («Ruger Chemical Co.», США) мыши получали однократно внутрибрюшинно в дозе 500 мг/кг [5].
Забой животных проводили спустя 24 ч после введения детергента. Перед забоем мыши голодали в течение 15 ч без ограничения потребления воды. Сыворотку крови получали после центрифугирования образцов при 3000 g в течение 15 мин при 4 °C с использованием центрифуги Eppendorf 5415 R (Германия), пробы хранили при —70 °С. Концентрацию холестерина липопротеинов (ХС-ЛП), их фракций и субфракций исследовали с помощью коммерческих
наборов («Biokon», Германия). Состав различных фракций и субфракций ЛП определяли методом малоуглового рентгеновского рассеяния с использованием дифрактометра фирмы Siemens (Германия) [7]. Исследование проведено на базе Института катализа СО РАН и Новосибирского государственного университета в соответствии с этическими нормами Хельсинкской декларации (2000 г.).
Статистическую обработку результатов исследования проводили, вычисляя среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего арифметического значения (т) и представляли в виде М ± т. Различия между группами оценивали с помощью критерия Стьюдента, достоверными считались результаты при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
В качестве модели липемии у животных использовали введение тритона WR 1339 (изооктилполиок-сиэтиленфенолформальдегидного полимера) — неионного детергента, обладающего лизосомотропными свойствами. Тритон WR 1339, как и другие детергенты, широко применяется в фармакологии как эмульгатор, наноноситель различных лекарственных препаратов, усиливающий их лечебный эффект.
Механизм развития липемии при введении мышам тритона WR 1339 исследован в ряде работ [6, 8, 9]. Показано, что она связана с подавлением гидролиза ТГ за счет ингибирования липопротеинлипазы; повышение содержания холестерина и ТГ ЛП в сыворотке крови мышей наблюдали через 24 часа после введения тритона WR 1339 [7]. Увеличение синтеза ХС клетками печени обусловлено активацией рецепторов, влияющих на уровень ЛПНП.
Подобно полоксамеру 407, тритон WR 1339 вызывает появление в печени макрофагов, заполненных гранулами, что придает цитоплазме пенистый вид (рис. 1). Известно, что частицы модифицированных ЛПНП предпочтительно захватываются с помощью специфических рецепторов макрофагами, которые трансформируются в пенистые клетки при гиперлипемии [10-12].
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
Рис. 2. Влияние аторвастатина на концентрацию холестерина (^Ш) и триглицеридов ( ) в сыворотке крови мышей при липемии, вызванной введением тритона ЖЯ 1339
Таблица
Влияние аторвастатина на концентрацию фракций и субфракций холестерина липопротеинов (мг/дл) сыворотки крови мышей при липемии, вызванной введением тритона ШЯ 1339
Концентрация фракций и субфракций ХС-ЛП Контроль (ин-тактные) (п = 8) Аторвастатин (п = 8) Тритон WR 1339 (п = 8) Аторвастатин + + тритон WR 1339 (п = 8)
Общий ХС-ЛП 83,0 ± 6,32 103,8 ± 11,00 371,8 ± 52,16** 237,0 ± 17,54**-#
ХС-ЛПОНП 11,9 ± 1,72 4,8 ± 0,73* 237,3 ± 40,97** 169,4 ± 18,03*
ХС-ЛПОНП1-2 0,5 ± 0,12 0,4 ± 0,06 3,5 ± 1,02* 1,4 ± 0,23*
ХС-ЛПОНП3-5 11,3 ± 1,63 4,4 ± 0,68* 296,0 ± 41,66* 148,7 ± 22,71**-##
ХС-ЛПНП 4,4 ± 1,31 3,8 ± 1,16 (п = 6) 38,5 ± 10,58* 4,1 ± 0,89##
ХС-ЛППП 1,8 ± 0,57 1,9 ± 0,48 (п = 7) 24,7 ± 6,01** 1,9 ± 0,82##
ХС-ЛПНП1-3 2,6 ± 0,82 2,5 ± 1,85 4,9 ± 0,96* 2,8 ± 0,45
ХС-ЛПВП 66,9 ± 6,75 96,7 ± 9,74* 72,2 ± 7,85 90,8 ± 6,72*
ХС-ЛПВП2 60,2 ± 5,82 87,6 ± 8,86* (п = 7) 39,8 ± 11,11 45,6 ± 6,32
ХС-ЛПВП3 6,7 ± 1,18 8,6 ± 2,63 36,4 ± 5,19** 45,2 ± 7,75**
Примечание: здесь и на рис. 2 отличие от величины соответствующего показателя контрольной группы достоверно: * — при р < 0,05, ** — при при р < 0,01; отличие от величины соответствующего показателя животных, которым вводили только тритон WR 1339, достоверно: # — при р < 0,05, ## — при р < 0,01.
Липазы млекопитающих включают липопроте-инлипазу, липазу печени и липазу эндотелия [13], изменение их активности может быть связано с развитием липемии. Механизм гиперлипидемии у мышей при остром воздействии тритона WR 1339 включает ингибирование липопротеиновой липазы [14]. Данная модель перспективна для изучения механизма развития липемии у мышей и тестирования гиполипидемических препаратов.
Согласно классификации 0^08 и соавт., ЛП разделяют на четыре основных класса: ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и хил омикроны, или семь субфракций (ЛПВП3, ЛПВП2, ЛПНП, ЛППП, ЛПОНП3-5, ЛПОНЦ_2, хиломикроны) [15]. Значительная часть ХС плазмы крови (около 60—70 % от общего ХС) содержится в основной атерогенной фракции липопротеинов ЛПНП [16]. В настоящее время разработан ряд новых методов для идентификации атероген-ных ЛПНП и их подфракциий без препаративного выделения. В настоящей работе использовался метод малоуглового рентгеновского рассеяния, позволяющий оценить концентрацию ЛПОНП, ЛПНП, ЛПВП и их субфракций: ЛПОНП1-2, ЛПОНП3-5, ЛПНП, ЛППП, ЛПВП2, ЛПВП3 [8]. Его преимуществом является использование меньшего объема биологического материала (сыворотки крови) и высокая скорость обработки результатов, отсутствие необходимости постоянной калибровки при оценке образцов, что позволяет использовать метод для клинических лабораторных исследований.
Липемия у животных характеризовалась резким повышением спустя 24 ч после введения неионного детергента содержания в сыворотки крови общего ХС и особенно ТГ — в 14 раз (рис. 2), что под-
тверждает ранее полученные данные [7]. Отмечено также увеличение (почти в 5 раз) общей концентрации ХС-ЛП (табл.). Наиболее резко, почти в 20 раз, повышалось содержание проатерогенной фракции ХС-ЛПОНП и ее обеих субфракций — ХС-ЛПОНП1-2 (в 7 раз) и ХС-ЛПОНП3-5 (в 25 раз). В 8 раз был увеличен уровень общего ХС-ЛПНП, субфракции ХС-ЛППП - в 12 раз. Концентрация антиатерогенной фракции ХС-ЛПВП оставалась схожей со значением у интактных животных. Обнаружено увеличение содержания ее субфракции ХС-ЛПВП3 в 5 раз (табл.).
Показан гиполипидемический эффект аторвастатина: его введение мышам на фоне тритона WR 1339 приводило к снижению концентраций общего ХС и ТГ в 1,2 и 2,8 раза соответственно (рис. 2), при этом отмечено уменьшение концентрации ХС-ЛП почти в 1,5 раза (табл.). Умеренное снижение концентрации проатерогенного ХС-ЛПОНП (в 1,5 раза) наблюдалось за счет субфракции ХС-ЛПОНП3-5, содержание которой уменьшалось в 2 раза. Выявлено резкое падение уровня атерогенного ХС-ЛПНП (в 9,5 раз), обусловленное снижением в 13 раз концентрации субфракции ХС-ЛППП. Отмечено повышение содержания антиатерогенного ХС-ЛПВП за счет субфракции ХС-ЛПВП3 в 1,2 раза, что свидетельствует о защитном эффекте аторвастатина (табл.).
Аторвастатин, как и другие статины, подавляет синтез ХЛ в печени на стадии мевалоновой кислоты, вследствие обратимого ингибирования ключевого фермента ГМК-КоА-редуктазы и увеличения числа и активности печеночных ЛПНП-рецепторов клеток, что способствует усилению захвата и ката-
болизма ЛПНП [17-20]. Это, в свою очередь, ведет к уменьшению в плазме крови концентрации ХЛ, ТГ, ЛПНП и ЛПОНП. Параллельно повышается уровень антиатерогенных ЛПВП. Важным в использовании статинов является их способность инги-бировать синтез ХЛ на ранних этапах — на стадии синтеза мевалоновой кислоты, что не сопровождается накоплением токсических продуктов. Статины ингибируют активность фермента не полностью. В организме продолжается синтез мевалоната, не нарушается синтез стероидных гормонов.
Заключение
Модель вызываемой тритоном WR 1339 гипер-липемии, характеризующейся значительным увеличением концентрации проатерогенных фракций и субфракций ХС-ЛП, перспективна для изучения роли изменения фракционного и субфракционного состава ЛП в патогенезе атеросклероза и тестирования гиполипидемических препаратов — статинов и фибратов. Полученные на данной модели изменения концентраций ЛП сходны с аналогичными при дислипопротеинемии 2а/2б, 3 типа человека. Показана защитная роль высокой дозы аторвастатина (75 мг/кг) при липемии у мышей, проявляющаяся в выраженном снижении содержания проатерогенных фракций и субфракций ХС-ЛПОНП и ХС-ЛПНП с одновременным умеренным повышением концентрации антиатерогенного ХС-ЛПВП. Защитный эффект аторвастатина связан со снижением уровней проатерогенных субфракций ХС-ЛПОНП1-2 и ХС-ЛПОНП3-5 фракции ХС-ЛПОНП и субракции ХС-ЛППП атерогенной фракции ХС-ЛПНП при более слабом влиянии на субракции ХС-ЛПВП.
Список литературы
1. Грацианский Н.А. Аторвастатин: результаты испытаний при невысоком исходном холестерине липопротеидов низкой плотности // Consilium medicum. 2005. (11). 903-912.
Gratsianskiy N.A. Atorvastatin: results of testing at the basal low LDL-cholesterol level // Consilium medicum. 2005. (11). 903-912.
2. Шевченко О.П., Шевченко А. О. Статины - ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы. М.: Реафарм, 2003. 112 с.
Shevchenko O.P., Shevchenko A. O. Statins - inhibitors of HMG-CoA reductase. М.: Reafarm, 2003. 112 с.
3. Gotto A.M. Jr., Farmer J.A. Drug insight: the role of statins in combination with ezetimide to lower LDL cholesterol // Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. 2006. 3. (12). 664-672.
4. Рагино Ю.И., Чернявский A.M., Волков A.M., Воевода М.И. Факторы и механизмы нестабильности атеросклеротической бляшки. Новосибирск: Наука, 2008. 88 с.
Ragino Yu.I., Chernyavskiy A.M., Volkov A.M., Voevoda M.I. The factors and mechanisms of atherosclerotic plaque instability. Novosibirsk: Nauka, 2008. 88 p.
5. Schneider P., Korolenko T.A., Busch U. A review of drug-induced lysosomal disorders of the liver in man
and laboratory animals // Microsc. Res. Tech. 1997. 36. (4). 253-275.
6. Короленко Т.А., Тузиков Ф.В., Васильева Е.Д. и др. Изменение фракционного состава липопро-теинов сыворотки крови мышей и крыс при липе-мии, вызванной тритоном WR 1339 // Бюл. экспер. биологии и медицины. 2010. 149. (5). 499-502.
Korolenko T.A., Tuzikov F.V., Vasil'eva E.D. et al. Fractional composition of blood serum lipoproteins in mice and rats with Triton WR-1339-induced lipemia // Byul. exp. biol. med. 2010. 149. (5). 567-570.
7. Tuzikov F.V., Tuzikova N.A., Galimov R.V. et al. General model to describe the structure and dynamic balance between different human serum lipoproteins and its practical application // Med. Sci. Monit. 2002. 8 (6). 79-88.
8. Millar J.S., Cromley D.A., McCoy M.G. et al. Determining hepatic triglyceride production in mice: comparison of poloxamer 407 with Triton WR 1339 // J. Lipid Res. 2005. 46. (9). 2023-2028.
9. Dumortier G., Grossiord J.L., Agnely F. et al. A review of poloxamer 407 pharmaceutical and pharmacological characteristics // Pharm. Res. 2006. 23. (12). 2709-2728.
10. Korolenko T.A.,Tuzikov F.V., Tuzikova N.A. et al. Influence of poloxamer 407 on fractional and sub-fractional composition of serum lipoproteins of mice // Health. 2010. 2. (7). 391-399.
11. Qiu G., Hill J.S. Atorvastatin decreases lipopro-tein lipase and endothelial lipase expression in human THP-1 macrophages // J. Lipid. Res. 2007. 48. (10). 2112-2122.
12. Yasuda T. Endothelial lipase is increased by inflammation and promotes LDL uptake in macrophages // J. Atheroscler. Thromb. 2007. 14. (4). 192-201.
13. Brown R.J., Rader D.J. Lipases as modulators of atherosclerosis in murine models // Curr. Drug Targets. 2007. 8. 1307-1319.
14. Dumortier G., Grossiord J.L., Agnely F. et al. A review of poloxamer 407 pharmaceutical and pharmacological characteristics // Pharm. Res. 2006. 23. (12).2709-2728.
15. Otvos J.D. Measurement of lipoprotein subclass profiles by nuclear magnetic resonance spectroscopy // Clin. Lab. 2002. 48. (3-4).171-180.
16. Anderson L. Candidate-based proteomics in the search for biomarkers of cardiovascular disease // J. Physiol. 2005. 563. (1). 23-60.
17. Assmann G., Nofer J.R. Atheroprotective effects of high-density lipoproteins // Annu. Rev. Med. 2003. 54. 321-341.
18. Visser M., Jakulj L., Kastelein J. LDL-C-low-ering therapy: current and future therapeutic targets // Curr. Cardiol. Rep. 2008. 10. (6). 512-520.
19. Corsini A., Bellosta S., Baetta R. New insights into the pharmacodynamic andpharmacokinetic properties of statins // Pharmacol. Ther. 1999. 84. 413-428.
20. Schachter M. Chemical, pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of statins: an update // Fundam. Clin. Pharmacol. 2004. 19. 117-125.
INFLUENCE OF ATORVASTATIN ON SERUM LIPIDS ON MICE WITH LIPEMIA
Viktoriya Mikhailovna LOGINOVA1, Fedor Vasil'evich TUZIKOV23, Natalya Aleksandrovna TUZIKOVA23, Marina Stanislavovna CHERKANOVA1, Yelena Yevgenyevna FILYSHINA1, Tatyana Aleksandrovna KOROLENKO1
1Institute of Physiology SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov st., 4
2Institute of Catalysis SB RAS 630090, Novosibirsk, Lavrent'ev av., 5
3Novosibirsk State University 630090, Novosibirsk, Pirogov st., 2
Atorvastatin (75 mg/kg) was administered twice in ICR mice with acute lipemia induced with a single injection of Triton WR 1339 (500 mg/kg). A novel small-angle X-ray scattering (SAXS) method for the determination of fractional and subfractional composition of C-LP and was used. In Triton WR 1339-treated animals, there was a drastic increase of atherogenic low-density C-LP (C-LDL) fraction, intermediate density lipoprotein-cholesterol (C-IDL) subfraction, and very low-density C-LP (C-VLDL) fractions (C-VLDL3-5 subfraction), with an increase of the C-HDL3 subfraction. Atorvastatin treatment of lipemia was followed a decrease in the total C and, especially, a decrease in the TG concentration, by normalization of atherogenic C-LDL fraction, C-IDL subfraction, and a decrease of C-VLDL (C-VLDL3-5 subfraction).
Key words: atorvastatin, triton WR 1339, lipemia, lipoprotein fractions and subfractions, liver macrophages.
Loginova V.M. — post-graduate student, e-mail: [email protected] Tuzikov F.V. — doctor of biological sciences, e-mail: [email protected] Tuzikova N.A. — researcher, e-mail: [email protected]
Cherkanova M.S. — candidate of medical sciences, junior researcher, e-mail: [email protected] Filyshina Ye.Ye. — candidate of medical sciences, senior researcher, e-mail: [email protected] Korolenko T.A. — doctor of medical sciences, professor, e-mail: [email protected]
