CC BY
49
ВЛИЯНИЕ АРАБИНОГАЛАКТАНА И ПЕКТИНА ИЗ КАЛЛУСА СМОЛЕВКИ ОБЫКНОВЕННОЙ SILENE VULGARIS НА КАЛИЕВЫЕ КАНАЛЫ НЕЙРОНАЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ
*А.И. Вислобоков, В.И. Прошева, Е.А. Гюнтер, *К.Н.Мельников Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, г. Сыктывкар, Россия, 167982 Сыктывкар, ул.
Первомайская, 50. E-mail:V.Prosheva@physiol.komisc.ru *Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И.П.
Павлова, г. Санкт-Петербург, Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, 6/8.
В работе для изучения мембранотропного действия арабиногалактана и пектина из каллусной культуры смолевки обыкновенной Silene vulgaris (M.) G., использовали метод фиксации потенциала на изолированных нейронах моллюска Lymnaea stagnalis. Установлено, что изученные растительные полисахариды в концентрациях 0.1-10.0 мкг/мл слабо дозозависимо и обратимо активируют выходящие калиевые токи, увеличивая их амплитуду на 4-8%, а также снижают неспецифические токи утечки мембраны. Кинетика развития токов под влиянием полисахаридов не изменяется.
Пектиновые вещества, представляющие собой пектиновые полисахариды и сопутствующие им галактаны, арабинаны и арабиногалактаны, входят в состав стенки любой растительной клетки и являются существенным компонентом пищи животных и человека. Арабиногалактаны содержатся в растениях и в свободном состоянии, например, в лиственнице. В составе пектиновых полисахаридов арабиногалактаны присутствуют в виде боковых цепей разветвленной области [3].
Нами из каллусной культуры смолевки обыкновенной Silene vulgaris выделены и охарактеризованы кислый арабиногалактан (AG) и пектин, названный силенаном (SVC) [6]. Так, AG содержит остатки галактозы (41,4 %), арабинозы (10,0 %) и D-галактуроновой кислоты (13,7 %), а в состав углеводной цепи SVC входят остатки D-галактуроновой кислоты (80,0 %), арабинозы (2,4 %), галактозы (2,9 %) и рамнозы (1,4 %). Нами показано, что AG является промежуточным продуктом биосинтеза силенана каллусной культуры[6-7].
Целью данной работы было сравнительное изучение влияния двух полисахаридов, выделенных из каллуса смолёвки обыкновенной, на калиевые каналы мембраны изолированных нейронов моллюска Lymnaea stagnalis.
Каллусные культуры смолевки обыкновенной Silene vulgaris (M.) G., (Oberna behen (L.) I.) выращивали на агаризованной модифицированной среде [8] с добавлением ауксина 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (1.0 мг/л) и цитокинина 6-бензиламинопурина (0,5 мг/л). Каллус субкультивировали с интервалом в 21 сутки при 26±1° С в темноте. Выделение полисахаридов AG и SVC из каллуса проводили как было описано ранее [6-7].
Эксперименты проводили на изолированных нейронах брюхоногого моллюска прудовика обыкновенного (Lymnaea stagnalis) при комнатной температуре (20-22° С). Из тела животного вырезали окологлоточное кольцо нервных ганглиев, которое для получения изолированных нейронов подвергали ферментативной обработке, поместив в 0,25 % раствор трипсина на
физиологическом растворе для прудовиков в течение 40-60 минут. Использовали методику внутриклеточного диализа и фиксации мембранного потенциала на целой клетке, помещенной на полиэтиленовую пипетку [2]. Регистрировали выходящие калиевые медленные и быстрые трансмембранные ионные токи. Неспецифические токи мембраны (токи утечки) из регистрируемых ионных токов вычитали автоматически (компенсировали). Подробнее методика описана ранее [1].
Полисахариды предварительно растворяли в дистиллированной воде (1 мг в 10 мл), а затем последовательно разбавляли в 10 раз в наружных (перфузирующих) физиологических растворах и получали в концентрациях: 0.1; 1.0 и 10.0 мкг/мл. Оценку изменений амплитуды и кинетики калиевых токов при действии
полисахаридов проводили как визуально с экрана осциллографа и монитора, так и из записей компьютера с помощью специальных программ и графического редактора “Excel”. Исходные величины амплитуды ионных токов принимали за 100 %, а установившиеся при действии полисахаридов выражали в процентах от них. Полученные результаты обрабатывали с помощью программы “Statistica 5,0”, различия между средними значениями (n = 5-6) определяли с помощью ¿-критерия Стьюдента.
Полисахариды AG и SVC в диапазоне концентраций от 0.1 до 10.0 мкг/мл, добавленные во внеклеточный физиологический раствор, т.е. при внеклеточном действии, достоверно увеличивали амплитуду медленного калиевого ионного тока на 4-8 % (p<0.05) слабо дозозависимым способом. Эти эффекты развивались быстро и стабилизировались через 2-3 мин. Кинетика развития тока под влиянием изученных полисахаридов практически не изменялась. После отмывания в контрольном физиологическом растворе в течение 7-10 мин K-ток восстанавливался до исходных значений. Характер активирующего влияния полисахаридов AG и SVC на быстрый калиевый ток был схож с влиянием на медленный ток, т.е. также наблюдалось незначительное обратимое увеличение амплитуды быстрого тока без изменений его кинетики.
Неспецифические токи утечки мембраны при действии полисахаридов изменялись двухфазно: в первые 1-2 мин они незначительно увеличивались, а при дальнейшем действии - снижались, что в общем указывает на увеличение стабильности мембраны нервной клетки.
Итак, в данной работе впервые показано, что арабиногалактан и силенан из каллуса смолевки обыкновенной в концентрациях 0.1-10.0 мкг/мл слабо дозозависимо и обратимо увеличивают трансмембранные калиевые ионные токи потенциалуправляемых каналов нейронов, т.е. оказывают активирующее действие. Обратимость электрофизиологических эффектов изученных растительных полисахаридов свидетельствует о непрочном их связывании со структурными элементами мембраны.
Общеизвестно, что в клетке при активации калиевых каналов наблюдается гиперполяризация мембраны, что приводит к повышению порога возбудимости и расширению спектра ее функциональной активности. В наших экспериментах под влиянием изученных полисахаридов наблюдалось начальное незначительное увеличение (возможно, в результате накопления полисахаридов на мембране) и последующее уменьшение неспецифических токов утечки мембраны, что указывает на их мембраностабилизирующее действие, улучшающее функциональное состояние нервной клетки . Следует отметить, что хотя вязкость пектинового полисахарида SVC выше, чем у арабиногалактана [5], но оба они вызвали в наших опытах сходные мембранотропные эффекты.
Ранее нами показано [1], что танацетан, пектиновый полисахарид, выделенный из пижмы, так же, как изученные в данной работе силенан и арабиногалактан, выделенные из каллуса смолевки, слабо дозозависимо и обратимо активировал выходящие калиевые токи мембраны нейронов моллюска и уменьшал неспецифические токи утечки.
Известно, что физиологический эффект фармакологических веществ на мембрану клетки определяется структурой их молекул, физико-химическими свойствами, а также особенностями рецепторных структур мембраны при их взаимодействии (известная связь “структура - активность”). Имеющиеся в литературе данные указывают на то, что важным фактором проявления физиологической активности пектинов является наличие общего структурного элемента в их боковых цепях - арабиногалактана [3]. Как было показано ранее[5, 9], силенан и танацетан по своей структуре близки друг к другу: оба они относятся
к группе рамногалактуронана I и имеют в качестве боковых цепей разветвленной области фрагмент арабиногалактана. Можно достаточно обоснованно предположить, что, возможно, именно с арабиногалактаном и с этим фрагментом в пектиновых полисахаридах: силенане и танацетане, - связаны и обнаруженные нами электрофизиологические эффекты на мембрану нейрона.
Как известно, ионные механизмы электрогенеза и фармакологические свойства нейронов моллюсков и млекопитающих принципиально близки друг другу [4], поэтому полученные в данной работе результаты в определенной степени можно экстраполировать на теплокровных животных и человека.
Таким образом, арабиногалактан и силенан из каллусной культуры смолевки обыкновенной, активируя калиевые токи нейронов и снижая неспецифические токи утечки мембраны, обладают нейротропным и мембраностабилизирующим действием.
Работа выполнена при частичной поддержке гранта № НШ-1260.2003.4. Авторы благодарны академику Ю.С.Оводову и к.х.н. О.А.Бушневой за критическое обсуждение работы.
1. Вислобоков А.И., Прошева В.И., Полле А.Я. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2004. - Т. 138, № 10. - C. 439-441.
2. Костюк П.Г., Крышталь О.А. Механизмы электрической возбудимости нервной клетки. - М., Наука, 1981. - 204 с.
З.Оводов Ю.С. // Биоорган. химия. - 1998. - Т. 24, № 7. - С. 483-501.
4. Солнцева Е.И., Буканова Ю.В. // Биологические мембраны. - 2003. - Т. 20, № 4. - С.307- 313.
5.Bushneva O.A., Ovodova R.G., Shashkov A.S. et al. // Carbohydr. Polym. - 2002. - V. 49. - P. 471-478.
6.Gunter E.A., Ovodov Yu.S. // Phytochemistry. - 2002. - V. 59. - P. 703-708.
7. Gunter E.A., Ovodov Yu.S // J. Biotechnology. - 2005. - V. 117. - P. 385-393.
8. Murashige T., Skoog S. // Physiol. Plant. - 1962. - V. 15. - P. 473-479.
9. Polle A.Ya., Ovodova R.G., Shashkov A.S. et al. // Carbohydr. Polymers. - 2002. - V. 49. - P. 337-344.
THE INFLUENCE OF ARABINOGALACTAN AND PECTIN FROM THE CALLUS OF CAMPION Oberna behen (L.)I ON POTASSIUM CHANNELS OF NEURONAL MEMBRANE
*A.I. Vislobokov, V.I. Prosheva, E.A. Gunter, *K.N. Melnikov,
Institute of Physiology, Komi Sci.Center, Urals Branch of the Russian Academy of Sciences, 50 Pervomayskaya Street., Syktyvkar, 167982, Russian Federation. E-mail:V.Prosheva@physiol.komisc.ru *The Saint-Petersburg State Medical University of I.P.Pavlov, 6/8, L.Tolstogo street, Saint-Petersburg,
197022, Russian Federation
We have investigated the membranetropic effects of arabinogalactan and pectin from the callus of campion Oberna behen (L.)I in isolated neurons of the snail Lymnaea stagnalis using voltage-clamp technique. The studied polysaccharides (applied from outside in 0.1-10.0 |ag/ml range concentration) was shown to activate outward potassium ionic currents (they increase currents amplitude by 4-8 % in a weakly concentration-dependent manner and reversibly) and reduce nonspecific membrane leakage currents. The kinetics of currents under the influence of polysaccharides was not changed.
