CC BY
50
original article
ЦИТОКИНЫ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 612.112.95.084
Черных Е.Р., Сахно Л.В., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Хонина Н.А., Останин А.А.
ВЛИЯНИЕ АПОПТОТИЧЕСКИХ НЕЙТРОФИЛОВ НА ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ И ПРОСТАГЛАНДИНА Е2 М1 МАКРОФАГАМИ ЧЕЛОВЕКА
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии», 630099, Новосибирск, Россия
Согласно данным литературы, поглощение апоптотических клеток моноцитами и непримированными (наивными) макрофагами сопровождается снижением продукции провоспалительных цитокинов и усилением продукции противовоспалительных медиаторов, что свидетельствует об индукции М2 фенотипа. В настоящей работе исследовано влияние апоптотических клеток на М1 макрофаги человека, генерируемые в присутствии GM-CSF. Показано, что после преинкубации с апоптотическими нейтрофилами М1 макрофаги существенно теряют способность стимулировать пролиферацию аллогенных Т-клеток, что свидетельствует о трансформации их свойств в сторону М2 фенотипа. Мультиплексный анализ 27 цитокинов методом проточной флуориметрии показал ингибирующее действие апоптотических клеток на продукцию как про- (TNF-a, IL-6, IL-1P), так и противовоспалительных (IL-10, IL1-ra) цитокинов, а также секрецию иммунорегуляторных цитокинов (IL-2, IFN-y, IL-12, IL-4, IL-9, IL-13, IL-15, IL-17), ростовых факторов (G-CSF, GM-CSF, IL-7, FGF-basic, PDGF, VEGF) и хемокинов (IL-8, IP-10, MCP-1, Rantes, Eotaxin). В отличие от однонаправленного супрессивного действия на продукцию большинства цитокинов, апоптотические нейтрофилы оказывают разнонаправленный эффект на синтез PGE2, в половине случаев усиливая (подгруппа 1, n = 7), а в половине — ингибируя (подгруппа 2, n = 6) его продукцию. При этом более сильный супрессорный эффект апоптотических клеток на продукцию IL-6, IL-17, FGF-basic и VEGF регистрируют в подгруппе 2, которая характеризуется более высоким уровнем PGE2 в культурах интактных макрофагов и его выраженным снижением после контакта с апоптотическими клетками. Полученные результаты свидетельствуют о том, что М1 макрофаги подвержены регуляторному влиянию апоптотических нейтрофилов, которые оказывают однонаправленный супрессорный эффект на продукцию широкого спектра цитокинов, включая противовоспалительные цитокины, ростовые факторы и хемокины, однако обладают разнонаправленным действием на синтез PGE2.
Ключевые слова: макрофаги человека; апоптотические нейтрофилы; эффероцитоз; М1/М2 поляризация; цитокины; хемокины; ростовые факторы; PGE2
Для цитирования: Черных Е.Р., Сахно Л.В., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Хонина Н.А., Останин А.А. Влияние апоптотических нейтрофилов на продукцию цитокинов и простагландина Е М1 макрофагами человека. Иммунология. 2017; 38(4): 193-198. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-4-193-198
Chernykh E.R., Sakhno L.V., Shevela E.Y., Tikhonova M.A., Khonina N.A., Ostanin A.A.
THE INFLUENCE OF APOPTOTIC NEUTROPHILS ON PRODUCTION OF CYTOKINES AND PROSTAGLANDIN E2 BY HUMAN M1 MACROPHAGES
Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology, 630099, Novosibirsk, Russian Federation Engulfment of apoptotic cells by monocytes and unprimed (naive) macrophages is known to down-regulate pro-inflammatory and up-regulate anti-inflammatory cytokines evidencing M2 polarization. In the current study, we investigated whether apoptotic cells influence human M1 macrophages generated in the presence of GM-CSF. The data obtained demonstrate that following pre-incubation with apoptotic neutrophils M1 macrophages significantly decrease their capacity to stimulate proliferation of allergenic T-cells thus adopting M2 features. The multi-plex analysis of 27 cytokines using fluorescent bead-based assay demonstrated a inhibitory effect of apoptotic cells on production of both pro- (TNF-a, IL-6, IL-1P) and antiinflammatory (IL-10, IL1-ra) cytokines, as well as a secretion of immunoregulatory cytokines (IL-2, IFN-y, IL-12, IL-4, IL-9, IL-13, IL-15, IL-17), growth factors (G-CSF, GM-CSF, IL-7, FGF-basic, PDGF, VEGF), and chemokines (IL-8, IP-10, MCP-1, Rantes, Eotaxin). While suppressing most cytokines, apoptotic neutrophils have a bidirectional effect on the synthesis of PGE2, enhancing its production in 7 cases (subgroup 1), and suppressing PGE2 production in 6 cases (subgroup 2). The stronger suppressor effect of apoptotic cells on production of IL-6, IL-17, FGF-basic, and VEGF is detected in subgroup 2, which is characterized by a higher level of PGE2 in intact macrophages and its pronounced decrease after contact with apoptotic cells. These results show that M1 macrophages are influenced by apoptotic neutrophils that exert a unidirectional suppressor effect on the production of various cytokines, including anti-inflammatory cytokines, growth factors and chemokines, but have a bidirectional effect on the synthesis of PGE2.
Keywords: human macrophages; apoptotic neutrophils; efferocytosis; M1/M2 polarization; cytokines; chemokines; growth factors; PGE2.
For citation: Chernykh E.R., Sakhno L.V., Shevela E.Y., Tikhonova M.A., Khonina N.A., Ostanin A.A. The influence of apoptotic neutrophils on production of cytokines and prostaglandin E by human M1 macrophages. Immunologiya. 2017; 38(4): 193-198. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-4-193-198
Для корреспонденции: Останин Александр Анатольевич, д-р мед. наук, проф., главный научный сотрудник лаборатории клеточной иммунотерапии НИИ фундаментальной и клинической иммунологии, E-mail: ostanin62@mail.ru
оригинальные статьи
For correspondence: Alexandr A. Ostanin, Dr. Sci. Med., professor, main researcher, laboratory of cellular immunotherapy,
Institute of Fundamental and Clinical Immunology, E-mail: ostanin62@mail.ru
Information about authors:
Chernykh E.R. http://orcid.org/0000-0003-2346-6279
SakhnoL.V. http://orcid.org/0000-0003-3290-7910
ShevelaE.Y. http://orcid.org/0000-0001-8997-3586
TikhonovaM.A. http://orcid.org/0000-0002-2366-1667
Ostanin A.A. http://orcid.org/0000-0001-6895-938X
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The study had no sponsorship.
Received 23.03.17 Accepted 14.04.17
введение
Макрофаги (Мф) представляют гетерогенную популяцию клеток, которые в зависимости от условий активации и функций условно разделяют на «классические» (М1) и «альтернативные» (М2) макрофаги, обладающие соответственно про-и противовоспалительными свойствами [1]. Поляризация моноцитов/макрофагов в М2 клетки индуцируется различными факторами (ГЬ-4, ГЬ-13, ГЬ-10, иммунными комплексами, глюкокортикоидами и др.), среди которых важная роль отводится фагоцитозу апоптотических клеток (эффероцито-зу) [2—4]. Так, еще в конце 90-х годов было показано, что поглощение моноцитами/макрофагами апоптотических клеток приводит к выраженному угнетению продукции провоспали-тельных цитокинов (ТМР-а, GM-CSF, ГЬ-ф, ГЬ-8) и усилению секреции противовоспалительных медиаторов — TGР-pl, ГЬ-10, простагландина Е2 (PGE2) [5—7], что свидетельствует об индукции М2 фенотипа. Подавление провоспалительных цитокинов первоначально объяснялось прямым и/или опосредованным действием противовоспалительных медиаторов [5, 8, 9]. Позже выяснилось, что снижение транскрипции генов ТМР-а и ГЬ-6 наблюдается в ранние сроки и не зависит от продукции растворимых супрессорных факторов [10, 11]. При этом важную роль в угнетении экспрессии МР-кБ/ТМР-а и усилении продукции ГЬ-10 может играть miRNA21, количество которой значительно возрастает при эффероцитозе [12].
Несмотря на интерес к иммуномодулирующему эффекту эффероцитоза, работы в данном направлении немногочисленны и ограничены изучением относительно узкого спектра цитокинов. Основная часть исследований проведена с использованием неполяризованных макрофагов. Поэтому вопрос о роли апоптотических клеток в репрограммировании М1 макрофагов, обладающих более низкой способностью к фагоцитозу апоптотических клеток [13], остается практически неисследованным. Весьма противоречивые данные получены также в отношении влияния эффероцитоза на продукцию ГЬ-10 [5, 7, 11, 14], который позиционируется в качестве «универсального» функционального маркера М2 клеток [2, 3]. Кроме того, серьезным ограничением проведенных исследований является оценка цитокинов в культурах макрофагов, содержащих апоптотические клетки, поскольку сами апопто-тические клетки могут быть продуцентами цитокинов [15].
Цель настоящей работы — исследование влияния апоптотических нейтрофилов на продукцию цитокинов и PGE2 поляризованными М1 макрофагами с привлечением метода мультиплексного анализа и оценкой цитокинов/Т^Е2 в культурах макрофагов, не содержащих апоптотические клетки, т. е. после краткосрочной преинкубации и последующего удаления апоптотических нейтрофилов.
Материал и методы
В исследование были включены здоровые доноры крови (п = 28) в возрасте от 23 до 38 лет. Макрофаги М1 типа генерировали из мононуклеарных клеток (МНК) периферической
крови, выделенных стандартно методом градиентного центрифугирования. МНК (3Ч06/мл) инкубировали в течение 60 мин в 6-луночных планшетах (TPP, Швейцария), после чего неприлипающие клетки удаляли, а прилипающие к пластику клетки культивировали 7 сут в среде RPMI-1640, дополненной 0,05 mM 2-меркаптоэтанола, 2 mM пирувата натрия, 0,3 mg/ml L-глютамина (все реактивы Sigma-Aldrich), 1% раствора незаменимых аминокислот, 100 ^g/ml гентамицина, 5% аутоплазмы и 2% фетальной телячьей сыворотки (FBS, Биолот, Россия), в присутствии рекомбинантного GM-CSF человека (rhGM-CSF, 50 нг/мл, R&D Systems).
Нейтрофилы выделяли центрифугированием клеток лейковзвеси в ступенчатом градиенте плотности фиколла/ урографина (d-1,119; d-1,078). Содержание CD66b+ клеток в выделенной популяции составляло 90% (IQR 73—95%). Полученные нейтрофилы (3Ч06/мл) метили карбоксифлуорес-цеин сукцинимидил эфиром (carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE, 4 мкМ, Sigma) в течение 15 мин, затем отмывали, ресуспендировали в RPMI-1640 с 10% FBS и инкубировали в течение 24 ч при 37°C и 5% CO2. Уровень спонтанного апоптоза нейтрофилов определяли методом проточной ци-тометрии (FACS Calibur, Becton Dickinson, США) по окрашиванию клеток аннексином V и пропидиумом иодидом (PI) (Apoptosis Detection Kit, Becton Dickinson, США). Содержание AnnexinV+Pr клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза, составляло 61% (IQR 40—66%), что согласуется с данными других авторов [16]. Количество AnnexinV+PI+ клеток на поздних стадиях апоптоза, а также некротических AnnexinV-PI+ нейтрофилов составляло 12% (IQR 4—13%) и 1% (IQR 0,5—1,3%) соответственно. В дальнейшем данную популяцию нейтрофилов использовали как источник апопто-тических клеток.
Для оценки фагоцитоза к монослою генерированных М1 макрофагов добавляли CFSE-меченные нейтрофилы, подвергшиеся спонтанному апоптозу, в количестве 1—2Ч06/мл (из расчета ~ 10 нейтрофилов на макрофаг) и инкубировали в течение 60 мин при 37°C и 5% CO2. Затем культураль-ную среду удаляли, клетки двукратно отмывали холодным фосфат-забуференным физиологическим раствором, после чего Мф отделяли от пластика с помощью раствора трипсина-ЭДТА. Методом двуцветной проточной цитофлюориметрии (FACSCalibur) оценивали количество CFSE+ макрофагов в гейте CD14-позитивных клеток. Относительное содержание CFSE+CD14+ М1 макрофагов, поглотивших апоптотические нейтрофилы, составляло 15% (IQR 12—21%).
Для оценки продукции цитокинов к монослою генерированных М1 макрофагов добавляли апоптотические нейтро-филы (как описано ранее) или среду в качестве контроля и инкубировали в течение 60 мин. Затем нейтрофилы мягко убирали, лунки однократно промывали средой и далее макрофаги дополнительно культивировали в течение 24 ч в RPMI-1640 с 5% FBS. Культуральные супернатанты собирали и хранили при -80°C.
Концентрацию 27 цитокинов оценивали методом про-
original article
Таблица 1
Продукция цитокинов в культурах М1 макрофагов, интактных (М1) и преинкуби-рованных с апоптотическими нейтрофилами (М1-нф)
Группы цитокинов М1 (n = 18) М1-нф (n = 18) % супрессии
Противо- IL-1ß 49 (37— 129) 19 (8-39)** 66 (22-86)
воспалительные TNF-a 358 (206- 8890) 187(121—4205)** 46 (3-54)
IL-6 7715 (5878- 38733) 904 (366-20408)** 90 (50-95)
IL1-ra 333 (109- -1175) 103 (22-586)** 65 (36-83)
IL-10 35 (19- 80) 21 (8-36)** 51 (25-63)
Иммуно- IL-2 21(12- 58) 11 (3-29)** 52 (40-78)
регуля-торные IFN-Y 218 (74— 1261) 45 (15-692)** 75 (50-83)
IL-12p70 14 (11- 20) 10 (10-16)* 8 (0-29)
IL-4 7,3 (3,7- -22) 3,4 (1,4-12)** 51 (33-69)
IL-5 6,3 (5,3- 6,6) 6,1 (5,3-6,3) 0 (0-8)
IL-9 34 (25— 54) 18 (9—44)** 36 (12-56)
IL-13 26 (23— 35) 21 (19-23)* 24 (19-31)
IL-15 73 (53— 86) 38 (20-57)** 41 (19-65)
IL-17 227 (144- 424) 127 (83-321)** 40 (30-62)
Ростовые G-CSF 221 (80- 707) 32 (12-1264)** 75 (39-90)
факторы GM-CSF 643 (375— 883) 15 (3-123)** 97 (85-99)
IL-7 14 (11- 14) 6 (4,4-11)** 52 (0-68)
FGF-b 28 (9— 77) 4 (4-46)** 45 (25-85)
PDGF 212 (99- 314) 90 (45-159)** 52 (43-55)
VEGF 132 (69- 279) 69 (18-187)** 51 (33-71)
CXC- и СС- хемокины IL-8 IP-10 20140 (18030-24700) 14213(4553—48110) 16950 (13130-23050)* 3590 (425-16020)** 21 (0-40) 72 (57-87)
MCP-1 8916 (7468- 10327) 5310 (2710-7900)** 40 (21-67)
MIP-1a 322 (123- 2204) 175 (129-1945) 36 (2-54)
MIP-1ß 6978 (4640- 14746) 4210 (2660-14750) 11 (2—45)
Rantes 269 (166- -1641) 135 (74-1080)** 57 (47-71)
Eotaxin 68 (33- 208) 19 (6-169)** 62 (33-82)
Примечание. Данные представлены в виде медианных значений и интерквартиль-ного диапазона (в скобках).; * — p < 0,05; ** — p < 0,01 (^-критерий Вилкоксона для связанных выборок).
точной флуориметрии на 2-лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Процент супрессии рассчитывали по формуле: % = (1 - X/Y)400%, где X — концентрация цитокина в супернатантах М1 клеток после преинкубации с апоптотическими нейтрофилами, а Y — концентрация цитокина в супернатантах интактных М1 макрофагов.
Содержание PGE2 в культуральных супернатантах определяли методом иммуноферментного анализа (R&D Systems). Индекс влияния апоптотических клеток на продукцию PGE2 рассчитывали как соотношение уровня PGE2 в культурах М1 клеток после преинкубации с апоптотическими нейтрофила-ми к уровню PGE2 в культурах интактных М1 макрофагов.
Аллостимуляторную активность Мф оценивали в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) при культивировании Мф с аллогенными МНК доноров (0,Ь106/лунку) в соотношении 1:10. Интенсивность пролиферации определяли на 5-е сутки радиометрически по включению 3Н-тимидина. Индекс стимуляции Мф (ИС) в СКЛ рассчитывали как отношение
пролиферативного ответа МНК в присутствии Мф к уровню спонтанной пролиферации МНК.
Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета прикладных программ Statistica 6.0 для Windows. Данные представлены в виде медианных значений и интерквартильного диапазона (IQR, 25—75% квартили). Для оценки статистической значимости различий сравниваемых выборок использовали непараметрические критерии: Вилкоксона (для связанных, парных выборок) и Манна—Уитни (для несвязанных выборок). Различия считали значимыми при уровне p < 0,05.
результаты
Ранее нами было показано, что характерной особенностью М2 макрофагов, генерируемых в присутствии М-CSF или в условиях дефицита ростовых факторов, является низкая аллостимуляторная активность в СКЛ [17—19]. Поэтому, чтобы убедиться, что часовая преинкубация М1 клеток с апоптотическими нейтрофилами вызывает М2 переключение, первоначально исследовали способность интактных М1 клеток и макрофагов, преинкубиро-ванных с апоптотическими нейтрофилами (М1-нф), стимулировать пролиферацию Т-клеток в алло-СКЛ. Пролиферативный ответ Т-лимфоцитов, индуцированный М1-нф, был значимо ниже, чем при стимуляции интактными М1 клетками — 1340 (IQR 1040—1800) vs 2600 (1430—4430) имп/мин (pW < 0,05; n = 10). Аналогичным образом, ИСМ1 , был в 2 раза ниже по сравнению с ИсМф — 4,6 (2,7—9,9) vs 9,9 (8,1—14,3) расч. ед. (pW < 0,05; n = 10). Таким образом, судя по снижению аллостимуляторной активности, кратковременная преинкубация М1 клеток с апоптотическими нейтрофила-ми индуцировала М2 переключение.
Мультиплексный анализ 24-часовых супернатантов М1 макрофагов выявил значимое снижение продукции большинства исследуемых цитокинов после преинку-бации с апоптотическими нейтрофилами (табл. 1), при этом ингибировалась продукция как про- (IL-1Р, TNF-a, IL-6), так и противовоспалительных цитокинов (IL1-ra, IL-10). Преинкубация с апоптотическими клетками сопровождалась также снижением секреции иммунорегуля-торных цитокинов с различной направленностью действия (IL-2, IFN-y, IL-4, IL-9, IL-13, IL-15, IL-17), ростовых факторов (G-CSF, GM-CSF, IL-7, FGF-b, PDGF, VEGF) и хемоки-нов (IL-8, IP-10, MCP-1, Rantes, Eotaxin). Поскольку выход клеток в культурах М1 и М1-нф составлял соответственно 2,7Ч04 (1,5—5,7Ч04) и 2,4Ч04 (1,8—5,7Ч04) на Ь106 МНК и значимо не различался (pW = 0,4), выявленное снижение цитокин-секреторной функции Мф не было связано с гибелью клеток или уменьшением их количества вследствие возможного «открепления» от пластика после эффероцитоза и удаления в процессе отмывки.
Несмотря на снижение секреции большинства цитокинов, выраженность супрессорного эффекта апоптотических клеток существенно варьировала. Так, продукция про- и противовоспалительных цитокинов (на уровне медианных значений) ингибировалась на 46—90% с максимальным ингибирующим эффектом в отношении IL-6. При этом продукция TNF-a и
оригинальные статьи
В цепом по группе Подгруппа 1 Подгруппа 2 (п=13) (л=7) (п=6)
Разнонаправленный эффект апоптотических нейтрофилов на синтез М1 макрофагами PGE2.
Данные представлены в виде медианных значений и интерквартильного диапазона (в скобках). Концентрацию РОЕ2 (пг/мл) определяли в культу-ральных супернатантах интактных М1 макрофагов (М1) и преинкубиро-ванных с апоптотическими нейтрофилами (М1-нф).
IL-10 снижалась в равной степени. Подавление иммунорегу-ляторных цитокинов было наибольшим в отношении 1КЫ-у (75%), выраженным — в отношении ГЬ-2, IL-4, IL-17, ГЬ-15 (41-52%) и слабовыраженным — относительно продукции ГЬ-13 и IL-9 (24 и 36% соответственно). Супрессия ростовых факторов достигала 97% для GM-CSF, 75% для G-CSF и была менее выраженной для ГЬ-7, FGF-b, PDGF и VEGF (45—52%). В результате краткосрочного контакта М1 макрофагов с апоптотическими нейтрофилами ингибировалась продукция хемо-кинов: 1Р-10, Eotaxin и Rantes — на 57—72%, МСР-1 — на 40%, М1Р-1а — на 36% (р№ = 0,1), IL-8 — на 21%.
Поскольку ингибиция провоспалительных цитокинов при эффероцитозе опосредуется с участием эйкозаноидов [5, 9], мы также исследовали продукцию PGE2. В целом по группе 13 доноров концентрация PGE2 в супернатантах интактных
М1 клеток и макрофагов, преинкубированных с апоптотиче-скими нейтрофилами, значимо не различалась (см. рисунок). Однако индивидуальный анализ выявил 2 типа реагирования макрофагов на контакт с апоптотическими клетками. В 7 случаях апоптотические клетки статистически достоверно усиливали (подгруппа 1), тогда как в 6 — подавляли (подгруппа 2) продукцию PGE2. Индекс влияния апоптотических нейтрофилов на синтез PGE2 в первой подгруппе составлял 1,4 расч. ед. (IQR 1,3—11), тогда как во второй — 0,12 расч. ед. (^И 0,04—0,65; р П = 0,003), т. е. продукция PGE2 либо усиливалась в среднем на 40%, либо ингибировалась на 88%.
Интересно отметить, что в подгруппе 2 интактные макрофаги характеризовались более высокой (в 2,6 раза) продукцией PGE2 (360 vs 140 пг/мл, ри = 0,32) и более низкой продукцией значительного количества цитокинов (табл. 2), что проявлялось достоверными различиями в уровне Т№-а (ри= 0,012), ГЬ-9 (ри = 0,028), MIP-1а (р П = 0,019) и МШ-ф (рП = 0,004), а также в виде отчетливого тренда в отношении ГЬ-6, ГЬ-17,ГШ-у, IL1-rа, G-CSF, Rantes, Eotaxin (рП = 0,09—0,12). Такая взаимосвязь была вполне логичной и могла указывать на причастность PGE2 к негативной регуляции цитокин-секреторной функции макрофагов. Однако неожиданным оказалось, что в подгруппе 2, в которой контакт с апопто-тическими нейтрофилами приводил к выраженному снижению синтеза PGE2 (на 88%, с 360 до 18 пг/мл), супрессорный эффект на продукцию многих цитокинов был выше, чем в оппозитной подгруппе. Достоверные различия в выраженности супрессии отмечались в отношении продукции ГЬ-6 (96 vs 58%; р и = 0,028), ГЬ-17 (47 vs 32%; ри = 0,028), FGF-b (85 vs 39%; рП = 0,042) и VEGF (77 vs 44% рП = 0,028). Таким образом, апоптотические клетки оказывают модулирующий эффект на продукцию PGE2, который играет, по-видимому, неоднозначную роль в подавлении продукции цитокинов при взаимодействии с апоптотическими клетками.
Обсуждение
Поглощение апоптотических клеток макрофагами считается ключевым событием в разрешении воспаления, причем не только вследствие предотвращения лизиса погибших кле-
Таблица 2
Продукция цитокинов макрофагами (М1 и М1-нф) в подгруппах доноров, оппозитных по направленности эффекта апоптотических нейтрофилов на синтез PGE2
Подгруппа 1 (п = 7) Подгруппа 2 (п = 6)
М1 М1-нф % супрессии М1 М1-нф % супрессии
ЮТ-а 8890 (280— 19520) 4200 (210—11340) 42 (3—53) 177 (120— 840)* 120 (83— 128)* 50 (43— 53)
1Ь-9 51 (33— 60) 43 (18—49) 27 (4—43) 18 (18- 30)* 9 (8— 13)* 51 (44— 56)
М№-1а 2120 (200— 9520) 1970 (170—5090) 12 (0—47) 82 (67— 120)* 38 (38— -114)* 43 (20— 54)
м№-1р 14740 (5600 —14750) 14750(4510—14750) 3 (0—12) 3630 (3210—4640)** 2560 (2060 —2650)** 43 (43— 46)
ГЬ-6 26720 (6990 —41970) 14690 (590—20470) 58 (45—92) 7140 (5440 —8380) 270 (235— 770) * 96 (91— 96)*
ГЬ-17 417(150— 440) 299 (90—330) 32 (3—40) 141(140— 350) 82 (77— 124)* 47 (46— 63)*
FGF-basic 59 (12— 100) 44 (4—60) 39 (18—67) 27 (9— 40) 4 (4— 4) 85 (56— 88)*
VEGF 172 (108— 360) 144 (18—190) 44 (33—53) 130 (80— 135) 24 (17- —30) 77 (67— 79)*
1Ь1-га 1020(140— 1600) 458 (22—1030) 55 (36—85) 126 (110— -415) 36 (22— 150) 64 (62— 80)
1Ш-у 1100(170— 2510) 660 (15—790) 75 (50—83) 75 (60— 220) 15 (15 —30) 80 (75— 81)
G-CSF 710 (120— 3360) 1260 (6—2100) 44 (18—92) 150(80— 160) 24(12— 24)* 77 (74— 85)
Rantes 1640(170— 6560) 1080 (120—1760) 58 (28—73) 210 (160— 250) 74 (72 —83) 66 (54— 70)
Eotaxin 170 (40— 310) 115 (6—178) 62 (33—84) 33 (25— 75) 6 (6— 6) 81(76— -82)
Примечание. Подгруппы 1 и 2 — доноры, у которых выявлен соответственно стимулирующий и ингибирующий эффекты. апоптотических клеток на продукцию М1 макрофагами PGE2. Данные представлены в виде медианных значений и (в скобках). ** — ри < 0,01; * — рц < 0,05 — достоверность различий с соответствующими значениями в подгруппе 1 ( П — критерий Манна—Уитни).
ток с последующим высвобождением воспалительного содержимого, но и в результате функционального репрограмми-рования макрофагов [4, 20]. Наблюдаемое при эффероцитозе блокирование продукции провоспалительных цитокинов и усиление продукции TGF-ß, IL-10 и PGE2 [5—8, 21], а также подавление экспрессии NO-синтазы и усиление экспрессии аргиназы (у мышей) и липоксигеназы (у мышей и человека) [22, 23] свидетельствует об индукции М2 фенотипа.
В настоящей работе показано, что поляризованные М1 макрофаги также подвержены влиянию апоптотических клеток. В частности, кратковременный контакт с апоптотиче-скими нейтрофилами приводит к значимому угнетению их аллостимуляторной активности, что служит характерным признаком М2 макрофагов у человека [18, 19]. При этом мультиплексный анализ продукции 27 цитокинов продемонстрировал выраженное угнетение цитокин-секреторной функции М1 клеток. Преинкубация с апоптотическими ней-трофилами сопровождалась снижением продукции как про-(TNF-a, IL-6, IL-1ß), так и противовоспалительных (IL-10, IL1-ra) цитокинов, а также иммунорегуляторных цитокинов (IL-2, IFN-y, IL-12, IL-4, IL-9, IL-13, IL-15, IL-17), ростовых факторов (G-CSF, GM-CSF, IL-7, FGF-basic, PDGF, VEGF) и хемокинов (IL-8, IP-10, MCP-1, Rantes, Eotaxin).
Подавление продукции провоспалительных цитокинов (TNF-a, IL-6, IL-1ß) при эффероцитозе — известный факт [5, 6, 8]. В то же время данные о влиянии эффероцитоза на продукцию IL-10 весьма противоречивы, что может быть связано с особенностями культуральных систем. Так, возрастание LPS-индуцированной продукции IL-10 при инкубации с апоптотическими клетками четко продемонстрировано для моноцитов [6, 8, 14]. В то же время эффект эффероцитоза в культурах неполяризованных макрофагов неоднозначен. Рядом авторов показано увеличение продукции IL-10 [11, 12] или отсутствие изменений [7], тогда как другими — снижение уровня IL-10 [5, 8, 14]. Относительно поляризованных М1 клеток в единственном исследовании, продемонстрировавшем усиление продукции IL-10 при эффероцитозе, авторы использовали макрофаги, инфицированные M. Leprae, что могло повлиять на полученные результаты [24]. В то же время Xu W. и соавт. [13] не выявили стимулирующего влияния апоптотических клеток на LPS-индуцированную продукцию IL-10 М1 клетками. Исходя из наших данных, реполяризация М1 макрофагов человека в М2 клетки при контакте с апопто-тическими нейтрофилами не ассоциирована с возрастанием продукции IL-10. Следовательно, высокая экспрессия данного цитокина, по-видимому, не является «универсальным» маркером М2-клеток человека.
В литературе также имеются данные о супрессорном влиянии апоптотических клеток на продукцию макрофагами IL-12 [7] и IL-15 [24], активирующих, соответственно, диф-ференцировку Th1- и поддерживающих гомеостатическую пролиферацию Т-лимфоцитов, а также о подавлении продукции GM-CSF и ряда хемокинов — IL-8, MCP-1 и MIP-1a [5, 14] Полученные нами результаты согласуются с этими данными. В то же время ингибирующий эффект апоптотических клеток на продукцию IL1-ra, иммунорегуляторных цитокинов
— IFN-y, IL-4, IL-9, IL-13, IL-15, IL-17, ростовых факторов
— G-CSF, IL-7, FGF-basic, PDGF, VEGF и хемокинов — IP-10, Rantes и Eotaxin — описан нами впервые. Учитывая участие иммунорегуляторных цитокинов и хемокинов в рекрутировании и активации различных субпопуляций иммунных клеток, можно полагать, что угнетение цитокин-секреторной функции М1 клеток может способствовать разрешению воспалительного ответа, опосредованного клетками как врожденного, так и приобретенного иммунитета. При этом более выраженное подавление продукции IFN-y, IL-2 и IL-17, по сравнению с IL-9 и IL-13, может обусловливать смещение баланса в сторону цитокинов, поддерживающих гуморальный ответ. Кроме того, практически полное угнетение секреции
original article
GM-CSF, являющегося у человека ростовым фактором М1 клеток [25], может блокировать дифференцировку моноцитов и неполяризованных макрофагов в М1 клетки, также способствуя подавлению воспалительной реакции.
Поскольку ингибиция провоспалительных цитокинов при эффероцитозе опосредуется с участием эйкозаноидов [5, 9], мы также исследовали продукцию PGE2. В отличие от однонаправленного подавления цитокин-секреторной функции, апоптотические клетки по-разному влияли на продукцию PGE2, оказывая в половине случаев стимулирующий (подгруппа 1, n = 7), а в половине (подгруппа 2, n = 6) — ингибирующий эффект. Тот факт, что в подгруппе 2 интакт-ные макрофаги характеризовались более высокой (в 2,6 раза) продукцией PGE2 (360 vs 140 пг/мл) и более низкой продукцией значительного количества цитокинов (достоверно для TNF-a, IL-9, MIP-1a, MIP-1ß и на уровне тренда для IL-6, IL-17, IFN- у, IL1-ra, G-CSF, Rantes, Eotaxin) хорошо согласуется с устоявшимися представлениями об ингибирующем влиянии PGE2 на продукцию многих цитокинов.
В то же время снижение продукции цитокинов после контакта с апоптотическими нейтрофилами, наблюдаемое в обеих группах, т. е. как на фоне усиления, так и подавления синтеза PGE2, свидетельствует о неоднозначной роли PGE2 в опосредовании ингибирующего эффекта апоптотических клеток. Более выраженная супрессорная активность апоп-тотических клеток на продукцию цитокинов в подгруппе 2 на фоне практически полной (на 88%) блокады синтеза PGE2 оказалась неожиданной и на данный момент не имеет объяснений.
Так или иначе, полученные результаты могут указывать на гетерогенность М1 клеток, обусловливающую генерацию различных функциональных фенотипов макрофагов после контакта с апоптотическими клетками. Так, S. Schif-Zuck и соавт. [23] в исследованиях на мышах показали, что поглощение апоптотических нейтрофилов может индуцировать две субпопуляции макрофагов, различающихся по фенотипу, фагоцитарной активности и уровню индуцированной продукции воспалительных цитокинов, хемокинов, IL-10 и TGF-ß.
Заключение
Эффероцитоз регулируется с участием множества рецепторов, необходимых для распознавания апоптотических клеток и их поглощения. Учитывая, что М1 клетки обладают меньшей способностью к фагоцитозу апоптотических клеток [13, 16], можно полагать, что для подавления цитокин-секреторной активности М1 макрофагов достаточно их кратковременного взаимодействия с апоптотическими ней-трофилами. В пользу этого предположения свидетельствуют данные, демонстрирующие, что снижение продукции про-воспалительных цитокинов в присутствии апоптотических клеток обусловлено контактным взаимодействием и не требует фагоцитоза [10].
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
17. Сахно Л.В., Тихонова М.А., Шевела Е.Я., Тыринова Т.В., Лепли-на О.Ю., Останин А.А., Черных Е.Р. Фенотипические и функциональные особенности М2-подобных макрофагов человека. Бюллетень СО РАМН. 2014; 34(4): 18—24.
references
1. Mantovani A., Sozzani S., Locati M., Allavena P., Sica A. Macrophage polarization: tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. 2002; 23(11): 549—55.
оригинальные статьи
2. Gordon S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 2003; 3(1): 23—35.
3. Roszer T. Understanding the mysterious M2 macrophage through activation markers and effector mechanisms. Mediators of Inflammation. 2015; Article ID 816460, 16 pages Doi: 10.1155/2015/816460.
4. Erwig L.P., Henson P.M. Immunological consequences of apoptotic cell phagocytosis. Am. J. Pathol. 2007; 171(1): 2—8.
5. Fadok V.A., Bratton D.L., Konowal A., Freed P.W., Westcott J.Y., Henson P.M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-beta, PGE2, and PAF. J. Clin. Invest. 1998; 101(4): 890—8.
6. Voll R.E., Herrmann M., Roth E.A., Stach C., Kalden J.R., Girkontaite I. Immunosuppressive effects of apoptotic cells. Nature. 1997; 390 (6658): 350—1.
7. Kim S., Elkon K.B., Ma X. Transcriptional suppression of interleukin-12 gene expression following phagocytosis of apoptotic cells. Immunity. 2004; 21(5): 643—53.
8. Byrne A., Reen D.J. Lipopolysaccharide induces rapid production of IL-10 by monocytes in the presence of apoptotic neutrophils. J. Immunol. 2002; 168 (4): 1968—77.
9. Freire-de-Lima C.G., Xiao Y.Q., Gardai S.J., Bratton D.L., Schiemann W.P., Henson P.M. Apototic cells, through transforming growth factor, coordinately induce anti-inflammatory and suppress pro-inflammatory eicosanoid and NO synthesis in murine macrophages. J. Biol. Chem. 2006; 281(50): 38376—84.
10. Cvetanovic M., Ucker D.S. Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition. J. Immunol. 2004; 172(2): 880—9.
11. Chung E.Y., Liu J., Homma Y., Zhang Y., Brendolan A., Saggese M. et al. Interleukin-10 expression in macrophages during phagocytosis of apoptotic cells is mediated by homeodomain proteins Pbx1 and Prep-1. Immunity. 2007; 27(6): 952—64.
12. Das A., Ganesh K., Khanna S., Sen C.K., Roy S. Engulfment of apoptotic cells by macrophages: a role of microRNA-21 in the resolution of wound inflammation. J. Immunol. 2014; 192 (3): 1120—9.
13. Xu W., Roos A., Schlagwein N., Woltman A.M., Daha M.R., van Kooten C. IL-10-producing macrophages preferentially clear early apoptotic cells. Blood. 2006; 107(12): 4930—7.
14. Fraser D.A., Laust A.K., Nelson E.L., Tenner A.J. C1q differentially modulates phagocytosis and cytokine responses during ingestion of
apoptotic cells by human monocytes, macrophages, and dendritic cells. J. Immunol. 2009; 183 (10): 6175—85.
15. Chen W., Frank M.E., Jin W., Wahl S.M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 2001; 14(6): 715—25.
16. Zizzo G., Hillard B.A., Monestier M., Cohen P.L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires «M2c» polarization and Mer TK induction. J. Immunol. 2012; 189(7): 3508—20.
17. Sakhno L.V., Tikhonova M.A., Shevela E.Y., Tyrinova T.V., Leplina O.Y., Ostanin A.A., Chernykh E.R. Phenotypic and functional features of human M2-like macrophages. Bulleten SO RAMN. 2014; 34(4): 18—24. (in Russian)
18. Chernykh E.R., Shevela E.Y., Sakhno L.V., Tikhonova M.A., Petrovsky Y.L., Ostanin A.A. The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair? Cell. Therapy Transpl. 2010; 2(6): 1—7. Doi:10.3205/ctt-2010-en-000080.01.
19. Sakhno L.V., Shevela E.Y., Tikhonova M.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R. The phenotypic and functional features of human M2 macrophages generated under low serum conditions. Scand. J. Immunol. 2016; 83(2): 151—9.
20. Greenlee-Wacker M.C. Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation. Immunol. Rev. 2016; 273(1): 357—70.
21. Huynh M.L., Fadok V.A., Henson P.M. Phosphatidylserine-dependent ingestion of apoptotic cells promotes TGF-beta1 secretion and the resolution of inflammation. J. Clin. Invest. 2002; 109(1): 41—50.
22. Ariel A., Serhan C.N. New lives given by cell death: macrophage differentiation following their encounter with apoptotic leukocytes during the resolution of inflammation. Front Immunol. 2012; 3: Article 4. Doi: 10.3389/fimmu.2012.00004
23. Schif-Zuck S., Gross N., Assi S., Rostoker R., Serhan C.N., Ariel A. Saturated-efferocytosis generates pro-resolving CD11b low macrophages:modulation by resolvings and glucocorticoids. Eur. J. Immunol. 2011; 41(2): 366—79.
24. De Oliveira F.T., Andrade P.R., de Mattos Barbosa M.G., Pinto T.G.T., Ferreira P.F., Ferreira H. et al. Effect of apoptotic cell recognition on macrophage polarization and mycobacterial persistence. Infect. Immunol. 2014; 82(9): 3968—78.
25. Verreck F.A., de Boer T., Langenberg D.M., van der Zanden L., Ottenhoff T.H. Phenotypic and functional profiling of human proinflammatory type-1 and anti-inflammatory type-2 macrophages in response to microbial antigens and IFN-y- and CD40L-mediated costimulation. J. Leukoc. Biol. 2006; 79(2): 285—93.
Поступил 23.03.17а Принята в печать 14.04.17
