CC BY
27
УДК 612.017.1:612.112.91]:615.357
ВЛИЯНИЕ АНАЛОГА ГОНАДОТРОПИН-РИЛИЗИНГ ГОРМОНА СУРФАГОНА НА ИММУННЫЙ ОТВЕТ И АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ВНУТРИЖЕЛУДОЧКОВОМ ВВЕДЕНИИ У КРЫС
© Бобынцев И.И., Северьянова Л.А., Смахтин М.Ю., Крюков А.А.
Кафедра патологической физиологии Курского государственного медицинского университета
Аналог гонадотропин-рилизинг гормона сурфагон при введении в боковые желудочки мозга в дозах 3 и 30 нг 1 раз в сутки стимулировал гуморальный иммунный ответ (количество антителообразующих клеток в селезенке) и фагоцитарную и функциональную активность нейтрофилов у крыс на фоне достоверного увеличения индексов массы тимуса и селезенки. При этом содержание тестостерона в сыворотке крови не изменялось, что указывает на отсутствие активации гипоталамо-гонадальной системы. Уменьшение при этом в сыворотке концентрации продуктов перекисного окисления липидов может свидетельствовать о влиянии пептида на стресс-лимитирующие системы головного мозга и ослаблении окислительного стресса. Полученные результаты позволяют заключить, что установленные эффекты сурфагона реализуются преимущественно через нервные регуляторные механизмы.
Ключевые слова: гонадотропин-рилизинг гормон, сурфагон, иммунный ответ, фагоцитоз, функциональная активность нейтрофилов, внутрижелудочковое введение.
THE INFLUENCE OF THE INTRAVENTRICULAR ADMINISTRATION OF GONADOTROPIN-RELEASING HORMONE ANALOGUE ON IMMUNE RESPONSE AND
NEUTROPHYL ACTIVITY IN RATS Bobyntsev I.I., Severyanova L.A., Smakhtin M. Yu., Kryukov A.A.
Pathophysiology Department of the Kursk State Medical University Intraventricular administration of the synthetic analogue of gonadotropin-releasing hormone (surfagon) results in increased humoral immune response and neutrophil activation including phagocytic and special functional inde-cies in rats. Since testosterone blood level is not changed it may be concluded that the surfagon effect is mediated by nervous mechanisms. The conclusion is also confirmed by the obtained data of the brain stress-limiting system activation manifested by decreasing of oxidative stress.
Key words: gonadotropin-releasing hormone, surfagon, immune response, phagocytosis, neutrophil functional activity, intraventricular infusion.
В выполненных ранее исследованиях нами было установлено выраженное влияние периферического введения высокоактивного аналога гонадотропин-рилизинг гормона (Гн-РГ) сурфагона на гуморальный иммунный ответ и факторы неспецифической резистентности как в исходном состоянии [3], так и в условиях эмоционально-болевого стресса
[4].
Выявленные при этом эффекты пептида имели достаточно сложный характер и не всегда согласовывались с изменением функционального состояния гипоталамо-гипофи-зарно-гонадальной системы. В связи с этим в их реализации возможно наличие нескольких механизмов, связанных с участием всех регу-
ляторных систем организма: нервной, эндокринной и иммунной. В частности, участие нервной системы в иммунотропном действии сурфагона вполне реально, учитывая ее важную роль в регуляции иммунного ответа, а также выраженные нейротропные эффекты пептида [2, 12, 13], в том числе при его центральном введении [11]. Также важным является тот факт, что в настоящее время Гн-РГ отводится роль первичной сигнальной молекулы во взаимоотношениях нервной и иммунной систем на уровне головного мозга [22]. Однако исследование иммунотропных эффектов Гн-РГ и его аналогов при центральном введении, согласно данным литературы, ранее не проводилось.
Целью данного исследования являлось изучение влияния сурфагона при введении в боковые желудочки мозга на гуморальный иммунный ответ, состояние органов иммунной и эндокринной систем, фагоцитарную и функциональную активность нейтрофилов, а также на уровень тестостерона и активность перекисного окисления липидов в крови.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполнены на крысах-самцах линии Вистар массой 250-280 г., разделенных на группы по 8-10 животных. Сур-фагон (пГлю-Гис-Трп-Сер-Тир-О-Ала-Лей-Арг-Про-этиламид) синтезировали в Российском кардиологическом научно-производственном комплексе МЗ РФ. Крысам за 5 дней до иммунизации эритроцитами барана (ЭБ) под гексеналовым наркозом вживляли металлические канюли в правый боковой желудочек по стереотаксическому атласу мозга крысы [23]. В подопытных группах с помощью микродозатора вводили сурфагон в дозах 3 и 30 нг в 3 мкл изотонического раствора хлорида натрия 1 раз в сутки на протяжении 4-х дней после иммунизации ЭБ, в контрольной - 3 мкл изотонического раствора хлорида натрия по аналогичной схеме. Забой животных осуществляли на 5-й день после иммунизации ЭБ под эфирным наркозом. Иммунный ответ оценивали по количеству антителооб-разующих клеток (АОК) в селезенке в расчете на 106 ядерных клеток и на весь орган [8]. При этом определяли и общее количество спленоцитов (клеточность селезенки).
Активность кислородзависимых бактерицидных механизмов в нейтрофилах периферической крови оценивали микроскопически по количеству (в %) диформазан-положитель-ных нейтрофилов в спонтанном и стимулированном тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) [5]. В качестве стимулирующего фактора использовали вакцину из штамма S. marcescens. Фагоцитарную активность нейтрофилов исследовали после их инкубации в течение 30 мин при 37оС со Staphylococcus albus [8]. При этом фагоцитарное число (количество микробов, захваченных одним нейтрофилом) и фагоцитарный индекс
(процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе) определяли в мазках, окрашенных метиленовым синим. Наряду с указанными показателями у крыс рассчитывали индексы массы тимуса, селезенки и надпочечников (отношение массы органа в мг к массе тела животного в г).
В сыворотке крови методом иммунофер-ментного анализа с помощью многоканального фотометра "MuШskan МСС-340" ("Labsystems", Финляндия) определяли содержание тестостерона. Кроме того, проводили исследование активности перекисного окисления липидов в сыворотке крови с использованием набора реактивов для определения малонового диальдегида (МДА) и спектрофотометра 'Ъи-65" ("Весктап", Великобритания).
Достоверность полученных результатов определяли по ^критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В обеих использованных дозах сурфагон оказывал выраженное стимулирующее влияние на развитие гуморального иммунного ответа (таблица 1 и рисунок 1). После введения пептида в дозе 3 нг количество АОК в расчете на 106 ядерных клеток селезенки возрастало на 130% (р < 0,05). Более значительное увеличение данного показателя иммунного ответа отмечалось при использовании дозы 30 нг (на 203% (р < 0,01). Различия выраженности эффектов пептида между подопытными группами также было достоверным. Изменение числа АОК в расчете на орган имело аналогичную направленность. Таким образом, была установлена зависимость степени изменения иммунного ответа от использованной дозы пептида. Клеточность селезенки в подопытных группах при этом существенно не изменялась.
Наряду с усилением иммунологической реактивности после введения сурфагона наблюдалась и активация факторов неспецифической резистентности. В обеих подопытных группах повышение активности защитных кислородзависимых механизмов нейтрофи-лов проявлялось существенным изменением всех исследованных показателей. Количество диформазан-положительных клеток в спон-
Таблица 1
Показатели (М±т) гуморального иммунного ответа и активности нейтрофилов после
внутрижелудочкового введения сурфагона
Группа Показатель Контроль 3 нг 30 нг
Число АОК на селезенку 17135±4,1 37774±6,8* 48717±8,8*
Число АОК на 106 спленоцитов 24,6±5,2 57,2±4,5* 74,6±3,3*
Клеточность селезенки (млн) 717,0±75,8 689,4±72,3 682,3±83,1
Спонтанный НСТ-тест (%) 9,8±0,9 14,2±1,5* 18,1±2,4*
Стимулированный НСТ-тест (%) 19,4±2,0 35,4±2,3* 38,8±2,9*
Функциональный резерв (%) 9,6±1,4 21,9±1,3* 20,6±1,4*
Фагоцитарный индекс (%) 29,3±3,0 44,8±3,0* 49,8±4,5*
Фагоцитарное число 1,9±0,2 2,4±0,2 2,1±0,1
Примечание: * - р < 0,05-0,001
танном и стимулированном НСТ-тесте после введения пептида в дозе 3 нг возрастало на 45% и 82% соответственно. Введение сурфагона в дозе 30 нг способствовало более значительному возрастанию данных показателей - на 85% и 100%. В обеих опытных группах отмечалось выраженное увеличение функционального резерва нейтрофилов, что свидетельствует об их высокой функциональной лабильности. Абсолютные значения функционального резерва в опытных группах, несмотря на более высокие показатели в НСТ-тесте при введении большей дозы пептида, существенно не различались.
Сурфагон в обеих дозах вызывал и увеличение фагоцитарной активности нейтрофи-лов. Введение пептида в дозе 3 нг способствовало возрастанию фагоцитарного индекса
на 53% (р < 0,05), а фагоцитарного числа - на 26% (р > 0,05). При дозе 30 нг фагоцитарный индекс увеличивался на 70% (р < 0,05), тогда как фагоцитарное число существенно не изменялось (на 11%). Следует отметить, что, в отличие от гуморального иммунного ответа, изменения показателей неспецифической резистентности между подопытными группами достоверно не различались.
Влияние пептида на формирование иммунного ответа сопровождалось изменением индексов массы органов иммуногенеза (таблица 2 и рисунок 1). Так, масса тимуса возрастала по мере увеличения используемой дозы пептида (на 17 и 24% соответственно). Масса селезенки в подопытной группе, получавшей сурфагон в дозе 3 нг, фактически не изменялась. В дозе 30 нг пептид вызывал
Таблица 2
" ——Группа Показатель " ——-—__ Контроль 3 нг 30 нг
Индекс массы тимуса 1,055±0,064 1,23±0,115 1,31±0,067*
Индекс массы селезенки 0,369±0,028 0,413±0,028 0,49±0,032*
Индекс массы надпочечников 0,224±0, 2 0,231±0,017 0,244±0,02
Тестостерон (нмоль/л) 3,15±0,7 4,36±0,87 2,68±0,88
МДА (мкмоль/л) 2,96±0,26 2,22±0,23* 2,14±0,16*
Примечание: * - р < 0,05-0,01
Индексы массы органов иммуногенеза и эндокринной системы и содержание тестостерона и малонового диальдегида (М±т) в сыворотке крови у крыс после внутрижелудочкового
введения сурфагона
Тестостерон
Масса надпочечников
МДА
Масса тимуса
Масса селезенки
НСТ-стим.
ФИ
НСТ-спонт.
Рис. 1. Влияние внутрижелудочкового введения сурфагона на иммунный ответ, активность ней-трофилов, эндокринную систему и уровень малонового диальдегида в сыворотке крови. Обозначения: радиус окружности - контроль,--3 нг,.....- 30 нг, р < 0,05-0,001.
более значительное увеличение данного показателя (на 24%, р < 0,05). Однако подобное изменение индекса массы на фоне отсутствия достоверных изменений клеточности органа могло быть следствием увеличения его кровенаполнения. В отличие от органов иммунной системы индекс массы надпочечников в опытных группах существенно не отличался от контрольных значений.
Исследование содержания тестостерона в сыворотке периферической крови показало (таблица 2), что после введения сурфагона существенных изменений уровня гормона не происходило. Наряду с этим в обеих подопытных группах в равной степени (на 2528%, р < 0,05) снижалось содержание МДА в сыворотке крови.
Таким образом, при внутрижелудочковом введении сурфагона наблюдалась значительная стимуляция гуморального иммунного ответа и факторов неспецифической резистент-
ности, которая сопровождалась возрастанием индексов массы тимуса и селезенки. Выраженность изменений иммунологических показателей зависела от величины использованной дозы пептида. Следует отметить, что степень стимуляции иммунного ответа в данной работе значительно превышала показатели, полученные в случае внутрибрюшинного введения пептида [3]. Выявленные изменения в органах иммуногенеза и показателей эф-фекторного гуморального звена иммунного ответа могут являться следствием активации нервных механизмов регуляции иммунитета. Известно, что нервная система оказывает значительное влияние на иммунную как через прямую иннервацию, так и посредством гормональных влияний [1, 10, 21].
В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что при внутрижелудочко-вом способе введения достаточно малых доз пептида исключается возможность его пря-
мого влияния на органы иммуногенеза. Участие эндокринных механизмов в реализации эффектов сурфагона также представляется маловероятным. Так, отсутствие достоверных сдвигов уровня тестостерона в сыворотке крови позволяет исключить участие гипофи-зарно-гонадальной системы в реализации эффектов препарата. Индекс массы надпочечников также не изменялся, что косвенно свидетельствует об отсутствии их активации, тогда как в сериях с периферическим введением пептида происходило увеличение данного показателя как у интактных, так и у кастрированных крыс [3].
В пользу нервных механизмов эффектов пептида свидетельствуют и данные литературы. Установлено, что Гн-РГ и его аналог-агонист D-Trp-Гн-РГ, имеющий сходные с сурфагоном структуру и биологические свойства, при внутрижелудочковом введении обладают высокой нейротропной активностью и вызывают активацию дофаминергической и опиоидной систем [19, 24], являющихся медиаторами эмоционально-положительного подкрепления. Известно, что дофаминергиче-ская система играет важную активирующую роль и в процессах нейроиммуномодуляции [7, 15]. При этом необходимо отметить, что в наших исследованиях нейротропные эффекты при внутрижелудочковом введении сурфаго-на были сходны с эффектами вышеуказанного аналога: снижение эмоционально-негативной реактивности при неизбегаемом электроболевом раздражении за счет анальге-тического и антиагрессогенного действия, а также изменение поведения крыс в открытом поле [11]. Кроме того, пептид оказывал выраженное влияние на системы эмоционального подкрепления при изучении формирования алкогольной мотивации и выработки пищевого рефлекса [12, 13]. Активация сурфагоном опиоидной системы, обладающей стресс-лимитирующей активностью [6], вероятно, явилась причиной ослабления окислительного стресса и снижения содержания МДА в сыворотке крови.
Необходимо отметить еще один возможный механизм действия пептида. Известно, что L-аргинин, входящий в состав молекулы сурфагона, является физиологическим предшественником оксида азота. Данная молекула является универсальным регулятором физио-
логических процессов, в том числе функций нервной и иммунной систем [14]. Существуют также веские основания считать систему оксида азота одной из стресс-лимитирующих систем [9]. Поэтому нельзя исключать участие оксида азота в реализации эффектов пептида, содержащего в своей структуре аргинин.
Кроме того, использованный способ центрального введения мог облегчить доступ пептида к структурам мозга, труднодосягаемым при периферическом введении, в частности, к гиппокампу, разные области которого могут стимулировать или ингибировать иммунный ответ [20] и в нем имеется высокая плотность специфических Гн-РГ-рецепторов [18]. Необходимо отметить, что связывание аналогов Гн-РГ с рецепторами в структурах мозга сходно со связыванием природного пептида [17].
Наблюдавшаяся активация сурфагоном фагоцитарной активности нейтрофилов также могла реализовываться с участием нервной системы. Так, известно, что электрическая стимуляция нервных центров бугристой зоны вызывает усиление фагоцитоза, которое прекращалось после перерезки спинного мозга или под влиянием барбитуратов [16].
Таким образом, сурфагон при введении в боковые желудочки мозга оказывает выраженное стимулирующее влияние на иммунологическую реактивность и активность ней-трофилов на фоне снижения активности пе-рекисного окисления липидов в крови. Отсутствие достоверных сдвигов содержания тестостерона в крови позволяет исключить при этом активацию гипофизарно-гонадальной системы, а центральное введение пептида - прямое воздействие на органы иммунной системы. Следовательно, основным путем реализации установленных эффектов аналога Гн-РГ может являться активация нервных механизмов регуляции иммунитета. Полученные данные также свидетельствуют о важной физиологической роли Гн-РГ во взаимодействии нервной и иммунной систем.
ЛИТЕРАТУРА
1. Адо А.Д. О взаимодействиях нервной и имму-
нокомпетентной систем. Вестн. РАМН. (7):
48-51. 1993.
2. Бобынцев И.И., Северьянова Л.А., Ляшев Ю.Д. Нейротропные эффекты аналога люлиберина у крыс с различной чувствительностью к этанолу. Бюл. эксперим. биологии и медицины. 112 (12): 612-615. 1991.
3. Бобынцев И.И., Северьянова Л.А. Иммуно-тропные эффекты аналога гонадотропин-рилизинг гормона в условиях эмоционально-болевого стресса. Бюл. эксперим. биологии и медицины. 133 (5): 504-506. 2002.
4. Виксман М.Е., Маянский А.Н. Способ оценки функциональной активности нейтрофилов человека по реакции восстановления нитроси-него тетразолия. - Казань, 1979.
5. Влияние синтетического аналога гонадолибе-рина на иммунный ответ и факторы неспецифической резистентности у крыс и мышей. Бобынцев И.И., Северьянова Л.А. Конопля А.И. и др. // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 83 (9): 1177-1181. 2002.
6. Долгушин И.И. Нейтрофилы и гомеостаз. -Екатеринбург: УрО РАН, 2001.
7. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. - М.: Медицина, 1987.
8. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю. Стресс-лимитирующая система оксида азота // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 86 (10): 1283-1292. 2000.
9. Роль периферической нервной системы в связи иммунной системы с мозгом. Ноздрачев А.А., Колосова Л.И. и др. // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 86 (6): 728-742. 2000.
10. Северьянова Л.А., Бобынцев И.И. Нейротроп-ные эффекты аналога люлиберина при внут-рижелудочковом введении у крыс с различной чувствительностью к этанолу. Бюл. экс-перим. биологии и медицины. 119 (2): 129132. 1995.
11. Северьянова Л.А., Бобынцев И.И. Влияние аналога люлиберина на формирование алкогольной мотивации у крыс // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 79 (12): 23-27.
12. Северьянова Л.А., Бобынцев И.И. Влияние аналога люлиберина (сурфагона) на выработку пищевого условного рефлекса у крыс с различной чувствительностью к этанолу. Фи-зиол. журн. им. И.М. Сеченова. 83 (3):
100-106. 1997.
13. Серая И.П., Нарциссов Я.Р. Современные представления о биологической роли оксида азота. Успехи соврем. биологии. 122 (3): 249258.2002.
14. Стимуляция иммунного ответа при активации дофаминергической системы у мышей с оппо-зитными формами поведения. Идова Г.В., Чейдо М.А. и др. // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 88 (11): 1394-1400.
15. Чейдо М.А., Идова Г.В. Дофаминергические механизмы в иммуностимулирующем эффекте мю-опиоидных рецепторов. Бюл. эксперим. биологии и медицины. 121 (4): 373-375. 1996.
16. Baciu I. The role of nervous mechanisms in the immune response. Rev. Roum. Physiol. 29 (1-2): 5-11. 1992.
17. Gender, neuroendocrine-immune interaction and neuron-glial plasticity. Role of luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH). Marchetti B., Gallo F., Farinella Z. et al. // Ann. N.Y. Acad. Sci.. 917: 678-709. 2000.
18. GnRH receptors in rat brain, pituitary and testis: modulation following surgical and gonadotropin-releasing hormone agonist-induced castration. Bun E., Crumeyrolle-Arias M., Latouche J. et al. // Mol. Cell. Endocrinol. 70 (1): 99-107. 1990.
19. Havour F., Dussailant V., Leblanc P. Vise en evidence et repartition topographique des receptors du LH-RH chez le rat male normal et caster au niveau dy systeme nerveux central. C.R. Acad. Sci. (Paris). 305 (2): 41-44. 1987.
20. Kadar T., Telegdy G., Shally A.V. Behavioral effects of centrally administered LH-RH agonist in rats. Physiol. Behav. 51 (3): 601-605. 1992.
21. Lathe R. Hormones and the hippocampus. J. Endocrinol. 169 (2): 205-231. 2001.
22. Madden K., Felten D.L. Experimental basis for neural-immunological interactions. Physiol. Rev. 75 (1): 77-106. 1995.
23. Pellegrino L.J., Pellegrino A.S., Cushman A.J. A stereotaxic atlas of the rat brain. N.Y. and Lond.: Plenum Press, 1981.
24. Telegdy G., Kadar T., Balazs M. Involvement of neurotransmitter and neuropeptides in behavioral action of some neurohormones. Pol. J. Pharmacol. Pharm. 42 (6): 537-546. 1990.
