CC BY
17
УДК 579.222, 579.242
Е. О. Михайлова, Н. П. Балабан, А. Д. Сулейманова, М. Р. Шарипова, Э. Р. Шайдуллина, М. Т. Лутфуллин, А. М. Марданова
ВЛИЯНИЕ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ НА РОСТ И ПРОДУКЦИЮ СУБТИЛИЗИНА РЕКОМБИНАНТНЫМ ШТАММОМ BACILLUSSUBTILIS
Ключевые слова: аутоиндукторы анабиоза, субтилизин, биосинтез, Bacillussubtilis.
Исследовано влияние ауторегуляторных факторов dj, являющихся аутоиндукторами анабиоза, на рост и продукцию субтилизина рекомбинантными клетками Bacillussubtilis. Показано, что С-АОБ, С6-АОБ, СТ-АОБ оказывают влияние на уровень синтеза протеолитических ферментов. Максимальный ингибирующий эффект был выявлен для СТ-АОБ. С-АОБ, С6-АОБ, напротив, оказывали стимулирующее воздействие на синтез субтилизина. С-АОБ, С6-АОБ, СТ-АОБ оказывают разное влияние на рост культуры B. subtilis. Ростингибирующий эффект выявлен для С-АОБ, С6-АОБ при высоких концентрациях и стимулирующий при низких. СТ-АОБ оказывал незначительное влияние на рост бактериальной культуры.
Keywords: anabiosisautoinducers, subtilisin, biosynthesis, Bacillussubtilis.
It was investigated the influence of dj autoregulatory factors, which are anabiosys autoiducers, on the growth of Bacillus subtilis recombinant cells and production of subtilisin. It is shown that alkyl hydroxybenzenes (AHBs) - Сj-АHB, С6rАHB and СТ-АHB - affects the level of synthesis of proteolytic enzymes. The maximum inhibitory effect was detected for С-rAHB. СJ-АHB and С6rАHB by contrast, had a stimulating effect on the synthesis of subtilisin. СJ-АHB, С6rАHB and СТrАHB have a different impact on the growth of a culture of B. subtilis. The growth inhibitory effect identified forСJ-АHB and С6-АHB at high concentrations and stimulating at low. СТ-А.HB had little impact on the growth of bacterial culture.
Введение
Анабиоз представляет собой обратимую метаболическую инактивацию клеток, сопряженную с их многократно возрастающей устойчивостью к неблагоприятным воздействиям. Выяснение молекулярных механизмов этого процесса важно как с точки зрения изучения физиологии микроорганизмов: дифференцировки, клеточного метаболизма, приспособления к меняющимся условиям окружающей среды, функционирования в сообществе; так и с точки зрения эпидемиологии, ведь это дало бы возможность найти ключ к пониманию роли патогенных микроорганизмов, участвующих в возникновении и поддержании различных заболеваний. Формирование состояния покоя обеспечивается, видимо, несколькими механизмами, один из которых может реализовываться с участием ауторегуляторных факторов обнаруженных в культуральной
жидкости разных видов микроорганизмов. По своей химической природе факторы ^ представляют собой производные алкилоксибензолов (АОБ) [1]. Ониявляются аутоиндукторами анабиоза микроорганизмов и обладают биологической полифункциональностью [2]. При повышении концентрации АОБ в развивающейся микробной культуре они лимитируют рост численности популяции, а при дальнейшем возрастании их уровня - вызывают переход клеток анабиотическое состояние [3, 4]. Изучение механизма их действия позволяет предположить, что АОБ могут играть роль химических шаперонов, формируя метаболический блок в клетке [5]. Предполагается, что алкилоксибензолы, образуют комплексы с ферментами, что приводит к их частичной каталитической инактивации и стабилизации [6]. В
этой связи представляет интерес выяснение влияния АОБ на рост культуры микроорганизмов и уровень синтеза внеклеточной сериновой протеиназы, которая, видимо, принимает участие в клеточной дифференциации.
Целью работы было выяснение механизма влияния алкилоксибензолов (АОБ) -низкомолекулярных аутоиндукторов анабиоза - на продукцию субтилизина и рост культуры рекомбинантного штамма БасШшчиЬ(Ш&\
Материалы и методы
В работе использовали химические аналоги фактора ^ - С1-алкилоксибензол (метилрезорцинол) (М=123), С6-алкилоксибензол (гексилрезорцинол) (М=196), СТ-алкилоксибензол (тиразол) (М=138). Химические аналоги фактора ^ получены со степенью очистки 99,9 %. Используемые алкилоксибензолы любезно предоставлены Г.И. Эль-Регистан (Институт Микробиологии РАН).
С1-АОБ растворим в воде, С6-АОБ и СТ-АОБ - растворимы в этаноле.
Использовался рекомбинантный штамм БасШш8иЫШ81&20-36 с плазмидой рС89, несущей ген субтилизина Б. ритИш' 3-19.
Для выращивания культуры Б. зиЫШз были использованы Ь-ереды следующего состава[7,8]:
Ь-бульон (среда ЬБ, Лурия-Бертани): триптон - 10 г/л; дрожжевой экстракт -5 г/л; №С1 -5 г/л.
Ь-агар: триптон - 10 г/л; дрожжевой экстракт - 5 г/л; №С1 - 5 г/л; 2% агар.
Посевным материалом служила 24-часовая культура. Эритромицин вносили стерильно перед посевом в концентрации 500 мкг/мл.
Активность сериновой протеиназы определяли на субстрате Z-Ala-Ala-Leu-pNA [9]. За единицу активности принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1мкМ субстрата за 1 мин.
Контроль за ростом культуры осуществляли, определяя изменение оптической плотности (Бопт) культуры. Прирост биомассы определяли нефелометрически на ФЭК-56 ПМ со светофильтром 9. За единицу биомассы принимали поглощение в 1-см кювете.
Для исследования воздействия разных химических аналогов фактора d^Q-АОБ, С6-АОБ и СТ-АОБ) на уровень синтеза протеолитических ферментов С1-АОБ, С6-АОБ и СТ-АОБ вносили в культуральную среду непосредственно после посева в конечных концентрациях 10-3, 10-5, 10-7и 10-9 М. В опытах с С6-АОБ и СТ-АОБ в контрольные колбы вносили эквивалентное количество этанола. Через 24 час инкубации отбирали пробы культуральной жидкости. Центрифугированием (10000g, 3 мин) освобождали ее от бактериальных клеток и определяли протеолитическую активность.
Для исследования воздействия
алкилоксибензолов на рост бактериальной культурыС1-АОБ, С6-АОБ и СТ-АОБ вносили в культуральную среду непосредственно после посева в концентрациях 10-3, 10-5, 10-7и 10-9 М. На 24 час отбирали пробы и измеряли Бопт.
Для анализа экспериментальных данных проводили математическую обработку результатов в программной среде "Microsoft Excel" путем расчета среднеквадратичного отклонения среднего арифметического (а<13%). Для проведения математического анализа использовали следующую формулу:
а =
где ст - среднеквадратическое отклонение среднеарифметического; х, - х - отклонение каждого члена ряда от величины среднеарифметического.
Результаты исследований и их обсуждение
В культуральной жидкости разных видов микроорганизмов были обнаружены
ауторегуляторные факторы ^ - производные алкилоксибензолов (АОБ) [1, 10]. Факторы ^ являются аутоиндукторами анабиоза
микроорганизмов. При повышении концентрации АОБ в развивающейся микробной культуре они лимитируют рост численности популяции, а при дальнейшем возрастании их уровня - вызывают переход клеток анабиотическое состояние [3, 4].
Эти факторы присутствуют в развивающейся культуре в виде смешанных изомеров и гомологов и обладают биологической полифункциональностью [2]. Закономерности их действия на клетку связаны со способностью модифицировать структурную организацию мембран, увеличивать микровязкость их липидной стромы за счет образования межмолекулярных водородных связей между гидроксилами ароматического ядра фактора и мембранными
фосфолипидами и макромолекулами белков, повышать проницаемость мембран для моновалентных ионов, индуцировать дегидратацию клеточного протопласта, влиять на активность мембрано-связанных ферментов [11, 12].
Чрезвычайно важным представляется выяснение того, насколько универсальным является действие микробных ауторегуляторов по отношению к различным клеткам про- и эукариот.
В настоящей работе исследовали влияние химических аналогов фактора ^, различающихся по структуре углеродной боковой цепи и по количеству ОН-групп бензольного кольца, на рост бактериальной культурыВ. зиЫШз и продукцию внеклеточного субтилизина.
Все три изученных аналога ауторегуляторного фактора 4:С1-АОБ, С6-АОБ и СТ-АОБ оказывали влияние на рост рекомбинантного штамма В. зиЫШз и накопление внеклеточной протеиназы (субтилизина) в культуральной жидкости. В зависимости от типа алкилоксибензола и его концентрации наблюдали как стимулирующий, так и ингибирующий эффект. С1-АОБ незначительно ингибировал рост культуры (на 13-14%) в сравнении с контролем только при относительно высоких концентрациях индуктора -10-3 и 10-5 М. При снижении концентрации индуктора до 10-7 и 10-9 М влияния на рост не наблюдали. В тоже время активность субтилизина в культуральной жидкости зависит от присутствия индуктора в среде роста. В концентрации 10-3 М на 24 час роста уровень внеклеточной активности ингибировался на 53% в сравнении с контролем. Однако при снижении концентрации индуктора С1-АОБ в среде до 10-5, 10-7и 10-9 М наблюдали незначительное повышение протеолитической активности в культуральной жидкости (на 15-22 %) (рис. 1).
140 -120 -
«
g 100-!s 80 -
о
и 60 -
н
° 40-
о4
□ рост
□ активность
20 -
0 --
Рис. 1 - Влияние С1-АОБ на рост культуры В.
и уровень внеклеточной
протеолитической активности. За 100% принимали значения оптической плотности и протеолитической активности культуры без С1-АОБ. Концентрации С1-АОБ: 1 - 10-3, 2 - 10-5, 3 -10-7, 4 - 10-9 М. 24 час роста
Наибольшее воздействие на рост культуры В. 8иЪШ18 оказывал С6-АОБ. Эффект индуктора на рост бактерий зависел от концентрации. В концентрациях 10-3 и 10-5 М С6-АОБ ингибировал
рост на 44 и 21% соответственно. В тоже время при концентрациях 10-7 и 10-9 М была отмечена незначительное повышение роста культуры (на 6 и 18%) (рис. 2). Как видно из рисунка 2, С6-АОБ оказывал значительное влияние на продукцию внеклеточного субтилизина. Так при концентрации С6-АОБ равном 10-3 М наблюдали полное ингибирование продукции субтилизина. В тоже время при концентрациях 10-5 и 10-7 М С6-АОБ была выявлено незначительное повышение
протеолитической активности (на 6 и 25 % соответственно). Однако при концентрации С6-АОБ 10-9 М протеолитическая активность вновь снижалась и не превышала 30% от контроля.
гЬ
140
120
«
н 100
о
& 80
о
и 60
н
о
^ о4 40
20
0
□ рост
□ активность
Рис. 2 - Влияние Сб-АОБ на рост культуры В.
и уровень внеклеточной
протеолитической активности. За 100% принимали значения оптической плотности и протеолитической активности культуры без Сб-АОБ. Концентрации Сб-АОБ: 1 - 10-3, 2 - 10-5, 3 -10-7, 4 - 10-9 М. 24 час роста
СТ-АОБ во всех исследованных концентрациях не оказывал заметного влияния на рост культуры (рис. 3). Оптическая плотность культуры Б.зиЫШзна 24 час роста достигала 93-98% от контроля. В тоже время СТ-АОБ оказывал значительный ингибирующий эффект на продукцию бактериями субтилизина. При концентрации 10-3 М наблюдали полное подавление продукции субтилизина. Уровень внеклеточной протолетичес-
120
100
«
ч
о 80
£
к 60
о
и
н 40
о .©
20
Г±1
□ рост
□ активность
Рис. 3 - Влияние Ст-АОБ на рост культуры В. 8иЫШ8 и уровень внеклеточной
протеолитической активности. За 100% принимали значения оптической плотности и протеолитической активности культуры без Ст-АОБ. Концентрации Ст-АОБ: 1 - 10-3, 2 - 10-5, 3 -10-7, 4 - 10-9 М. 24 час роста
кой активности не превышал 1-2% от контроля. СТ-АОБ при концентрации 10-5М ингибировал внеклеточную активность на 67%. В концентрациях 10-7 и 10-9 М СТ-АОБ ингибировал активность на 50 и 15% соответственно.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о способности разных химических аналогов ^ факторов влиять на рост бактериальной культуры и продукцию внеклеточных протеиназ. Эффект алкилоксибензолов зависит как от строения соединения, так и от его концентрации в среде культивирования. Так наименьший ингибирующий эффект на продукцию субтилизина оказывал С1-АОБ, а наибольший ингибирующий эффект - СТ-АОБ. Это может быть связано с различной гидрофобностью аналогов ^ факторов. С1-АОБ и СТ-АОБ во всех концентрациях не влияли на рост культуры. В тоже время С6-АОБ в концентрациях 10-3 и 10-5 М ингибировал рост культуры на 34 и 22% соответственно, а при снижении концентрации, напротив, оказывал стимулирующий эффект на рост культуры. Полученные данные согласуются с данными литературы о возрастании влияния алкилоксибензолов с более гидрофобными свойствами на функциональную активность мембран [10]. В литературе имеются данные о влиянии алкилоксибензолов на свойства и функцию клеточных мембран. Модификация мембраны бактериальной клетки алкилоксибензолами может изменять секрецию бактериями внеклеточных ферментов и их накопление в среде.
Снижение активности протеаз в среде можно также объяснить возможной модификацией белковой молекулы АОБ. Полученные результаты подтверждают ранее высказанные предположения о том, что АОБ могут функционировать как низкомолекулярные естественные модификаторы и изменять структуру белковых макромолекул, что в свою очередь может приводить к неспецифическому ингибированию каталитической активности ферментов, в том числе протеиназ [2].
Таким образом, можно предположить, что влияние изученных алкилоксибензолов на рост культуры Б. зиЪШз и продукцию сериновых протеиназ связано с взаимодействием этих соединений с компонентами поверхностных структур клетки бактерий.
Работа выполнена в рамках государственной программы повышения
конкурентоспособности Казанского
(Приволжского)федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров. Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному
университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности (проект № 14-83).
Литература
1. Г.И.Эль-Регистан, В.И.Дуда, В.А.Светличный, А.Н.Козлова, И.А.Типисева, Микробиология, 52,2, 238243 (1983).
2. М.М. Беспалов, А.И. Колпаков, Н.Г.Лойко, Е.В. Дорошенко, А.Л. МулюкинД.Н. Козлова,
о
Е.А.Варламова,Б.И.Курганов, Г.И.Эль-Регистан,
Микробиология, 69,2, 217-223 (2000).
3. Г.А. Осипов, Г.И.Эль-Регистан, В. А. СветличныйД. Н.Козлова, В.И. Дуда,
A.С.Капрельянц, В.В.Помозанов, Микробиология, 54,2, 184-190 (1985).
4. С.Г.Батраков, Г.И.Эль-Регистан, Н. Н.Придачина,
B.А.Ненашев, А.Н.Козлова, М.Н.Грязнова, И.Н. Золотарева,Микробиология, 62,4, 633-638 (1993).
5. О.Н. Ильинская, А.И. Колпаков, М.А. Шмидт, Е.В. Дорошенко, А.Л. Мулюкин, Г.И. Эль-Регистан, Микробиология, 71, 1, 23-29 (2002).
6. А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская, М.М. Беспалов, Ф.Г. Куприянова-Ашина, В.Ф. Гальченко, В.И. Курганов, Г.И. Эль-Регистан,Микробиология, 69, 2, 180-185 (2000).
7. А.А. Тойменцева, А.М. Черёмин, Е.О. Михайлова, М.Р. Шарипова, Вестник Казанского технологического университета, 20, 191-194 (2013).
8. Н.М. Замалютдинова, И.Р. Галиева, А.О. Арапова, Е.О. Михайлова, М.Р. Шарипова, А.М. Марданова,
Вестник Казанского технологического университета, 16, 10, 191-194 (2013).
9. I.B. Leshinskaya, E.V. Shakirov, E.L. Itskovich, N.P. Balaban, A.M. Mardanova, M.R. Sharipova,M.B. Viryasov, G.N. Rudenskaya, V.M. Stepanov, FEBS Lett, 440, 241-244 (1997).
10. А.Л.Мулюкин, К.А.Луста, М.Н.Грязнова, А.Н.Козлова, М.В.Дужа, В.И.Дуда, Г.И.Эль-Регистан, А.С.КапрельянцМикробиология, 65,6, 782-789 (1996).
11. А.С.Капрельянц, М.К.Сулейменов, А.Д.Сорокина, Г.А.Деборин, Г.И.Эль-Регистан, Ф.М.Стоянович, Ю.Э.Лилле, Д.Н.ОстровскийБиологические мембраны, 4,3, 254-261 (1987).
12. Г.Н. Вострокнутова, А.С.Капрельянц, В .В. Светличный,Г. И. Эль-Регистан, В. В .Шевцов, Д.Н.ОстроковскийПрикл. Микробиология и биохимия, 19,4, 547-551 (1983).
© Е. О. Михайлова - канд. биол. наук, доц. каф. БСМЭ КНИТУ, katyushka.glukhova@gmail.com; Н. П. Балабан - к.б.н., с.н.с. кафедры микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии КФУ, nellybalaban@yandex.ru; А. Д. Сулейманова - к.б.н., н.с. кафедры микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии КФУ, aliya.kzn@gmail.com; М. Р. Шарипова - д.б.н., проф. каф. микробиологии К(П)ФУ, marsharipova@gmail.com; Э. Р. Шайдуллина - студ. каф. микробиологии Казанского (Приволжского) Федерального университета, aoisora86@gmail.com; М. Т. Лутфуллин - студ. каф. биохимии и биотехнологии К(П)ФУ,lutfullin.marat2012@yandex.ru; А. М. Марданова - канд. биол. наук, доц. каф. микробиологии К(П)ФУ, mardanovaayslu@mail.ru
© E. O. Mikhailova, PhD, associate professor of BSME department, KNRTU, katyushka.glukhova@gmail.com; N. P. Balaban, PhD, sen. res. of Microbiology dep., Institute of fundamental medicine and biology, Kazan federal university, nellybalaban@yandex.ru; A. D. Suleimanova, PhD, res. of Microbiology dep., Institute of fundamental medicine and biology, Kazan federal university, aliya.kzn@gmail.com; M. R. Sharipova, PhD, professor of Microbiology dep., Institute of fundamental medicine and biology, Kazan federal university, marsharipova@gmail.com; E. R. Shaidullina - student of Microbiology dep., Institute of fundamental medicine and biology, Kazan federal university, aoisora86@gmail.com; M. T. Lutfullin - student of Microbiology dep., Institute of fundamental medicine and biology, Kazan federal university,lutfullin.marat2012@yandex.ru; A. M. Mardanova - PhD, associate professor of Microbiology dep., Institute of fundamental medicine and biology, Kazan federal university, mardanovaayslu@mail.ru.
