CC BY
53
Физико-химическая биология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 191-195
УДК 577.152.1.017.73:631.46
ВЛИЯНИЕ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК КРОВИ IN VITRO
© 2012 г. Ж.А. Казацкая1, М.А. Шаров1, В.В. Новиков1, Г.И. Эль-Регистан2
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского 2 Институт микробиологии им. С.К. Виноградского РАН, Москва
kmb@bio.unn.ru
Поступила в редакцию 15.03.2012
Исследовано влияние алкилоксибензолов на розеткообразующие и адгезивные свойства лимфоцитов и фагоцитарную активность нейтрофилов in vitro. Определены физиологические и цитотоксиче-ские концентрации алкилоксибензолов при их действии на лимфоциты человека и эритроциты барана. Показан разнонаправленный характер действия на отдельные популяции Т-лимфоцитов. Выявлено выраженное стимулирующее действие алкилоксибензолов на фагоцитарную активность нейтрофилов.
Ключевые слова: алкилоксибензолы, лимфоциты.
цитоз.
Введение
В настоящее время накоплен обширный материал о различных ауторегуляторных функциях микробных метаболитов, обеспечивающих внутри- и межпопуляционные взаимодействия, в том числе контролирующих рост и развитие микроорганизмов [1—3]. Известно, что при наступлении неблагоприятных для роста и развития микроорганизмов условий они могут переходить в покоящееся состояние - анабиоз, выделяя в среду метаболиты, которые способны выполнять ауторегуляторную функцию. К микробным ауторегуляторам роста и развития относятся как высокополимерные белки, так и низкомолекулярные соединения, синтезируемые клеткой. Низкомолекулярные ауторегуляторы включают в себя внеклеточные мембрано-тропные факторы ^ [3]. Биологическая функция факторов ^ заключается в индукции перехода вегетативных клеток в метаболически неактивные формы, сохраняющие жизнеспособность в течение длительного времени и обладающие повышенной термостабильностью по сравнению с вегетативными клетками [4]. Их действие является видонеспецифичным, то есть они обладают активностью не только в отношении клеток продуцентов, но и в отношении клеток других микроорганизмов. По химической природе ауторегуляторные факторы, синтезируемые микробной клеткой, относятся к классу алкилоксибензолов (АОБ) и присутствуют в культуре в виде смеси изомеров и гомологов, различающихся положением гидроксилов в
нейтрофилы, розеткообразование, адгезия, фаго-
кольце и конфигурацией алкильного радикала [2, 5-8].
В настоящей работе использованы химически синтезированные аналоги бактериальных факторов анабиоза d1: АОБ С7, АОБ С8, АОБ С12, предоставленные Московским институтом микробиологии РАН. АОБ С7 является гидрофильным аналогом фактора d1, АОБ С12 - гидрофобным, АОБ С8 (тирозол) обладает как гидрофильными, так и гидрофобными свойствами. По результатам исследований М.М. Беспалова и А.И. Колпакова [8] АОБ С12 хорошо стабилизирует белки, но снижает их каталитическую активность. АОБ С7 стабилизирует и повышает каталитическую активность (работа велась на протосубтилизине - протеаза Вас^иЬй^). Известно, что стабильность и активность ферментов не обязательно связаны обратной зависимостью. Повышение стабильности и пролонгирование функциональности белков может способствовать росту их активности (специфической). Протекторная функция АОБ связана с его способностью модифицировать молекулярную организацию субклеточных структур [9]. Факторы ^ - модификаторы структурной организации мембран - увеличивают микровязкость их липидной стромы за счет образования межмоле-кулярных водородных связей между гидроксилами ароматического ядра фактора и мембранными липидами, повышают проницаемость мембран для моновалентных ионов, индуцируют дегидратацию клеточного протопласта, влияют на активность мембраносвязанных ферментов, а также обладают антиоксидантной актив-
Таблица 1
Изменение розеткообразующей активности Т-лимфоцитов при действии алкилоксибензолов
ЛОБ Розеткообразование с предварительной обработкой алкилсбензолами ЭБ или лимфоцитов (% розеткообразующих клеток по отношению к контролю, принятому за 100%)
ЭБ Лимфоциты
«активные» «общие» «активные» «общие»
ЛОБ С7 б2 100 14б б1
Конц., % 5-10-3 510-3-110-2 1 10-3 1 10-3
ЛОБ СВ 130 100 100 14
Конц., % 1-10-3 110-3-110-2 110-3-110-2 1 10-4
ЛОБ С12 1б2 10 151 14
Конц., % 5-10~б 2 • 10-5 4 • 10-<5 2 • 10-5
Контроль 100 100 100 100
ностью, являются модификаторами не только липидной стромы, но и макромолекул ферментов. Нековалентные взаимодействия АОБ приводят, по-видимому, к изменению их конформации в составе каталитически малоактивных или неактивных комплексов [10].
Чрезвычайно важно выяснение того, насколько универсальным является действие микробных ауторегуляторов по отношению к клеткам высших организмов, принимая во внимание то, что эти метаболиты видонеспецифичны и постоянно синтезируются автохтонной микрофлорой организма (человека или животного). Недостаточно изученным является вопрос о влиянии фактора d1 и его аналогов на клетки организма человека и животных. Имеются лишь отдельные сведения о действии низкомолекулярных липидов на фибробласты мышей. Выявлено, что в определенном диапазоне концентраций проявляется его цитотоксический эффект.
В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение влияния алкилоксибензолов на функциональную активность клеток крови in vitro.
Экспериментальная часть
В работе использован системный методический подход к изучению влияния различных биологически активных веществ на клетки крови. Жизнеспособность лимфоцитов, выделенных из крови человека, при действии препаратов определяли в тесте с трипановым синим; функциональную активность Т-лим-фоцитов («активных» и «общих») - методом спонтанного розеткообразования (РО) [11]; адгезивные свойства мононуклеаров крови человека - методом определения процента прилипания клеток к синтетическим материалам (капрону); фагоцитарную активность
нейтрофилов - методом люминолзависимой хемилюминесценции.
Обьектом исследования служили химические аналоги ауторегуляторного фактора анабиоза микроорганизмов, являющиеся алкилок-сибензолами: АОБ С7, АОБ С8 (тирозол), АОБ С12.
Материалом исследований являлись донорская кровь, предоставленная Нижегородским областным центром крови, и эритроциты барана (ЭБ).
Результаты и их обсуждение
В ходе работы было исследовано цитотоксиче-ское действие АОБ. Изучено повреждающее действие различных концентраций (2 10-6 - 210-2%) исследуемых препаратов на эритроциты барана. Применены различные варианты термической обработки ЭБ: при t = 370С и t = 600С. Предобработка ЭБ проводилась в течение 1 часа с дальнейшим центрифугированием и измерением степени гемолиза полученного надосадка. Результаты проведенных исследований показали, что при обработке ЭБ при 370С и 600С в присутствии различных концентраций АОБ повреждающего действия не наблюдалось в следующих концентрациях: концентрация АОБ С7 не превышала 2*10"2%, АОБ С8 - 1 х 10-2%, АОБ С12 - 2х 10-4%.
Уровень жизнеспособности лимфоцитов, выделенных из крови человека, определяли в тесте с трипановым синим после инкубации в течение 1 часа при t = 370С. Цитотоксическое действие на лимфоциты не оказывали следующие концентрации препаратов: концентрация
АОБ С7 не превышала 1 -10"2%, АОБ С8 - 2 -10"2%, АОБ С12 - 2 -10-4%.
Таким образом, концентрации АОБ, не оказывающие повреждающего действия, одинаковы как для ЭБ, так и для лимфоцитов крови человека. Наиболее выраженное цитотоксическое
Таблица 2
Влияние АОБ на адгезивные свойства мононуклеарных клеток
АОБ Концентрация, % Количество адгезированных клеток
АОБ С7 0 30.7±3.1
5- 10'3 45.7±7.8*
1- 10'2 38.3±7,7
АОБ С8 0 157.0±85.1
5- 10'3 74.3±28.9
1- 10'2 117.0±74.1
АОБ С12 0 57.3±5.6
5- 10'5 22.5±3.7*
1- 10'4 38.0±4.2*
* Статистически значимые различия по сравнению с контролем.
Таблица 3
Влияние АОБ на фагоцитарную активность нейтрофилов
АОБ Концентрация, % S, имп/сек
АОБ С7 5 - 10'2 335.7±98.2
5 - 10'3 2099.0±513.8*
5 - 10'4 20056.0±2829.0*
5 - 10'5 125.5±7.7
0 563.2±36.3
АОБ С8 5 - 10'2 991.8±99.2*
5 - 10'3 28737.0±6311.0*
5 - 10'4 24.2±3.8
5 - 10'5 665.3±69.8
0 585.5±32.8
АОБ С12 5 - 10 '5 201.7±13.2
5 - 10'6 38421.0±5857.0*
5 - 10-7 1295±102*
5 - 10'8 6.5±0.6
0 719.5±64.8
действие оказывал препарат С12, что, возможно, связано с его гидрофобными свойствами.
Изучено влияние АОБ на функциональную активность Т-лимфоцитов в реакции спонтанного розеткообразования. Степень воздействия
АОБ на клетки оценивали по изменению уровня РОК («активных» и «общих»). Проводилась предобработка ЭБ или лимфоцитов различными концентрациями АОБ. Полученные результаты представлены в табл. 1.
Под действием препарата С12 наблюдалось повышение уровня «активных» РОК на 62% при обработке ЭБ и на 57% при обработке лимфоцитов и снижение уровня «общих» РОК как при обработке ЭБ (на 30%), так и лимфоцитов (на 26%) (табл. 1). С7 и С8 не изменяли уровень «общих» РОК при обработке ЭБ и снижали -при обработке лимфоцитов: С7 - на 39%, С8 -на 46%. Уровень «активных» РОК при действии С8 повышался при действии на ЭБ на 30% и не изменялся после обработки лимфоцитов. Следует подчеркнуть, что все изученные АОБ при действии на лимфоциты вызывали снижение «общих» Е-РОК. Возможно, их влияние связано с изменением рецепторной функции моно-нуклеаров в результате модификации мембранных структур клеток.
Охарактеризовать рецепторную функцию мононуклеарных клеток и их кооперативные возможности позволяет эффект адгезии, который в данной работе оценивался по способности иммунокомпетентных клеток (ИКК) прилипать к синтетическим материалам (в частности к капрону). При изучении изменения адгезивных свойств ИКК под действием АОБ показано, что АОБ С7 вызывал увеличение адгезивной способности в 1.5 раза, а С8 и С12 способствовали снижению уровня адгезии (табл. 2).
В экспериментах in vitro исследовали влияние различных концентраций - АОБ (С7, С8, С12) на фагоцитарную активность нейтрофи-лов методом люминолзависимой хемилюми-несценции. Оценку результатов проводили по показателю светосуммы хемилюминесценции - S. Эта величина пропорциональна бактерицидной и фагоцитарной активности клеток (табл. 3).
В ходе исследования влияния АОБ на дыхательный взрыв нейтрофилов установлена зависимость изменения фагоцитарной активности от концентрации АОБ. Выявлено выраженное стимулирующее действие на фагоцитарную активность клеток АОБ С7 в концентрации 5-10-45-10-3%, АОБ С8 - 5-10-3-5-10-2%, АОБ С12 -5 -10-7-5 -10-6%. Наибольший эффект оказывал АОБ С12 .
Таким образом, в результате проведенных исследований определены физиологические и цитотоксические концентрации алкилоксибен-золов при их действии на лимфоциты человека и ЭБ. Наиболее выраженным цитотоксическим действием обладал АОБ С12, повреждающее действие которого отмечено уже в концентрации 2 -10-4%. Выявлен разнонаправленный характер действия АОБ на отдельные популяции
Т-лимфоцитов. Показана зависимость изменения розеткообразующей активности лимфоцитов, выделенных из крови человека, от способа воздействия алкилоксибензолов (на ЭБ или лимфоциты) и их физико-химической природы. Выявлено выраженное стимулирующее действие АОБ на фагоцитарную активность нейтрофилов. Наибольший эффект оказывал АОБ С12.
Список литературы
1. Хохлов А.С. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы. М.: Наука, 1988. 272 с.
2. Бабусенко Е.С., Эль-Регистан Г.И., Градова Н.Б. и др. Исследование мембранотропных ауторегуляторных факторов метаноокисляющих бактерий // Успехи химии. 1991. Т. 60. Вып. 11. С. 23622372.
3. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Мулюкин А.Л. и др. Влияние мембраноактивных микробных ауторегуляторов на рост культуры клеток ras-трансформированных фибробластов // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т. 36. № 5. С. 549554.
4. Батраков С.Г., Эль-Регистан Г.И., Придачина Н.Н. и др. Тирозол - ауторегуляторный фактор dl дрожжей Saccharomycts cerevisiae // Микробиология. 1993. Т. 62. Вып. 4. С. 633-638.
5. Капрельянц А.С., Скрыпин В.И., Эль-Регистан Г.И. и др. Изменение структурного состояния мембраны M.lysodeikticus под влиянием препаратов ауторегуляторных бактериальных факторов dl // Прикладная биохимия и микробиология. 1985. Т. 21. Вып. 3. С. 378-381.
6. Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И., Светличный В.А. и др. О химической природе ауторегуляторного фактора dl Pseudomonas carboxydoflava // Микробиология. 1985. Т. 54. Вып. 2. С. 186-190.
7. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н. и др. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus // Микробиология. 1996. Т. 65. № 6. С. 782-789.
8. Колпаков А.И., Ильинская О.Н., Беспалов М.М. и др. Стабилизация ферментов аутоиндукторами анабиоза как один из механизмов устойчивости покоящихся форм микроорганизмов // Микробиология. 2000. Т. 69. № 2. С. 224-230.
9. Демкина Е.В., Соина В.С., Эль-Регистан Г.И. и др. Образование покоящихся форм Arthrobacter glo-biformis в автолизирующихся суспензиях // Микробиология. 2000. Т. 69. № 3. С. 383-388.
10. Беспалов М.М., Колпаков А.И., Мулюкин А.Л. и др. Функции аутоиндукторов анабиоза микроорганизмов при создании метаболического блока в клетке // Микробиология. 2000. Т. 69. № 2. С. 217223.
11. Ляпон А.О. Комплексный анализ Т-лимфо-цитов в тесте розеткообразования // Лаб. дело. 1980. № 1. С. 21-22.
THE EFFECT OF AN ALKYLHYDROXYBENZENES ON THE FUNCTIONAL ACTIVITY
OF BLOOD CELLS IN VITRO
Zh.A. Kazatskaya, M.A. Sharov, V. V. Novikov, G.I. El-Registan
We have studied the effect of alkylhydroxybenzenes (AHB) on rosette-forming and adhesion properties of lymphocytes and phagocytic activity of neutrophils in vitro. Physiological and cytotoxic concentrations of AHB were determined in their action on human lymphocytes and sheep erythrocytes. Multidirectional nature of AHB effect on separate populations of T-lymphocytes was demonstrated. A marked stimulating effect of AHB on phagocytic activity of neutrophils was revealed.
Keywords: alkylhydroxybenzenes, lymphocytes, neutrophils, adhesion, rosette formation, phagocytosis.
