CC BY
28
УДК 579.222, 579.242
Э. Р. Шайдуллина, Н. В. Рудакова, Е. О. Михайлова, М. Р. Шарипова, А. М. Марданова
ВЛИЯНИЕ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ НА АКТИВНОСТЬ СУБТИЛИЗИНА
BACILLUSPUMILUS 3-19
Ключевые слова: алкилоксибензолы, ауторегуляторы анабиоза, сериновыепротеиназы, B. pumilus 3-19.
Было исследовано влияние химических аналогов ауторегуляторного фактора d1, относящиеся к классу алки-локсибензолов, С-АОБ, С6-АОБ и СТ-АОБ на активность сериновой протеиназы Badlluspumilus 3-19. Показано ингибирующее действие этих соединений на активность внеклеточной субтилизиноподобной протеиназы B. pumilus 3-19, секретируемой на ранней стационарной фазе роста. С6-АОБ оказывает более выраженное ингибирующее действие на субтилизин, чем С-АОБ, что, видимо, объясняется разной гидрофобностью этих веществ. Максимальный ингибирующий эффект С6-АОБ проявляет в больших концентрациях (10'2М).
Keywords: alkylhydrooxybenzenes, anabiosisautoregulators, serine proteinases, B. pumilus 3-19.
The influence of chemical analogues of d1 autoregulatory factor belonging to the class of alkylhydrooxybenzenes (AHBs), С1-АHB, С6-АHB and СТ-АHB on the activity of Badlluspumilus 3-19 serine proteinasewas investigated. It was shown the inhibitory effect of these compounds on the activity of B. pumilus 3-19 extracellular subtilisin-like proteinase secreted at the early stationary growth phase. СбrАHB has a more pronounced inhibitory effect on subtilisin than С1-АHB, which might be explained by the different hydrophobicity of these substances. The maximum inhibitory effect of С6-АHB manifests in high concentrations (10'2M).
Введение
Явление анабиоза представляет собой одну из самых загадочных и малоизученных проблем в современной биологии. Выяснение молекулярных взаимодействий, обуславливающих это состояние, важно для понимания общих основ дифференциров-ки и метаболизма клетки, объяснения сукцессий и функционирование микробных сообществ в постоянно меняющихся условиях среды.
В состоянии анабиоза в клетках происходит ингибирование метаболизма, что сопряжено с выраженной устойчивостью покоящихся форм к различным повреждающим воздействиям. Формирование состояния покоя обеспечивается, видимо, несколькими механизмами, один из которых может реализовываться с участием ауторегуляторных факторов ^ [1-3]. Они являются аутоиндукторами анабиоза и по химической природе представляют собой алкилоксибензолы (АОБ) [4, 5]. Изучение механизма их действия позволяет предположить, что АОБ могут играть роль химических шаперонов, формируя метаболический блок в клетке. Предполагается, что алкилоксибензолы образуют комплексы с ферментами, что приводит к их частичной каталитической инактивации и стабилизации [6]. Представляет особый интерес дальнейшее изучение воздействия АОБ на различные ферменты микроорганизмов и, в частности, на протеиназы.
Целью настоящей работы стало изучение влияния алкилоксибензолов на активность внеклеточной сериновой протеиназы БасШшритИш 3-19.
Материалы и методы
Исследуемая протеиназа - внеклеточная щелочная сериновая протеиназастрептомицину-стойчивого штамма БасШшритИш' 3-19, синтезируемая в ранней стационарной фазе роста (24 час) [7]. Субтилизиноподобная протеиназа была получена из культуральной жидкости в гомогенном состоянии с помощью методов ионнообменной хрома-
тографии на КМ-целлюлозе фирмы "Reanal" (Венгрия) и на колонке Мопо8в системе FPLC (Pharmacia, Швеция) [8,9]. Фермент хранился в растворе в замороженном виде при t°= -18°.
Исследуемые ауторегуляторные факторы. В работе использовали химические аналоги фактора d1 - С1-алкилоксибензол (метилрезорцинол) (М=123), С6-алкилоксибензол (гексилрезорцинол) (М=196), СТ-алкилоксибензол (тиразол) (М=138). Химические аналоги фактора dj получены со степенью очистки 99,9 %. Используемые алкилоксибензолы любезно предоставлены д.б.н. Г.И. Эль-Регистан (Институт Микробиологии РАН).С1-АОБ растворим в воде, С6 и СТ - растворимы в этаноле. АОБ не теряют свойств в процессе хранения при низких температурах.
Протеолитическую активность субтили-зина определяли по гидролизу хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa [10]. За единицу активности принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкл субстрата за 1 мин.
Изучение влияния алкилоксибензолов на активность субтилизина. Q-АОБ или спиртовые растворы С6-АОБ и СТ-АОБ вносили в реакционные смеси в конечных концентрациях 1.0, 0.1, 0.01, 0.001мг/мл. С6-АОБ и СТ-АОБ вносили в таком объеме, чтобы конечная концентрация спирта в рабочем растворе не превышала 5 %. В контрольных вариантах для Q-АОБ и СТ-АОБ в рабочий раствор вносили эквивалентное количество этанола. Время пре-динкубации фермента с АОБ составляло 15 минут при комнатной температуре. Активность протеина-зы определяли по описанному выше методу.
Изучение влияния продолжительности пре-динкубации СГАОБ с субтилизином на активность фермента.
Q-АОБ добавляли к раствору субтилизина в концентрациях 0.05 и 0.0001 мг/мг; реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре.
Через 0, 5, 15, 30 и 60 минут отбирали аликвоты протеиназы с АОБ и определяли остаточную активность (ОА). За 100% принимали активность фермента без АОБ (ИА).
Результаты исследований и их обсуждение
Было исследовано влияние на протеолити-ческую активность длительности прединкубации-субтилизинасС1-АОБ в различной концентрации (0.05 и 0.0001 мг/мл). Было установлено, что С1-АОБ в концентрации 0,05 мг/мл оказывал ингиби-рующий эффект на активность фермента, который со временем значительно усиливался; если за 5 минут прединкубации активность протеиназы уменьшалась на 34%, то прединкубация фермента с АОБ в течение 60 минут приводила к потере 58% активности. Однако при значительно меньших концентрациях С1-АОБ подобной прямой зависимости не наблюдалось. При концентрации С1-АОБ 0.0001 мг/мл наибольшее ингибирование фермента наблюдалось после 5 мин инкубации (50% от контроля), а при дальнейшем увеличении продолжительности пре-динкубации ингибирующий эффект уменьшался до 22% (Рис. 1).Полученные результаты зависимости активности фермента от продолжительности его взаимодействия с АОБ согласуются с опубликованными данными по изучению стабилизации РНКа-зыаутоиндукторами анабиоза. Предполагается, что при взаимодействии ферментов с АОБ требуется определенное время, в течение которого происходит изменение конформации белка и стабилизация его структуры, видимо, вследствие образования водородных связей или гидрофобных взаимодействий[9].
100 80
ох
¡2 60 о о
§ 40
< 20 0
- 0,05 мг/мл 0,0001 мг/мл
5 15 30
Время, мин
Рис. 1 - Остаточная активность субтилизина БасШтритИт в зависимости от продолжительности прединкубации фермента с С1-АОБ (0.05мг/мл и 0.0001 мг/мл). За 100% принята активность субтилизина в отсутствии АОБ
Все три исследованных химических аналога фактора ^ -С1-АОБ, С6-АОБ и СТ-АОБ в широком диапазоне концентраций оказывали ингибирующее действие на активность субтилизина. Полученные результаты согласуются с литературными данными. Инактивация ферментов при их комплексообразова-нии с АОБ была продемонстрирована в модельных экспериментах с препаратами химотрипсина, трипсина, РНКазы, инвертазы, глюкозидазы[11].
В экспериментах с водным раствором С1-АОБ было установлено, что в диапазоне концентраций от 1 мг/мл до 0.001 мг/мл его ингибирующее
действие на фермент зависит от концентрации. При снижении концентрации от 1 мг/мл до 0.01 мг/мл этот эффект уменьшался от 42% до 3%. Однако при концентрации С1-АОБ 0.001 мг/мл активность про-теиназы снова падала до 63% от исходной, то есть ингибирование усиливалось (рис. 2).
Ингибирующее действие спиртораствори-мых С6-АОБ и СТ-АОБ в диапазоне концентраций от 1 мг/мл до 0.001 мг/мл прямо зависело от концентрации. Как видно из рисунка 3 С6-АОБ в концентрации 1 мг/мл ингибирует активность субтилизина на 88%, при концентрации 0.001мг/мл - на 22%. СТ-АОБ в концентрации 1 мг/мл ингибирует активность субтилизина на 100%, а при концентрации 0.001 мг/мл на 53% (рис. 4).
120 -|
100 -
¡З 80 ~
8 60 -и £
I 4020 -
0 —
0 12 3
-де, мг/мл
Рис. 2 - Влияние С1-АОБ на активность субтилизина БасШтритИт. Время инкубации 15 минут. Концентрации 1, 0.1, 0.01 и 0.001 мг/мл. За 100% принята активность субтилизина в отсутствии АОБ
90
80
- 70
60
н
о о 50
и
м 40
Е
Ё 30
< 20
10
0
0 12 3
мг/мл
Рис. 3 - Влияние С6-АОБ на активность субтилизина БасШтритИт. Время инкубации 15 минут. Концентрации 1, 0.1, 0.01 и 0.001 мг/мл. За 100% принята активность субтилизина в отсутствии АОБ
Поскольку все исследуемые нами алкилоксибензо-лы обладали ингибирующим эффектом в отношении субтилизина, интересно было выяснить к которому из них фермент более чувствителен. АОБ были взяты в концентрации 0.01 мг/мл. Было установлено, что наименьшее инактивирующее действие на суб-тилизин оказывает С1-АОБ (3%), а наибольшее - СТ-АОБ (61%). С6-АОБ ингибирует фермент на 28%. Такие значительные различия в эффективности ин-гибирования разными АОБ, видимо, можно объяснить разной степенью гидрофобности
0
60
60
50
o4
A 40
¡3
0 и 30
ffl
£
12 20
<
10
0 -I---,---,---,---,
0 12 3
-де, мг/мл
Рис. 4 - Влияние СТ-АОБ на активность субтили-зина БасШтритИт. Время инкубации 15 минут. Концентрации 1, 0.1, 0.01 и 0.001 мг/мл. За 100% принята активность субтилизина в отсутствии АОБ
их молекул. Нековалентные взаимодействия алки-локсибензолов с протеиназой приводят, по-видимому, к изменению конформации белковой молекулы, что в свою очередь влияет на её энзима-тические свойства. Существенно более гидрофобные С6-АОБ и СТ-АОБ оказывают более сильное влияние на конформацию и свойства субтилизина БасШшритИш' 3-19.
Можно предположить, что взаимодействия низкомолекулярных аутоиндукторов анабиоза с белками, и в частности, с протеиназами, обуславливающие изменения их свойств, являются одним из механизмов ингибирования метаболизма бактериальной клетки, что может быть необходимым условием перехода к анабиотическому состоянию.
Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров. Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной Казанскому феде-
ральному университету для выполнениягосударст-
венного задания в сфере научной деятельности
(проект № 14-83).
Литература
1. С.Г. Батраков, Г.И. Эль-Регистан, Н.Н. Придачи-на, В.А. Ненашев, А.Н. Козлова, М.Н. Грязнова, И.Н. Золотарева, Микробиология,62, 4, 633-638 (1993).
2. О.Н. Ильинская, А.И. Колпаков, А.Л. Мулюкин, Ф. Дрейер, Г.И. Эль-Регистан, Прикладная биохимия и микробиология, 69, 2, 217-223 (2000).
3. О.Н. Ильинская, А.И. Колпаков, М.А. Шмидт, Е.В. Дорошенко, А.Л. Мулюкин, Г.И. Эль-Регистан, Микробиология, 71, 1, 23-29 (2002).
4. А.Л. Мулюкин, А.Н. Козлова, А.С. Капрельянц, Г.И. Эль-Регистан, Микробиология, 65, 1, 20-25 (1996).
5. А.Л. Мулюкин, К.А. Луста, М.Н. Грязнова, Е.С. Бабусенко, А.Н. Козлова, М.В. Дужа, Л.Л. Митюшина, В.И. Дуда, Г.И. Эль-Регистан, Микробиология, 66, 1, 4249.
6. А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская, М.М. Беспалов, Ф.Г. Куприянова-Ашина, В.Ф. Гальченко, В.И. Курганов, Г.И. Эль-Регистан,Микробиология, 69, 2, 180-185 (2000).
7. А.А. Тойменцева, А.М. Черёмин, Е.О. Михайлова, М.Р. ШариповаВестник Казанского технологического университета, 20, 191-194 (2013).
8. Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, Е.Л. Ицкович, И.Б.Лещинская, Г.Н. Руденская, Биохимия, 59, 9, 19931400 (1994).
9. А.М. Марданова, Э.Х. Низамутдинова, Т. В.Ширшикова, Л. Х. Камалетдинова, Е. О. Михайлова, М.Р.Шарипова, Л.М. Богомольная, Вестник Казанского технологического университета, 19, 215-218 (2013)
10. I.B. Leshinskaya, E.V. Shakirov, E.L. Itskovich, N.P. Balaban, A.M. Mardanova, M.R. Sharipova,M.B. Viryasov, G.N. Rudenskaya, V.M. Stepanov, FEBS Lett, 440, 241-244 (1997).
11. М.М. Беспалов, Н.Г. Лойко, Е.В. Дорошенко, А.Л. Мулюкин, А.Н. Козлова, Е.А. Варламова, А.И. Колпаков, Б.И. Курганов, Г.И. Эль-Регистан, Микробиология, 69, 2, 217-223 (2000).
© Э. Р. Шайдуллина - студ. каф. микробиологии Казанского (Приволжского) Федерального университета, aoisora86@gmail.com; Н. Л. Рудакова - канд. биол. наук, научный сотрудник, Института фундаментальной медицины и биологии, natalialrudakova@mail.ru; Е. О. Михайлова - канд. биол. наук, доц. каф. БСМЭ КНИТУ, katyushka.glukhova@gmail.com; М. Р. Шарипова - д.б.н., проф. каф. микробиологии К(П)ФУ,
marsharipova@gmail.com; А. М. Марданова - канд. биол. наук, доц. каф. микробиологии К(П)ФУ, mardanovaayslu@mail.ru
© E. R. Shaidullina - student of Microbiology dep., Institute of fundamental medicine and biology, Kazan federal universi-ty,aoisora86@gmail.com; N. L. Rudakova - PhD, res. of Institute of fundamental medicine and biology, Kazan federal university, natalialrudakova@mail.ru; E. O. Mikhailova, PhD, associate professor of BSME department, katyushka.glukhova@gmail.com; M. R. Sharipova, PhD, professor of Microbiology dep., Institute of fundamental medicine and biology, Kazan federal university, marsharipova@gmail.com; A. M. Mardanova - PhD, associate professor of Microbiology dep., Institute of fundamental medicine and biology, Kazan federal university, mardanovaayslu@mail.ru.
