CC BY
17
Показатели воспроизводимости и повторяемости метода количественного определения соединения VMA-99-56 с использованием ВЭЖХ в диапазоне линейной зависимости площади хроматографи-ческого пика от концентрации растворов (M±m)
Концентрация, мкг/мл Повторяемость, ±Д % Воспроизводимость (ср. ошибка измерения), %
1-й день 2-й день 3-й день
0,5 - - - -
1 -3,7 0,52 27,51 10,57
5 7,8 17,57 28,04 17,80
10 0,6 13,44 32,79 15,61
25 7,2 -3,29 52,95 18,95
При повторном проведении анализа, после 72 часов хранения водных растворов соединений при комнатной температуре, средние абсолютные процентные колебания находились в тех же пределах, показывая стабильность изучаемых веществ. При изучении влияния процессов замораживания и таяния было обнаружено, что средние абсолютные про-
УДК 615.31:547.854.4:542.91:615.281.8
центные колебания для изучаемых веществ находились в тех же пределах, что определяет стабильность веществ под влиянием данных факторов.
Разработанные хроматографические методы анализа обладают достаточной селективностью и позволяют определять в биологических пробах как само лекарственное вещество, так и его возможные метаболиты. При этом время удерживания стандарта позволяет отделять возможные метаболиты с меньшими временами удерживания от "мертвого объема" и фоновых веществ биологической пробы.
Методы извлечения подобраны оптимально и практически не влияют на среднюю ошибку измерения хроматографических методов количественного определения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, разработанные методы количественного определения являются высокоселективными и высокочувствительными, что позволяет эффективно использовать их для проведения фармако-кинетических исследований.
© Коллектив авторов, 2006
ВЛИЯНИЕ АЛКИЛЬНЫХ ЗАМЕСТИТЕЛЕМ В БОКОВОЙ ЦЕПИ ПРИ ЭКЗОЦИКЛИЧЕСКОМ АТОМЕ АЗОТА НА АНТИ-ВИЧ-1 АКТИВНОСТЬ IN VITRO НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 1-(БЕНЗИЛОКСИМЕТИЛ)-5-(АРИЛАМИНО)УРАЦИЛА
А.А. Лобачев, А.А. Озеров, М.С. Новиков, Т. Хартман, Р.У. Букхайт
НИИ фармакологии ВолГМУ
Антивирусный потенциал производных 5-(ари-ламино)урацила остается до настоящего времени не выясненным, несмотря на их структурное подобие многим высокоактивным противовирусным агентам ненуклеозидной природы, применяющимся для лечения ВИЧ-инфекции в качестве важнейших компонентов комплексной высокоинтенсивной антиретро-вирусной терапии [5, 7], что делает перспективным и актуальным поиск новых противовирусных лекарственных средств на их основе [1-3]. Ранее в лаборатории синтеза противовирусных средств НИИ фармакологии ВолГМУ было обнаружено, что структурная модификация базовой структуры 1-(бензилоксиметил)-5-(ариламино)урацила, заключающаяся во введении дополнительных алкильных заместителей в различные положения боковой цепи при атоме азота М1, привела в целом к снижению антивирусных свойств соединений данного ряда, повышению цитотоксичности и увеличению ингиби-торной концентрации приблизительно на порядок
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить влияние дополнительных алкильных заместителей в ариламинном фрагменте новых производных 1-(бензилоксиметил)-5-(ариламино)урацила на их вирусингибиторные свойства.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Нами были синтезированы новые ^-замещенные производные 5-аминоурацила общей формулы:
где: X = связь, СН, СН2; Y = связь, СН2; Я1 = Н, СН3; Я = Н, СН3, С3Н7; Я = Н, СН3.
Первый этап синтеза включал получение метилированных в аминогруппу боковую цепь и аромати-
3
R
ческое ядро производных анилина, бензиламина и фенетиламина.
3,5-Диметиланилин был получен из соответствующего амида 3,5-диметилбензойной кислоты окислением по Гофману: O
НС
H3C
Br2, NaOH
3,5-Диметилбензиламин синтезировали путем восстановления нитрила 3,5-диметилбензойной кислоты алюмогидридом лития в абсолютном тетра-гидрофуране:
H3C
N
UAH
H3C.
THF
33
а-Метилбензиламин получали восстановительным аминированием ацетофенона формиатом аммония по Лейкарту:
O
HCOONH
'4
а-Пропилбензиламин получали аналогично из бутирофенона:
O NH,
снз hcoonh4
М-Метилпроизводные бензиламина и фенетиламина (п = 1 или 2) синтезировали в две стадии: прямым формилированием исходных жирноароматиче-ских аминов муравьиной кислотой с азеотропной отгонкой воды с толуолом и последующим восстановлением полученных формамидов алюмогидридом лития:
(CH2)nNH2
(CH2)nNHC(O)H
(CH2)nNHCH3
Аналогичным образом ранее полученный а-ме-тилбензиламин был превращен сначала в формиат, а затем в а,М-диметилбензиламин:
LiAlH,
THF
Второй этап синтеза включал аминирование 5-бромурацила полученными метилированными аминами. Реакцию проводили в среде безводного кипящего этиленгликоля при 3-5-кратном избытке амина: о
им^В
,Br
H
R 2
HN
^x
R 2
На заключительном этапе синтеза полученные 5-(ариламино)-урацилы алкилировали бензилхлорме-тиловым эфиром по методу Гилберта-Джонсона [8]:
.А
R' I
N. ,Y. X
R2
1. (Me3Si)2NH
2. PhCH2OCH2Cl
HN' O^N
R1 I
X2 I'
L
Целевые соединения были очищены перекристаллизацией из 2-пропанола. Химическое строение полупродуктов и конечных веществ доказано методом ПМР-спектроскопии.
Противовирусные свойства синтезированных соединений in vitro в отношении ВИЧ-1 были изучены в ImQuest Bioscience Inc. (Мериленд, США). Исследование анти-ВИЧ-1 активности in vitro проводили в культуре CEM-SS-клеток, которые суспендировали в культуральной среде в количестве 105 клеток/мл и инфицировали ВИЧ-1 (штамм HTLV-ШВ) при мультипликации инфекции, равной 0,2. Немедленно после инфицирования вирусом вносили растворы, содержащие различные концентрации исследуемого вещества в ДМСО, и инкубировали в течение 4 суток при температуре 37 °С. Число живых клеток устанавливали по окончании инкубации при помощи бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолия, при этом определяли концентрацию вещества, которая на 50% защищала CEM-SS-клетки от цитопатического эффекта ВИЧ-1 (ЕС50).
Цитотоксичность соединений изучали параллельно в неинфицированных культурах клеток, при этом определяли концентрацию вещества, которая на 50% уменьшала количество живых CEM-SS-клеток (СС50). Расчетным путем определяли индекс селективности, являющийся отношением цитотоксической концентрации к ингибиторной концентрации: SI= CC50 /EC50 [6].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе работы были синтезированы новые производные 1 -(бензилоксиметил)-5-(ариламино)урацила, представленные в таблице.
2
H2O
R
O
Y
R
O
R
2
O
O
R
R
R
3
2
PhMe
Структура и физико-химические свойства синтезированных соединений
Соединение R1 R2 R3 X Y Брутто-формула Т. пл., оС Выход, %
1 Н - СН3 связь связь C2QH21N3Ü3 119-122 60
2 СН3 - Н СН2 - C2QH21N3Ü3 103-105 86
3 Н СН3 Н СН - C2GH21N303 194-197 87
4 Н С3Н7 Н СН - c22h25n3o3 47
5 Н - СН3 СН2 - c21h23n3o3 126-129 62
6* СН3 СН3 Н СН - C21H24ClN3O3 162-163 28
7 СН3 - Н СН2 СН2 C21H23N3O3 136-139 79
* - соединение 6 выделено в виде гидрохлорида.
В результате исследования анти-ВИЧ-1 активности было установлено, что в ряду 1-(бен-зилоксиметил)-5-(фениламино)урацила введение ме-тильных групп в ариламинный фрагмент значительно повышает эффективную концентрацию до величины ЕС50 > 100 цМ с одновременным понижением цитотоксического порога СС50 = 40,3 цМ (соединение 1) в сравнении с исходным 1-(бензилоксиметил)-5-(фениламино)урацилом (ЕС50 = 88,5 цМ; СС50 > 100 ЦМ) [3].
Наоборот, в ряду 1-(бензилоксиметил)-5-(бен-зиламино)урацила введение дополнительных ме-тильных групп в ариламинный фрагмент на порядок понижает эффективную концентрацию (для соединений 2 и 3 значения ЕС50=6,1 и 8,4 цМ соответственно) с сохранением низкой цитотоксичности (СС50 > 100 цМ для обоих веществ), а для соединения 5 этого ряда эффективная концентрация снизилась на два порядка и составила ЕС50 = 0,7 цМ при значительно меньшем увеличении цитотоксичности (СС50 = 43,1 цМ). Было отмечено, что введение пропильного фрагмента (соединение 4) значительно повышало эффективную и понижало цитотоксическую концентрации (ЕС50 > 100 цМ и СС50 = 19,0 цМ), т. е. ухудшало антивирусные свойства соединения.
В ряду соединений ряда 1-(бензилоксиметил)-5-(фенетиламино)-урацила дополнительное метилирование также оказывает существенное влияние на величину эффективной и цитотоксической концентраций, при этом введение метильной группы к экзо-циклическому атому азота усиливает противовирусный эффект более чем в 4 раза (соединение 7) - Ес50
УДК 615.3:001:616-052
= 19,9 цМ и СС50 >100 цМ. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, наиболее выраженные антивирусные свойства в отношении ВИЧ-1 in vitro продемонстрировал 1 -(бензилоксиметил) -5-(3,5-диметилбензиламино)урацил с величиной эффективной концентрации 0,7 цМ, который может служить основой для дальнейшей структурной модификации с целью поиска новых высокоактивных анти-ВИЧ-1 агентов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Озеров А.А., НовиковМ.С. // Вестн. ВолГМУ. - 1999.
- Т. 55, Вып. 5. - С. 44-46.
2. Озеров А.А., Новиков М.С., Брель А.К. // Современные проблемы фармацевтической науки и практики. - М., 1999.- Ч. 2.- С. 75-79.
3. Озеров, А.А., Новиков М.С., Брель А.К. и др. // Химия гетероциклических соединений. -1998. - Вып. 5. - С. 691-697.
4. Озеров А.А., Новиков М.С., Лобачев А.А., Гнатюк В.П., Букхайт Р.У. // Бюлл. ВНЦ РАМН и АВО. - 2004. -№ 1.- С. 26-28.
5. BuckheitR.W. et al. // Antimicrob. Agents Chemother.
- 2001. - Vol. 45. - P. 393-400.
6. Buckheit R.W., White E.L., Fliakas-Boltz V., et al. // Antimicrob. Agents Chemoter. - 1999. - Vol. 43. - P. 18271834.
7. Louie J.K., Hsu L.C., Osmond D.H., et al. // J. Infect. Dis. -2002. - Vol. 186, № 7.-P. 1023-1027.
8. Nishimura T., Shimizu B., Iwai I. // Chem. Pharm. Bull.
- 1963.-Vol. 11, № 11.-P. 1470-1472.
© Коллектив авторов, 2006
ИНФОРМИРОВАННОСТЬ ПАЦИЕНТОВ О КОНФЛИКТЕ ИНТЕРЕСОВ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
В.Л. Аджиенко
Кафедра клинической фармакологии и интенсивной терапии с курсами клинической фармакологии, клинической аллергологии, восстановительной терапии и курортологии ФУВ ВолГМУ
Сложность набора испытуемых в клинические исследования (КИ) лекарственных средств (ЛС) является распространенной проблемой, стоящей в од-
ном ряду с важнейшими вызовами современной биоэтики и фармакологии [2]. При ее решении затрагиваются вопросы информированного согласия на уча-
