CC BY
71
Физико-химическая биология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2011, № 2 (2), с. 190-195
УДК 57.043 577.334 533.9...15 576.311.342.2
ВЛИЯНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ГАЗОРАЗРЯДНОЙ ПЛАЗМЫ НА РЕЗИСТЕНТНОСТЬ МЕМБРАН КЛЕТОК
© 2011 г. И.П. Иванова 1 2, С.В. Трофимова 1, И.М. Пискарёв 3, Д.И. Князев 2,
А.В. Тимуш 1, О.Е. Бурхина 1, Л.Г. Литвинова 2
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
2 Нижегородская государственная медицинская академия
3 НИИ ядерной физики им. Д.В. Скобельцына МГУ им. М.В. Ломоносова
гуапоуа. 1р@таП. ги
Поступила в редакцию 02.06.2011
Изучено влияние излучения газоразрядной низкотемпературной плазмы на резистентность эритроцитов. Показано, что основной действующий фактор излучения низкотемпературной плазмы - коротковолновый ультрафиолет. С увеличением времени воздействия излучения на воду и физиологический раствор снижается рН, накапливаются пероксид водорода и другие окислители. Резистентность клеток возрастает после кратковременного воздействия и снижается при увеличении времени воздействия.
Ключевые слова: излучение низкотемпературной газоразрядной плазмы, ультрафиолетовое излучение, активные формы кислорода, резистентность, эритроциты.
Введение
Только несколько десятилетий назад, благодаря новейшим технологиям, появилась возможность исследовать влияние холодной плазмы на биологические объекты. В последние 5 лет исследователи Америки, Японии, Европы и России активно изучают влияние плазмы на эукариотические, прокариотические клетки и ткани организма [1]. Известны бактерицидный и цитотоксический эффекты низкотемпературной плазмы, однако механизм действия практически не изучен [2-7].
К настоящему времени накоплен большой экспериментальный материал по участию активных форм кислорода в плазмохимических процессах, однако плазмохимия биологических субстратов практически не изучена [8].
Во время генерации импульсных разрядов образуются фотоны с высокими энергией и скоростью, являющиеся основными участниками процессов ионизации, диссоциации и рекомбинации молекул [9-11].
Концентрация радикальных продуктов имеет важное значение как для инициирования, так и для ингибирования свободнорадикальных процессов [12-14] и определяет структурнофункциональное состояние клеток [15].
Поэтому исследование структурно-функционального состояния мембран клеток, а также качественного и количественного состава радикальных продуктов в модельных растворах после воздействия излучением низкотемпературной газоразрядной плазмы является актуальным.
Цель работы - оценка основного действующего фактора, анализ качественного и количественного состава радикальных продуктов в модельных растворах и исследование резистентности мембран эритроцитов после воздействия излучением низкотемпературной газоразрядной плазмы.
Экспериментальная часть
В работе использовалось экспериментальное устройство, генерирующее низкотемпературную плазму с уникальной плотностью частиц до 1022 (см2с)-1, которая не встречается в зарубежных аналогах. Устройство разработано в ФГУП РФЯЦ Всероссийского НИИ экспериментальной физики (г. Саров). Энергия, подводимая к разрядному промежутку, 5 Дж в 1 импульсе, длительность импульса 1-10 микросекунд, частота повторения импульсов 1 Гц. Полный поток излучения 75 кВт/м2 распределялся по диа-
пазонам излучения в следующих пропорциях: ультрафиолетовый диапазон (310-380 нм.) -17% от полного потока излучения; видимый диапазон (600-700 нм.) - 49%; инфракрасный диапазон (более 700 нм.) - 33% [16]. Обрабатываемая жидкость или суспензия клеток объемом
4 мл помещалась в чашку диаметром 4 см, толщина слоя порядка 3.6 мм. Расстояние до области разряда 3-4 см. Для определения основного действующего спектрального диапазона излучения плазмы выход активных продуктов исследовали в трёх режимах обработки: без фильтра; фильтры с нижней полосой пропускания 18З и 276 нм. Время обработки варьировали от б до 600 секунд. В качестве обрабатываемых жидкостей использовали дистиллированную воду и 0.9%-ный раствор NaCl. В обработанных жидкостях определяли рН, содержание пероксида водорода и окислителей (в первую очередь озона). Величину рН измеряли рН-метром рН-1З0М (г. Гомель). Содержание пероксида водорода оценивали титрованием 0.00З н раствором перманганата калия при температуре 600С в кислой среде. Содержание окислителей (озона) определяли добавлением в обработанный раствор З% KI с последующим титрованием Q.Q318 н тиосульфатом натрия [17]. Структурно-функциональное состояние мембран клеток после воздействия излучением низкотемпературной газоразрядной плазмы оценивали по внеклеточной концентрации гемоглобина. Для исследования готовили суспензию эритроцитов в растворе Хенкса 1:400. Время обработки варьировали от 10 до 300 секунд. Структурнофункциональное состояние мембран клеток оценивали по уровню внеклеточного гемоглобина с помощью набора «Гемоглобин-агат». Измерения проводили на спектрофлуориметре флюорат-02 ПАНОРАМА (г. С.-Петербург) при длине волны З40 нм [18].
Данные, полученные в эксперименте, были обработаны статистически с помощью пакетов прикладных программ EXCEL, Statistica-6.Q. Результаты представлены в виде М±т, где М -среднее арифметическое, m - ошибка среднего. Статистическая значимость различий средних определялась по критерию Манна - Уитни.
Результаты и их обсуждение
Согласно литературным данным, основной вклад в цитотоксический эффект вносит УФ-излучение [19], но какая область его спектра (длинноволновая или коротковолновая) играет главную роль - неизвестно. В связи с этим, на первом этапе эксперимента для определения
основного действующего спектрального диапазона излучения плазмы использовали фильтры, отсекающие длинноволновую и коротковолновую часть ультрафиолетового спектра (фильтры с нижней полосой пропускания 185 и 275 нм).
После воздействия на дистиллированную воду излучением низкотемпературной газоразрядной плазмы длинноволновой областью спектра ультрафиолета (полоса пропускания 275 нм) изменения уровня рН не наблюдалось. После воздействия излучением без фильтра и коротковолновой областью спектра ультрафиолета (полоса пропускания 185 нм) в течение минуты и более наблюдалось постепенное снижение уровня рН на 25-55% и 49-51% соответственно (табл. 1). Вероятно, изменение рН обусловлено как окислительно-восстановительными процессами, так и подкислением под действием оксидов азота, образующихся в зоне плазмы с дальнейшим растворением в жидкой фазе [20] .
Оценка накопления окислителей и в том числе пероксида водорода в дистиллированной воде после воздействия излучением низкотемпературной газоразрядной плазмы в различных режимах показала, что воздействие длинноволновой областью спектра ультрафиолета вызывает незначительное накопление окислителей (табл. 2, 3). После обработки излучением без фильтра в течение минуты наблюдается накопление окислителей, а после обработки воды через фильтр с полосой пропускания до 185 нм окислители накапливаются только после обработки в течение 5 минут (табл. 2). Показано, что накопление пероксида водорода в воде после обработки излучением без фильтра и коротковолновой областью ультрафиолета происходит постепенно по мере увеличения времени воздействия, но к 600 секундам относительная концентрация пероксида водорода в воде после обработки через фильтр на порядок меньше (табл. 3).
Все биологические жидкости, внеклеточные и внуртриклеточные среды являются системами, содержащими хлористый натрий, поэтому представляло интерес провести аналогичную серию исследований для раствора хлорида натрия, так как за счёт присутствия дополнительных ионов в растворе возможно более интенсивное протекание цепных процессов [21]. Изменения показателя рН в растворе хлорида натрия после воздействия излучением низкотемпературной газоразрядной плазмы в различных режимах были такими же, как в дистиллированной воде (табл. 1). Накопление окислителей и пероксида водорода в растворе хлорида натрия после обработки излучением без фильтра и ко-
Таблица 1
Значения рН дистиллированной воды и раствора хлорида натрия после воздействия излучениием низкотемпературной газоразрядной плазмы
Время воздействия Водородный показатель pH
Дистиллированная вода Раствор хлорида натрия
без фильтра фильтр до 275 нм фильтр до 185 нм без фильтра фильтр до 275нм фильтр до 185 нм
Без воздействия 6.275±0.02 6.275±0.02 6.275±0.02 6.46±0.07 6.46±0.07 6.46±0.07
5 сек 6.226±0.03 6.31±0.09 6.39±0.02 5.83±0.1 5.86±0.22 6.07±0.045
10 сек 6.256±0.07 6.33±0.06 6.21±0.08 5.8±0.06 5.97±0.1 5.99±0.08
15 сек 6.2±0.04 6.39±0.04 6.14±0.06 5.6±0.06 5.94±0.065 5.96±0.05
30 сек 5.9±0.06 6.39±0.07 6.09±0.08 4.9±0.08* 5.99±0.07 5.65±0.1
60 сек 4.73±0.18* 6.39±0.09 5.75±0.11 4.2±0.1* 5.96±0.08 4.65±0.1*
300 сек 2.99±0.018* 6.27±0.03 3.19±0.07* 3.3±0.03* 5.98±0.065 3.5±0.02*
600 сек 2.81±0.018* 6.32±0.04 3.07±0.09* 3.1±0.02* 5.97±0.08 3.3±0.03*
* Статистически значимо по сравнению с контрольной необработанной серией,р < 0.05.
Таблица 2
Оценка образования окислителей в дистиллированной воде и растворе хлорида натрия после воздействия излучением низкотемпературной газоразрядной плазмы по результатам йодометрического титрования
Время воздействия Дистиллированная вода Раствор хлорида натрия
без фильтра фильтр до 275 нм фильтр до 185 нм без фильтра фильтр до 275 нм фильтр до 185 нм
Количество тиосульфата натрия, мкл
Без воздействия 0 0 0 0 0 0
5 сек 0 0 0 0 0 0
10 сек 0 0 0 0 0 0
15 сек 0 0 0 0 0 0
30 сек 0 0 0 35±5 0 0
60 сек 20±0 0 0 102±5* 0 10±0
300 сек 51±3.6* 0 58±3 131±19* 0 137.5±25*
600 сек 92±4* 0 86±9* 697±45* 0 650±19*
Таблица 3
Концентрация перекиси водорода в дистиллированной воде и растворе хлорида натрия после воздействия низкотемпературной газоразрядной плазмы
Время воздействия Дистиллированная вода Раствор хлорида натрия
без фильтра фильтр до 275нм фильтр до 185 нм без фильтра фильтр до 275 нм фильтр до 185 нм
Количество перманганата калия, мкл
Без воздействия 4±0 4±0 4±0 2±0 2±0 2±0
5 сек 7±0.3* 4±0 6±0.4* 8±0.18* 2±0 3±0
10 сек 9±0.18* 4±0 8±0.2* 10±0 2±0 3±0.06*
15 сек 11±0.4* 4±0 8±0.25* 12±0.25* 2±0 3±0.14*
30 сек 15±0 4±0 8±0.5* 15±0 2±0 6±0.28*
60 сек 20±0 4±0 10±0.6* 21±1.25* 2±0 10±0
300 сек 51±3.6* 4±0 15±0 50±2.7* 2±0 34±1.9*
600 сек 211±12* 7±0.36* 23±4* 254±27* 6±0.36* 112±3.6*
ротковолновой областью ультрафиолета было но с тем, что в растворе хлорида натрия помимо значительно выше, чем в дистиллированной воде озона возможно образование ионов СЮ'", тоже (табл. 2, 3). Можно предположить, что это связа- являющихся окислителями [22].
0,25
СЗ
X
X
ю
о
*
5
Я
еЗ
Л
Н
X
0,2
0,15
0,1
*
б/в 10 25 50 100 300
Время воздействия, сек
Рис. Концентрация внеклеточного гемоглобина после обработки эритроцитов излучением низкотемпературной газоразрядной плазмы. * - статистически значимо по сравнению с контрольной необработанной серией, р < 0.05
0
Наибольший эффект накопления активных форм кислорода в растворах наблюдается после облучения без фильтра, хотя фильтр с полосой пропускания X > 185 нм обеспечивает те же спектральные характеристики, что и воздух. Это означает, что ускоренные частицы излучения также играют важную роль. Время разряда и высвечивание излучения составляет 10 6 секунды. Ударная волна достигает поверхности обрабатываемой жидкости примерно через 10-4 секунды (скорость звука примерно 300 м/с). То есть на активацию первичных свободнорадикальных реакций в жидкости ускоренные частицы влиять не могут. Однако они будут влиять на вторичные реакции. Таким образом, можно считать установленным, что основным действующим фактором излучения низкотемпературной газоразрядной плазмы, генерируемой используемым в данной работе устройством, является жёсткое УФ-излучение с длинами волн, близкими вакуумному ультрафиолету.
Увеличение концентрации активных форм кислорода может приводить к активации пере-кисного окисления липидов, увеличению числа пор в мембране эритроцитов, лизису клеток и накоплению внеклеточной концентрации гемоглобина [23-25]. После воздействия излучением низкотемпературной газоразрядной плазмы на эритроциты беспородных крыс в течение 10 и 25 секунд наблюдалось снижение концентрации внеклеточного гемоглобина на 62 и 42% соответственно, что свидетельствует о повышении резистентности эритроцитов. При более длительном воздействии (50, 100, 300 секунд)
наблюдалось повышении концентрации внеклеточного гемоглобина на 39-69%, то есть резистентность эритроцитов снижалась (рисунок). Вероятно, при кратковременном воздействии образуется незначительное количество окислителей и клетка успевает адаптироваться и активировать системы антиоксидантной защиты, а с увеличением времени воздействия происходит значительное накопление окислителей и, в частности, пероксида водорода, которые и снижают резистентность мембран эритроцитов.
Выводы
1. Основной вклад в накопление окислителей и пероксида водорода в растворах вносит коротковолновая область УФ-излучения низкотемпературной газоразрядной плазмы.
2. После воздействия излучением низкотемпературной газоразрядной плазмы уровень рН в изученных растворах постепенно снижается с увеличением времени воздействия.
3. Окислители в воде и физиологическом растворе накапливаются после воздействия излучением низкотемпературной газоразрядной плазмы в течение минуты и более.
4. Концентрация пероксида водорода в воде и физиологическом растворе постепенно увеличивается по мере возрастания времени воздействия излучением плазмы.
5. Резистентность мембран эритроцитов возрастает после кратковременного воздействия и снижается при увеличении времени воздействия излучением газоразрядной плазмы.
Список литературы
1. Kong M. G., Kroesen G., Morfill G., Nosen-ko T. et al. Plasma Medicine: An Introductory Review // New J. Physics. 2009. V. 11. Р. 35. URL: htt://iop-science. iop.org/1367-2003/11/11/115012
2. Deng X.T., Shi J. and Kong M.G. Physical mechanisms of inactivation of Bacillus subtilis spores using cold atmospheric plasmas // IEEE Trans. Plasma Sci. 2006. V. 34. P. 1310-1316.
3. Vleugels M., Shama G., Deng X.T. et al. Atmospheric plasma inactivation of biofilm-forming bacteria for food safety control // IEEE Trans. Plasma Sci. 2005. V. 33. P. 824-828.
4. Sladek R.E.J, Filoche S.K., Sissons C.H. and Stoffels E. Treatment of Streptococcus mutants biofilms with a nonthermal atmospheric plasma // Lett. Appl. Microbiol. 2002. V. 45. P. 318-323.
5. Schoenbach K. H. The effect of pulsed electrical fields on biological cells // Abstr. 10th IEEE Intern. Pulsed Power Conference, Albuquerque, New Mexico, USA, July 3-6, 1995. P. 85-90.
6. Schoenbach K.H., Peterkin F.E. et al. Effect of pulsed electric fields on micro-organizms: experiments and applications // Abstr. 10th IEEE Intern. Pulsed Power Conference, Albuquerque, New Mexico, USA, July 3-6, 1995. P. 25-30.
7. Иванова И.П., Заславская М.И, Спиров Г.М., Шлёпкин С.И. Бактерицидные свойства высоко-энер-гетических импульсных разрядов // Высокоинтенсивные физические факторы в биологии, медицине, сельском хозяйстве и экологии. Са-ров, 2005. С. 144-148.
8. Fridman A. Plasma Chemistry. N.Y.: Cambridge University Press., 2008. 978 p.
9. Райзер Ю.П. Физика газового разряда. М.: Наука, 1992. 536 с.
10. Базелян Э.М., Райзер Ю.П. Искровой Разряд. М.: МФТИ, 1997. 317 с.
11. Бугаенко Л.Т., Кузьмин М.Г., Полак Л.С. Химия высоких энергий. М.: Химия, 1988. 365 с.
12. Верещагин И.П. Высоковольтные электротехнологии. Учебное пособие по курсу «Основы электротехнологии». М.: МЭИ, 1999. 204 с.
13. Пискарёв И.М. Теоретические основы химической технологии. М.: Изд-во МГУ, 2000. 34 с.
14. Пискарёв И.М. Окислительно-восстановительные процессы в воде, инициированные электри-
ческим разрядом над ее поверхностью // Журн. общей химии. 2001. Т. 71. Вып. 10. С. 1622-1623.
15. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. 252 с.
16. Спиров Г.М., Шлёпкин С.И, Волков А.А. и др. Импульсные устройства для генерирования светового и ультрафиолетового излучений // Труды меж дун. конф. «Высокоинтенсивные физические факторы в биологии, медицине, сельском хозяйстве и экологии», Саров, 26-28 апреля 2004 г. С. 244-250.
17. Харитонов Ю.А. Аналитическая химия (аналитика). Количественный анализ. Физико-химические методы анализа. Кн. 2. М.: Высшая школа, 2003. 559 с.
18. Гиттельзон А.И., Терсков В.Н. Факторы, влияющие на стойкость эритроцитов в кровяном русле // Вопросы биохимии, биофизики и патологии эритроцитов. Новосибирск, 1962. С. 342.
19. Иванова И.П., Заславская М.И. Биоцидный эффект некогерентного импульсного излучения искрового разряда в экспериментах in vitro и in vivo // Современные технологии в медицине. 2009. № 1. С. 28-31.
20. Кузьмичева Л.А. Плазмоинициируемые окислительно-восстановительные процессы в растворах неорганических электролитов. Автореферат дис. ... канд. хим. наук. Иваново, 2005. 20 с.
21. Сараева В.В. Развитие радиационной химии в России. Вехи истории. 2005. 114 с. http://rap.chem. msu.ru/doc/Historyofradiationchemestry.pdf
22. Кутьин А.М., Поляков С.В., Лобанов А.С., Чурбанов М.Ф. Окисление хлоридов теллура и вольфрама в ёмкостном высокочастотном разряде и его анализ на основе неравновесной химической модели плазмы // Вестник Нижегородского университета им.
Н.И. Лобачевского. 2010. № 1. С. 99-107.
23. Ravindra P. Joshi, Qin Hu. Analysis of cell membrane permeabilization mechanics and pore shape due to ultrashort electrical pulsing // Med. Biol. Eng. Comput. 2010. V. 48. P. 837-844.
24. Kolb J.F., Kono S., Schoenbach K.H. Nanosernnd Pulsed Electric Field Generators for the Study of Subcel-lular Effects // Bioelectromagnetics. 2006. V. 27. P. 172178.
25. Weaver J.C. Electroporation of Biological Membranes from Multicellular to Nano Scales // IEEE Transactions on Dielectrics and Electrical Insulation. 2003. V. 10. P. 754-768.
THE EFFECT OF ACTIVE FORMS OF OXYGEN OF LOW-TEMPERATURE GAS-DISCHARGE PLASMA ON THE RESISTANCE OF CELL MEMBRANES
I.P. Ivanova, S. V. Trofimova, I.M. Piskarev, D.I. Knyazev, A. V. Timush,
O.E. Burkhina, L.G. Litvinova
The influence of radiation of low-temperature gas-discharge plasma on the resistance of erythrocytes has been studied. Shortwave ultraviolet light has been shown to be the main acting factor of the low-temperature plasma radiation. With increasing exposure time of radiation on water and saline, pH decreases, hydrogen peroxide and other oxidants accumulate. Cell resistance increases after short-term exposure and decreases with increasing exposure time.
Keywords: radiation of low-temperature gas-discharge plasma, ultraviolet radiation, active forms of oxygen, resistance, erythrocytes.
