ВЛИЯНИЕ АФОБАЗОЛА НА ЭМБРИОНАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ ПОТОМСТВА У КРЫС, ПОДВЕРГНУТЫХ ВОЗДЕЙСТВИЮ ТАБАЧНОГО ДЫМА Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 615.03

Влияние афобазола на эмбриональное развитие потомства у крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма

Соломина А. С., Жуков В. Н., Дурнев А. Д., Середенин С. Б.

НИИ Фармакологии им В. В. Закусова РАМН, г. Москва

Белых нелинейных крыс подвергали ежедневному воздействию табачного дыма (4 сигареты, содержащие 13 мг смол и 1 мг никотина на объем 72 куб. дм, 20 мин) per se или в сочетании с анксиолитиком афобазолом с 1-го по 20-й день беременности. В результате экспозиции табачным дымом наблюдали снижение прироста массы тела у беременных самок, увеличение постимплантационной гибели, уменьшение кранио-каудального размера и

массы тела плодов, увеличение у них числа гематом и кровоизлияний, замедление оссификации, а также диспла-стические изменения хрящевой ткани. Введение афобазола (1 и 10 мг/кг вну-трижелудочно) приводило к значимому снижению неблагоприятного воздействия табачного дыма на эмбриональное развитие крыс.

Ключевые слова: табачный дым, пренатальное развитие, афобазол, кры-

Введение. Нарушение процесса внутриутробного развития, возникающее под действием ряда средовых факторов, негативно отражается на протекании беременности и на здоровье новорожденных. Одним из таких факторов является табачный дым, попадающий в организм матери в процессе активного или пассивного курения [1,2,3].

В экспериментальных и клинических исследованиях была показана репродуктивная токсичность табачного дыма, выражающаяся в замедлении общего развития, понижении веса и размеров тела новорожденных [4,5], нарушениях формирования опорно-двигательного аппарата [6,7].

Несмотря на широкую пропаганду вреда курения, от 11 до 36 % женщин не отказываются от пагубной привычки во время беременности, что определяет необходимость поиска средств фармакологической коррекции репро-токсических эффектов курения [8]. В этой связи, внимание привлекает современный анксиолитик афобазол, проявивший способность существенно уменьшать повреждающие эффекты химических тератогенов в эксперименте [9].

Целью настоящей работы явилась оценка влияния анксиолитика афоба-зола на эмбриональное развитие потомства крыс, подвергнутых систематическому воздействию табачного дыма во время беременности.

Материалы и методы исследования. Исследование проводили на самках нелинейных белых крыс массой 200-250 г. Животные содержались в условиях вивария НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН по 5 особей при 12-ти часовом световом режиме на стандартном брикетированном корме и со свободным доступом к

воде и пище.

Самцов и самок ссаживали попарно в отдельных клетках. День обнаружения сперматозоидов в вагинальных мазках крыс принимали за 1-й день беременности.

Животных с 1-го по 20-ый дни беременности подвергали принудительному содержанию в атмосфере табачного дыма, которая создавалась с помощью оригинальной установки в пластиковых камерах размерами 60х40х30 см.

В камеру помещали по 5 животных. Задымление камеры проводили путем последовательного вдувания в течение 5 мин табачного дыма от 4-х сигарет с фильтром, содержавших по 13 мг смолы и 1 мг никотина. После этого животных экспонировали в плотно закрытых камерах в течение 15 минут. Весь 20-минутный период экспозиции атмосфера в камерах постоянно перемешивалась внутренним вентилятором. Животных контрольной группы подвергали аналогичной процедуре, но без вдувания в камеры табачного дыма. По окончании каждого 20-минутного сеанса животных извлекали из камер и содержали в стандартных условиях вивария.

Афобазол в виде водного раствора в дозах 1 и 10 мг/кг вводили внутри-желудочно непосредственно перед процедурой принудительного обкуривания. Выбор доз афобазола основывался на результатах его предшествующих исследований [9].

Животных (10-14 особей в каждой группе) выводили из эксперимента путем дислокации шейных позвонков на 20-й день беременности. После вскрытия подсчитывали количество желтых тел в яичниках, число резорбций, погибших и живых плодов. Плоды тщательно осматривали на предмет выявления внешних анома-

лий развития, взвешивали, определяли пол и кранио-каудальный размер. Часть плодов фиксировали в растворе Буэна для проведения микроанатомического исследования состояния внутренних органов на серийных срезах через плод. Другую часть плодов фиксировали в 960 этиловом спирте с целью изучения состояния костной и хрящевой системы (метод П. Петерса) [11]; регистрировали аномалии развития костной системы, производили подсчет точек окостенения различных костей скелета (череп, конечности, ребра, грудина, кости таза, позвоночник), визуально оценивали дисплазию соединительной ткани. Все процедуры выполняли в соответствии с существующими стандартными протоколами [10] и «Правилами лабораторной практики» (Приказ МЗ РФ от 19 июня 2013 г. N 267).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием критериев Стьюдента ^-критерий), Пирсона (критерий X2), «Вероятностный калькулятор».

Результаты и обсуждение. Результаты, характеризующие влияние афо-базола на тератогенные эффекты и нарушения постнатального развития потомства крыс, подвергнутых систематическому воздействию табачного дыма в период беременности, представлены в таблицах 1-4.

У животных, подвергнутых воздействию табачного дыма, установлено значимое снижение суммарного прироста массы тела, как на отдельных этапах эксперимента, так и за весь период беременности, что совпадает с известными литературными данными [6,7]. Афобазол не оказал какого-либо влияния на изменения приросты массы тела обкуриваемых беременных животных (табл. 1).

Таблица 1

Влияние афобазола (АФ) на прирост массы беременных крыс, подвергнутых

воздействию табачного дыма (ТД)

Группа Средняя масса самок в 1 день беременности Дни беременности и прирост массы тела (г)

1-7 день 7-14 день 14-20 день 1-20 день

Контроль 280,6 ± 8,5 20,4 ± 1,7 29,1 ± 1,7 67,4 ± 2,6 111,6 ± 7,8

ТД 282,6 ± 5,1 8,8 ± 1,2* 25,4 ± 1,1 46,1 ± 4,4* 80,4 ± 5,0*

ТД+АФ 1 мг/кг 277,6 ± 6,1 9,9 ± 1,1* 22,0 ± 1,5* 46,6 ± 3,4* 78,5 ± 4,0*

ТД+АФ 10 мг/кг 280,6 ± 5,3 7,8 ± 1,4* 21,6 ± 1,6*х 49,9 ± 3,7* 77,5 ± 4,0*

Примечание. Здесь и в табл. 2,3,4: звездочка (*) - значимые различия (Р<0,05) по сравнению с контрольной группой, крестик (х) - с эффектом табачного дыма.

Данные, характеризующие эмбрио-токсические эффекты табачного дыма и влияние на них афобазола, представлены в таблице 2. Установлено, что плоды самок, подвергнутых принудительному обкуриванию, имеют значимо меньшие кранио-каудальные размеры в сравнении с контролем. Кроме того, в этой группе наблюдается появление мертвых плодов (2,2 %). Негативного влияния табачного дыма на размеры плодов не наблюдалось в группах животных, получавших афоба-зол, у них также не было зарегистрировано мертвых плодов.

При внешнем осмотре плодов контрольной группы животных было выявлено 13,1% плодов с гиперемиями, 5,5% плодов с гематомами и 26,2% плодов с кровоизлияниями. У самок, подвергнутых воздействию табачного дыма, было

обнаружено 14,6% плодов с гиперемиями, что не отличалось от контроля, и выявлено значимое увеличение количества плодов с гематомами (18,3%) и с кровоизлияниями (44,5%). В группах животных, обработанных афобазолом в дозах 1 и 10 мг/кг, выявили 13,8 и 14,4 % плодов с гиперемиями, соответственно. Эти показатели не отличались ни от контрольных значений, ни от значений в группе животных, подвергнутых обкуриванию. В свою очередь, количество плодов с гематомами или с кровоизлияниями, возникающих под действием табачного дыма, было под влиянием афобазола в дозе 1 мг/кг значимо редуцировано до 5,1 и 5,8 %, соответственно, а при его использовании препарата в дозе 10 мг/кг, соответственно, до 3,0 и 9,9 % .

При анализе аномалий внутренних

органов 69 плодов контрольной группы на серийных срезах расширение боковых желудочков мозга отмечено у 8,7% плодов, расширение среднего желудочка мозга выявлено у 13% плодов. Расширение обеих почечных лоханок у плодов контрольной группы составило 2,9%. Кровоизлияния в грудную полость обнаружены у 1,5% плодов.

При изучении состояния внутренних органов у 85 плодов, подвергнутых антенатальному воздействию табачного дыма, расширение боковых желудочков мозга наблюдалось у 15,3% плодов, расширение среднего желудочка мозга было отмечено у 29,4% плодов, что значимо превышает значения контроля. Кроме того, было выявлено значимое увеличение плодов с расширением обеих почечных лоханок (20%). Гидроце-

Таблица 2

Влияние афобазола (АФ) на эмбриональное развитие плодов крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма (ТД)

Группа Число желтых тел на 1 самку Число мест им-плантации на 1 самку Число живых плодов, абс. знач. Постим-плантационная гибель, % Средняя масса плодов, г Средний размер плодов, см Вес плаценты, г Аномалии плаценты, % Мертвые плоды, %

Контроль 13,75 ± 0,43 12,67 ± 0,38 145 4,21 2,40 ± 0,07 3,10 ± 0,02 0,59 ± 0,02 0 0

ТД 14,69 ± 0,40 11,62 ± 0,76 137 11 2,23 ± 0,04 2,98 ± 0,02* 0,56 ± 0,02 13,14* 2,19

ТД + АФ 1 мг/ кг 12,85 ± 0,41х 11,46 ± 0,58 138 7,64 2,29 ± 0,03 3,1 ± 0,01х 0,56 ± 0,01 1,45х 0

ТД + АФ 10 мг/кг 15,00 ± 0,36* 12,64 ± 0,24 132 5,09 2,19 ± 0,05* 3,07 ± 0,02х 0,56 ± 0,02 5,3*х 0

фалия была установлена у 5,9% плодов, кровоизлияния в различные полости тела (грудную, брюшную, малого таза) выявлены у 11,8% плодов, однако различия по сравнению с контролем в этих случаях не имели статистически значимого характера.

При обследовании 63 плодов от самок, получавших афобазол в дозе 1 мг/ кг, расширение боковых желудочков мозга наблюдалось у 1,6%, а в дозе 10 мг/ кг у 7,9% плодов. Расширение среднего желудочка мозга, обеих почечных лоханок, кровоизлияния в различные полости тела наблюдали у 20,6%, 9,5%, 6,3% и 25,4%, 6,3%, 1,6% плодов от самок, получавших афобазол в дозе 1 и 10 мг/кг, соответственно. Различия по сравнению с контролем во всех случаях были статистически недостоверны. Сравнение этих результатов с данными, полученными в группе животных, подвергнутых воздействию табачного дыма per se, выявило значимое уменьшение числа плодов

с расширениями боковых желудочков мозга, в группе животных, получавших афобазол в дозе 1 мг/кг. Остальные показатели не имели значимых различий.

Оценка воздействия табачного дыма на формирование костной системы плодов во внутриутробном периоде развития выявила значимое замедление ос-сификации по сравнению с данными, зарегистрированными в контрольной группе, которая характеризовалось полным отсутствием или уменьшением числа точек окостенения в области пястны и плюсны, тазовых костей, грудины и позвонков. Принципиально, что сходные эффекты табачного дыма ранее отмечались в независимых исследованиях [6,7]. Помимо этого, в нашем исследовании наблюдалось значительное расширение родничков и мозговых швов в краниальной области, ретардация или отсутствие затылочных костей. Введение афобазола в дозах 1 и 10 мг/кг беременным самкам крыс привело к значимому снижению

ретардационного действия табачного дыма относительно развития костной системы плодов (табл. 3).

В таблице 4 отражены результаты влияния афобазола в дозах 1 и 10 мг/кг на аномальное разрастание хрящевой ткани у плодов, индуцированное табачным дымом.

В группе животных, подвергнутых воздействию табачного дыма во время беременности, количество плодов с дис-пластическими изменениями в области левой и правой пястны составило 18% и 14,1%, а в области левой и правой плюсны - 20,5% и 23,1% , соответственно. Достоверное снижение количества плодов с данной патологией отмечено под действием афобазола в дозе 10 мг/кг; у плодов от самок крыс, обработанных афобазолом в дозе 1 мг/кг, не обнаружено диспластических изменений в области пястны и плюсны, что совпадает с данными контрольной группы.

Таким образом, в результате про-

Таблица 3

Регистрируемые показатели Контроль ТД ТД + АФ 1 мг/кг ТД + АФ 10 мг/кг

Количество исследованных эмбрионов (абс. знач.) 76 93 74 75

Правая пястна (число точек окостенения) 3,00 ± 0,02 2,46 ± 0,09* 2,86 ± 0,05*х 2,65 ± 0,08*

Левая пястна (число точек окостенения) 3,00 ± 0,01 2,47 ± 0,09* 2,88 ± 0,04*х 2,65 ± 0,07*

Правые тазовые кости 3 2,80 ± 0,05* 2,91 ± 0,03* 2,80 ± 0,05*

Левые тазовые кости 3 2,77 ± 0,05* 2,92 ± 0,03*х 2,85 ± 0,05*

Правая плюсна 3,21 ± 0,05 2,68 ± 0,08* 3,12 ± 0,06х 2,87 ± 0,08*

Влияние афобазола (АФ) на формирование костной системы эмбрионов крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма (ТД)

Регистрируемые показатели Контроль тд тД + АФ 1 мг/кг тд + АФ 10 мг/кг

Левая плюсна 3,21 ± 0,05 2,71 ± 0,08* 3,15 ± 0,06х 2,88 ± 0,08*

Грудина 3,58 ± 0,07 1,69 ± 0,15* 2,93 ± 0,12*х 2,37 ± 0,15*х

Гипоплазия ребра 0,03 ± 0,02 0,63 ± 0,05* 0,12 ± 0,04*х 0,47 ± 0,06*х

Позвонки 31,62 ± 0,08 29,11 ± 0,13* 30,92 ± 0,12*х 30,12 ± 0,15*х

Расширение переднего родничка, % 1,32 86,02* 16,22*х 40*х

Расширение мозговых швов, % 1,32 88,17* 22,97*х 57,33*х

Ретардация затылочной кости, % 0 68,82* 17,57*х 42,66*х

Отсутствие затылочной кости, % 0 15,05* 1,35х 10,67*

Таблица 4

Влияние афобазола (АФ) на аномальное разрастание хрящевой ткани у эмбрионов крыс,

подвергнутых воздействию табачного дыма (тД)

Группа Количество исследованных эмбрионов Верхняя правая пястна,% Верхняя левая пястна,% Нижняя правая плюсна,% Нижняя левая плюсна,%

Контроль 61 0 0 0 0

ТД 78 14,1* 17,95* 23,08* 20,51*

ТД + АФ 1 мг/кг 59 0х 0х 0х 0х

ТД + АФ 10 мг/ кг 60 0х 0х 1,67х 6,67*х

веденного исследования показано, что принудительное систематическое воздействие табачным дымом оказывает негативное влияние на беременных самок крыс, что выражается в снижении прироста массы животных на протяжении всего периода беременности, а также реализуется в увеличении постимплан-тационной гибели плодов, уменьшении кранио-каудальных размеров, массы тела, повышении числа гематом и кровоизлияний, появлении аномалий развития внутренних органов, замедлении оссификации и выявлении диспластиче-ских изменений хрящевой ткани. Полученные результаты согласуются с сообщениями о неблагоприятных эффектах курения на развитие костной системы плодов [6,7].

Афобазол продемонстрировал способность снижать токсическое действие табачного дыма на развитие плодов, что согласуется с данными, указывающими

на его антитератогенные свойства по отношению к некоторым химическим тератогенам [9]. Следует отметить, что защитные эффекты афобазола были несколько лучше выражены при его использовании в дозе 1 мг/кг, которая близка к рекомендованной максимальной суточной дозе (60 мг).

Полученные экспериментальные данные подтверждают способность табачного дыма нарушать процесс эмбрионального развития и указывают на снижение репродуктивной токсичности пассивного курения с помощью анк-сиолитика афобазола в использованной экспериментальной модели.

1 ^СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Wigle D.T., Arbuckle T.E., Turner M.C., Berube Maternal Nicotine Exposure on Neonatal Rat Bone: A., Yang Q., Liu S., Krewski D. Epidemiologic evidence Protective Effect of Pentoxifylline // Exp Biol Med, 2007, of relationships between reproductive and child health 232(3): 398 - 405. outcomes and environmental chemical contaminants // J 8. Coleman T. Recommendations for the use of Toxicol Environ Health B Crit Rev. 2008, 11(5-6): 373- pharmacological smoking cessation strategies in pregnant 517. women // CNS Drugs. 2007; 21(12):983-93 2. Rogers J.M. Tobacco and pregnancy // Reprod 9. Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Шредер О.В., Сере-Toxicol., 2009; 28(2):152-60. денин С.Б. Антимутагенные и антитератогенные свой- 3. Jauniaux E., Burton G.J. Morphological and ства афобазола// Экспериментальная и клиническая biological effects of maternal exposure to tobacco фармакология.- 2009.- т. 72.- № 1 - С. 46-51. smoke on the feto-placental unit. Early Hum Dev., 2007, 10. Смольникова Н. М., Любимов Б. И., Дурнев 83(11):699-706 А. Д., Скосырева А. М., Чиркова Е. М., Гуськова Т. А., 4. Janine E. Polifka, J. M. Friedman // Medical Голованова И. В., Сюбаев Р. Д., Верстакова О. Л. // Ме-genetics: 1. Clinical teratology in the age of genomics, тодические указания по изучению репродуктивной ток-Clinical Teratology, 2002; 167(3):265-273. сичности фармакологических веществ./ Руководство по 5. Melissa Herrmann, Katherine King, Michael экспериментальному (доклиническому) изучению но-Weitzman. Prenatal tobacco smoke and postnatal вых фармакологических веществ, Под редакцией Р. У. secondhand smoke exposure and child neurodevelopment Хабриева, М.,- 2005.- С. 87-100. // Therapeutics and toxicology, 2008; 20:184-190. 11. Peters, P. Method in prenatal toxicology [Текст]/ 6. Ed Nelson, Karin Jodscheit, Yuanjian Guo. Maternal P. Peters. - G. Tr. Publ.-Stuttgart, 1977.- Р. 153. passive smoking during pregnancy and fetal developmental toxicity. Part1: gross morphological effects // Human and Experimental Toxicology, 1999, 18:252-256. 7. S. Kurtoglu, T. Gunes, E. Koklu, O. Bastug, O. Canoz, M. Kula, F. Bastug, and I. Gunes. Influence of

Solomina A.S., Zhukov V.N., Durnev A.D., Seredenin S.B.

Impact of Afobasol on the embryonal development of the posterity of rats exposed to tobacco smoke

VV.Zakusov Institute of Pharmacology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

White outbred rats were daily exposed to tobacco smoke ( 4 cigarettes containing 13mg of resin and 1 mg of nikotine in a volume of 72 dm3, for 20 min) per se or jointly with anxiolytic Afobasol from 1st to 20th day of pregnancy. Effects after tobacco exposure were a decreased growth of the pregnant females body weight, increase in post-implantation death, reduced craniocaudal size and fetus body weight, increased number of hematomas and hemorrhages in fetuses, decelerated ossification and dysplastic changes in cartilaginous tissue as well. The administration of Afobasol ( 1 to 10 mg/kg per os) led to reduced adverse effects of tobacco smoke on the embryonal development of rats.

Материал поступил в редакцию 12.05.2010 г.