CC BY
91
34
ОЖИРЕНИЕ И МЕТАБОЛИЗМ 3'2010
Влияние w-3-полиненасыщенных жирных кислот на свободнорадикальные процессы и структурное состояние мембран эритроцитов у пациентов с метаболическим синдромом
Н.Н. Крайнова1, Н.И. Волкова2, Т.П. Попова1, М.С. Комурджанц2, В.В. Внуков1
1Южный Федеральный университет, Ростов-на-Дону ректор - профессор В.Г. Захаревич 2Ростовский государственный медицинский университет, ректор - профессор А.А. Сависько
Представлены данные об изменении чувствительности тканей к инсулину, характере изменений в системе антиоксиданты-прооксиданты и структурном состоянии мембран эритроцитов у 30 пациентов в возрасте от 20 до 58 лет с метаболическим синдромом на фоне приема препарата, содержащего ш-3-полиненасыщенные жирные кислоты. Выявлено повышение чувствительности тканей к инсулину, снижение активности свободнорадикального окисления, нормализация активности анти-оксидантных ферментов и стабилизация мембран эритроцитов через 3 месяца от начала приема омакора. Ключевые слова: метаболический синдром, омега-3-тлтенасъщежые жирные кислоты, чувствительность к инсулину, эритроциты.
This article presents data on tissue sensitivity to insulin, type of change in antioxidant-prooxidant system and membrane structure of erythrocytes in 30 patients from 20 to 58 years of age with metabolic syndrome who received a preparation of Ш-3 polyunsaturated fatty acids. After 3 months of treatment with omacor we revealed the increase in the tissue insulin sensitivity, lowering of the free radical activity, normalization of antioxidant enzyme activity and erythrocyte’s membranes stabilization. Key words: metabolic syndrome, omega-3, polyunsaturated fatty acids, insulin sensitivity, erythrocyte.
Сначала XX века в развитых странах мира широкое распространение получили заболевания, связанные с нарушением метаболизма, к числу которых относится метаболический синдром (МС). Необходимо подчеркнуть, что, несмотря на выраженный интерес к этой проблеме и довольно большое количество публикаций, посвященных теоретическим и практическим аспектам МС, создание клинических рекомендаций различными профессиональными обществами, до сих пор не существует единых диагностических и терапевтических подходов. Отчасти это вызвано недостаточным количеством знаний об этиологии и патогенезе МС, отчасти — многообразием клинических и патофизиологических проявлений этого заболевания.
Общеизвестно, что при МС наблюдаются нарушения углеводного, липидного обмена, образуются эндогенные патогены, возникает хроническое воспаление и эндотелиальная дисфункция [1]. В настоящее время активно ведутся поиски фармакологического вещества, которое бы влияло одномоментно на несколько звеньев патогенеза МС. К средствам, нормализующим липидный обмен, с недавнего времени стали относить ю-3-полиненасыщен-ные жирные кислоты (ю-3-ПНЖК). Помимо этого, ю-3-ПНЖК обладают рядом плейотропных эффектов. Так, они позитивно действуют на эндотелий за счет снижения экспрессии адгезивных молекул на его поверхности и в циркулирующей плазме, уменьшают продукцию тромбоцитарного фактора роста, потенцируют КО-зави-симую релаксацию эндотелия, усиливают антитромбоген-
ный потенциал цельной крови и сосудистой стенки и др. Известно также, что m-3-ПНЖК являются предшественниками преимущественно эйкозаноидов и других биологически активных веществ с противовоспалительными свойствами [2].
Ранее нами было показано, что у пациентов с МС без нарушения углеводного обмена наблюдаются изменения в системе «антиоксиданты — прооксиданты», которые выражаются в повышенной генерации активных кислородных метаболитов, усилении процессов ПОЛ на фоне компенсаторного увеличения активности антиоксидантных ферментов, а также изменения структуры эритроцитарной мембраны [3].
Цель настоящей работы — исследование интенсивности свободнорадикального окисления (СРО) и активности ан-тиоксидантной системы крови, а также структурного состояния мембран эритроцитов у пациентов с МС при лечении препаратом, содержащим m-3-ПНЖК (торговое название «Омакор»).
Материалы и методы
В исследование включено 30 пациентов обоего пола в возрасте от 20 до 58 лет, согласно критериям МС (IDF 2005 г.) и Национальным рекомендациям «Диагностика и лечение МС» (2007 г.): все пациенты имели ожирение (ИМТ&29,9) по абдоминальному типу (ОТ мужчин&94 см, ОТ женщин&80 см) и два дополнительных критерия. Оценку толерантности к углеводам осуществляли с помощью 2-часового перорального глюкозотолерантного теста
Таблица 1
Параметры спонтанной и Н2 и содержание продуктов ПОЛ в синдромом на фоне О2-люминол-индуцированной ХЛ крови пациентов с метаболическим лечения омакором M±o
Группа Пациенты с МС
Показатель доноров До лечения Через 3 мес.
n=20 n=30 n=30
Вспышка (Ь|) Н2О2-люминол-инду-цированной ХЛ, отн. ед. 37,9±2,9 68,5±2,2 р<0,001 42,8±3,1 р>0,05 р1<0,001
Максимальная светимость (Н) Н2О2-люминол-индуцированной 44,6±1,5 61,7±1,9 р<0,001 53,1±2,01 р<0,01
ХЛ, отн. ед. р1<0,001
Sm Н2О2-люминол-индуцирован-ной ХЛ за 5 мин., отн. ед. 168,3±10,9 252,9±13,6 р<0,001 193,9±3,3 р>0,05 р1<0,001
tg угла наклона Н2О2-люминол-ин-дуцированной ХЛ, отн. ед. 25,8±2,3 34,2±0,7 р<0,02 28,3±0,7 р>0,05 р1<0,001
ДК в плазме, нмоль/мг ОЛ 9,50±0,31 12,26±1,17 р<0,01 9,54±0,52 р>0,05 р1<0,05
ДК в гемолизате, нмоль/мг ОЛ 9,9±0,5 14,9±0,2 р<0,001 11,0±0,3 р>0,05
р1<0,001
МДА в плазме, нмоль/мл 23,88±0,67 29,80±1,09 р<0,001 25,08±1,0 р>0,05 р1<0,01
МДА в гемолизате, нмоль/мг НЬ 2,9±0,1 4,6±0,3 р<0,001 3,4±0,2 р<0,05 р1<0,01
ШО в плазме, ед. фл/мг ОЛ 0,55±0,02 0,54±0,02 р>0,05 0,49±0,02 р>0,05 р1>0,05
ШО в гемолизате, ед. фл/мг ОЛ 0,56±0,02 0,72±0,26 р<0,001 0,66±0,03 р<0,02 р1>0,05
Примечание. Здесь и в табл. 2-3: р - значимость изменений показателя по сравнению с группой доноров; р^ - значимость изменений показателя по сравнению с началом лечения.
(ПГТТ) по протоколу, предложенному ВОЗ (1985). Содержание глюкозы в капиллярной крови определяли глюкозооксидазным методом с помощью стандартного клинического набора («Ольвекс-диагностикум», Санкт-Петербург). Для оценки инсулинорезистентности (ИР) при проведении ПГТТ одномоментно определяли концентрацию глюкозы и иммунореактивного инсулина (ИРИ) в сыворотке крови с последующим расчетом индекса Caro (отношение концентрации глюкозы и концентрации ИРИ). При значении индекса менее 0,33 состояние расценивали как ИР [4]. Базальный и стимулированный глюкозой уровень ИРИ определяли иммуноферментным методом с помощью диагностического набора (DRG, Германия).
Пациенты с МС получали перорально в течение 3-х месяцев препарат, содержащий m-3-ПНЖК (Омакор), по 1 капсуле ежедневно. Все клинико-биохимические исследования проводили до начала лечения и через 3 месяца терапии. В качестве контроля обследовано 20 доноров соответствующего пола и возраста, худощавого телосложения
(ОТ мужчин<94 см, ОТ женщин<80 см), без вредных привычек.
Для изучения процессов СРО и антиоксидантной системы исследовали Н2О2-люминол-индуцированную хе-милюминесценцию (ХЛ) [5]. Интенсивность процессов пе-рекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли по содержанию первичных продуктов — диеновых конъюгатов (ДК) [6], вторичных — малонового диальдегида (МДА) по методике из [7] и конечных — шиффовых оснований (ШО) [8]. Количество общих липидов в хлороформном экстракте [9] плазмы крови и гемолизате определяли по цветной реакции с фосфованилиновым реактивом по методу Колба и Камышникова (1982) с помощью стандартного диагностического набора (ЭКОлаб, Россия).
Состояние ферментной антиоксидантной системы оценивали по активности супероксиддисмутазы (СОД) [10], каталазы [11] и церулоплазмина (ЦП) [12]. Структурное состояние мембран эритроцитов определяли с помощью флюоресцентного зонда пирена в суспензии эритроцитов [13]. Стабильность эритроцитарных мембран оценивали по содержанию внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ) в плазме гемоглобинцианидным методом Каракашова и Вичева (1973) и суммарной пероксидазной активности (СПА) (Покровский, 1969, в модификации Лукаша и др., 1996) [14]. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Віо^. Значимость различий между изучаемыми величинами определяли по 1-критерию Стьюдента. Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05, данные в тексте представлены в виде М+о (среднее ± стандартное отклонение).
Результаты
У пациентов с МС на фоне лечения омакором амплитуда быстрой вспышки (И) Н2О2-люминол-индуцированной ХЛ снижалась на 38% и значимо не отличалась от этой величины, измеренной у доноров. Максимальная светимость (Н) и светосумма (Вш) медленной вспышки снижались на 14 и 23%, скорость окисления липидов — на 17%. Амплитуда быстрой вспышки, светосумма медленной вспышки и скорость окисления липидов значимо не отличались от уровня, зарегистрированного у доноров (табл. 1).
Таким образом, в плазме крови больных МС интенсивность ХЛ на фоне лечения омакором по четырем показателям значимо снижалась, что свидетельствует об уменьшении интенсивности СРО в организме.
В результате проведенных исследований нами установлено, что по сравнению с периодом, предшествующим лечению, в плазме крови больных МС, содержание первичных (ДК) и вторичных (МДА) продуктов перекисного окисления снизилось на 22 и 16%. Эти параметры значимо не отличались от измеренных у доноров. Статистически значимого изменения концентрации конечных (ШО) продуктов ПОЛ не обнаружено при сравнении с группой доноров и с исходным фоном (табл. 1).
В эритроцитах прослеживалась аналогичная динамика. Через 3 месяца от начала приема препарата содержание ДК снижалось относительно исходного фона на 26%, МДА — на 26%, ШО — на 8%. При сравнении с группой доноров обнаружено, что концентрация первичных и конечных продуктов ПОЛ значимо не отличалась, тогда как уровень
35
ОЖИРЕНИЕ И МЕТАБОЛИЗМ 3'2010
36
ОЖИРЕНИЕ И МЕТАБОЛИЗМ 3'2010
Таблица 2
Активность антиоксидантных ферментов в крови пациентов с МС
на фоне лечения омакором 1У1±о
Группа Пациенты с МС
Показатель доноров До лечения Через 3 мес.
п=20 п=30 п=30
ЦП в плазме, мкмоль/л 1,34±0,03 2,10±0,05 р<0,001 1,81±0,11 р<0,001 р1<0,05
СОД в плазме (СУА), у.е./мин в мл плазмы 0,61±0,06 1,15±0,04 р<0,001 0,79±0,05 р>0,05 р1<0,001
СОД в гемолизате, у.е./мин в мг Hb 0,84±0,12 1,69±0,12 р<0,001 0,90±0,08 р>0,05 р1<0,001
Каталаза в плазме, нмоль Н2О2/мл 15,8±0,8 17,2±1,7 р>0,05 13,08±0,8 р<0,05 р1<0,05
Каталаза в гемолизате, нмоль Н2О2/мл 23,4±1,5 28,9±1,3 р<0,05 24,9±0,9 р>0,05 р1<0,05
МДА после лечения омакором превышал значения, обнаруженные у доноров на 17%.
Таким образом, на фоне терапии пациентов с МС препаратом, содержащим ю-3-ПНЖК (омакор), наблюдается снижение интенсивности СРО полиненасыщенных жирных кислот, выражающееся в снижении концентрации продуктов ПОЛ в большей степени в эритроцитах и в меньшей степени в плазме крови (табл. 1).
Сохранение равновесия между скоростью ПОЛ и активностью антиоксидантной системы — один из основных показателей гомеостаза, при этом первой линией антиради-кальной защиты являются антиоксидантные ферменты. В плазме крови пациентов с МС после лечения омакором, по сравнению с исходным фоном, наблюдалось снижение активности антиоксидантных ферментов: церулоплазмина на 14, СОД — на 31, каталазы — на 24%. При сравнении этих показателей с группой доноров установлено, что активность СОД значимо не отличалась, ЦП была выше, чем у доноров, на 26%, а каталазы ниже, чем у доноров, на 17%. В гемолизате эритроцитов активность СОД после лечения снижалась по отношению к исходному фону на 47%, каталазы — на 14%. Оба эти показателя статистически не отличались от таковых в группе доноров (табл. 2).
Таким образом, мы полагаем, что препарат, содержащий ю-3-ПНЖК (омакор), способствует нормализации свободнорадикального окисления у больных с МС, что проявляется в уменьшении количества продуктов пе-роксидации и параллельном снижении активности ан-тиоксидантных ферментов через 3 месяца от начала терапии.
При изучении одной из основных функций мембраны, потенциально влияющей на инсулиновую резистентность, было выявлено, что на фоне лечения омакором значимых изменений микровязкости липидного бислоя эритроцитов и текучести зон белок-липидных контактов не отмечалось. Гидрофобность внутренних областей мембраны возросла на 28% и значимо не отличалась от контроля. Степень погружения белков в липидный бислой после лечения сни-
Таблица 3
Структурное состояние мембран эритроцитов, уровни СПА и ВЭГ у пациентов с МС на фоне лечения омакором 1У1±а
Группа Пациенты с МС
Показатель доноров До лечения Через 3 мес.
п=20 п=30 п=30
Fэ/Fм(334) 0,68±0,02 0,60±0,03 р<0,05 0,63±0,03 р<0,05 р1>0,05
Fэ/Fм(282) 1,5±0,112 1,53±0,06 р>0,05 1,51±0,05 р>0,05 р1> 0,05
^72^393 (334) 1,90±0,06 1,48±0,03 р<0,001 1,89±0,04 р>0,05 р1<0,001
0,21±0,01 0,31±0,01 р<0,001 0,26±0,01 р<0,01 р1<0,001
^72^393 (282) 2,14±0,09 1,64±0,02 р<0,001 1,91±0,03 р>0,05 р1<0,001
СПА, ед. акт/мл 2,5±0,1 4,8±0,3 р<0,001 3,4±0,2 р<0,002 р1<0,01
ВЭГ, ммоль/л 1,4±0,1 2,8±0,25 р<0,001 1,9±0,1 р<0,001 р1<0,01
жалась на 16% относительно исходной, оставаясь выше, чем в группе доноров, на 24%. Через 3 месяца терапии ома-кором коэффициент полярности зоны белок-липидных контактов повышался на 17% и значимо не отличался от этого показателя в группе доноров. Таким образом, терапия омакором в течение трех месяцев приводила к нормализации изучаемых физико-химических свойств мембран эритроцитов.
Изменение физико-химических характеристик мембран неизбежно отражается на их стабильности. Обнаруженное нами снижение концентрации ВЭГ на 32 и СПА на 29% свидетельствует о стабилизации мембран эритроцитов после 3-месячного лечения омакором. Следует отметить, что при сравнении с группой доноров, после лечения у пациентов с МС концентрация ВЭГ была на 35% ниже, в то время как СПА превышала контроль на 36%.
Согласно современным представлениям, при МС происходит развитие системного противовоспалительного ответа [15]. Одной из целей такой реакции организма является создание неблагоприятной среды для патогенов путем освобождения оксидантов (перекиси водорода, гипохлорида и др.). В то же время активируется антиоксидантная система для защиты здоровых тканей от оксида-тивного поражения. По-видимому, этим и объясняется развитие оксидативного стресса у пациентов с МС, установленное в наших исследованиях. Необходимо учесть, что в случае продолжительного воспалительного ответа организму может быть причинен значительный вред, так как эта реакция сопровождается экспрессией фактора некроза опухолей-а (ТКР-а), интерлейкина-1 (^-1), интерлейкина-6 (^-6) и других провоспалительных цитокинов. Многие эффекты воспалительного ответа являются факто-
рами риска повышенной летальности при большинстве хронических болезней.
ю-3-жирные кислоты способны снижать интенсивность воспалительной реакции благодаря своему влиянию на продукцию цитокинов и эйкозаноидов, а также изменять структуру медиаторов липидной природы, выделяемых клеточной мембраной при воспалении. Поскольку ю-3-жирные кислоты включаются в фосфолипиды легче, чем ю-6-жирные кислоты, а последние легче, чем ю-9-жирные кислоты, результатом этого феномена могут быть как биофизические, так и биохимические изменения структуры биологических мембран. В наших исследованиях нормализация физико-химических характеристик эритроцитар-ных мембран, а также их стабилизация на фоне приема омакора, по-видимому, объясняется именно этим.
Провоспалительные цитокины способны усиливать экспрессию молекул адгезии на эндотелиальных клетках. ТКР-а и ^-1, образованные в воспаленной ткани, облегчают миграцию и направляют лейкоциты из внутрисосу-дистого пространства в очаг воспаления. Уменьшая ТКР-зависимую активацию молекул адгезии, ю-3-ПНЖК снижают экстравазацию лейкоцитов, что, по-видимому, является дополнительным фактором, приводящим к ослаб-
лению системного воспалительного ответа и, как следствие, снижению активности свободнорадикального окисления.
Снижение активности свободнорадикальных процессов параллельно с активностью антиоксидантных ферментов, а также позитивные изменения физико-химических характеристик эритроцитарных мембран, наблюдающиеся у пациентов с МС при лечении омакором, положительно коррелировали со степенью чувствительности тканей к инсулину. На фоне приема омакора происходило уменьшение инсулинорезистентности, что проявлялось в снижении ИРИ натощак на 40% и повышении индекса Саго натощак на 23%. Через 3 месяца от начала терапии омако-ром указанные показатели значимо не отличались от таковых, определенных в группе доноров.
Таким образом, прием препарата, содержащего ю-3-ПНЖК, в течение 3-х месяцев у пациентов с МС способствовал повышению чувствительности тканей к инсулину, снижению активности СРО, нормализации активности антиоксидантных ферментов, структурнофункциональных свойств эритроцитов и стабилизации их мембран. На наш взгляд, полученные в исследовании результаты открывают новые перспективы в лечении пациентов с МС.
Литература
1. Метаболический синдром / Под ред. чл.-корр. РАМН Г.Е. Ройтберга. М., 2007.
2. Kris-Etherton R. et al. Omega-3 Fatty Acids and Cardiovascular Disease. New Recomendations From the American Heart Association // Ateroscler. Thromb. Vasc. Biol. 2003. V. 23. P. 150-152.
3. Крайнова Н.Н., Попова Т.П., Сафроненко В.А., Волкова Н.И., Внуков В.В. Свободнорадикальные процессы и их регуляция, структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов при метаболическом синдроме // Известия ВУЗ Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2008. № 6. С. 74-77.
4. Caro J.F. Insulin resistance in obese and nonbese men // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1991. P. 7391-7395.
5. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. Свободные радикалы в живых системах. М., 1991.
6. Стальная И.Д. Современные методы в биохимии. М., 1977. С. 63-64.
7. Стальная И.Д., Горишвили Т.Г. Современные методы в биохимии. М., 1977.
8. Bidlack W.R., Tappel A.L. Fluorescent products of phospholipids during lipid peroxidation // Lipids. 1973. Vol. 68. № 4. Р. 203-209.
9. Bligh E.J., Dyer W.J. Rapid metods of total lipid extraction and purification // J. Biochem. Rhysiol. 1959. Vol. 37.№ 8. P. 911-917.
10. Сирота Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисму-тазы // Вопросы мед. химии. 1999. № 3. С.14-15.
11. Королюк М.А. и др. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. 1988. № 1. С.16-19.
12. Колб В.Г., Камышников В.С. Справочник по клинической химии. Минск, 1982.
13. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.В. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М., 1980.
14. Покровский А.А. Биохимические методы исследования в клинике. М., 1969.
15. Титов В.Н. Теория биологических функций и совершенствование диагностического процесса в клинической биохимии // Клин. лаб. диагностика. 2009. № 4. С. 3-14.
Крайнова Н.Н.
Волкова Н.И.
Попова Т.П.
Внуков В.В.
кандидат биологических наук, кафедра биохимии и микробиологии, биолого-почвенный
факультет, Южный Федеральный университет
344006, Ростов н/Д, Б. Садовая, 105
Тел.: (863) 255-79-13
Mоб.: +7 904-441-92-74
E-mail: kraynovann@mail.ru
доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой внутренних болезней № З,
Ростовский государственный медицинский университет
344022, Ростов н/Д, пер. Нахичеванский, 29
Тел.: (86З) 275-З0-69
E-mail: n_i_volkova@mail.ru
аспирантка, кафедра биохимии и микробиологии, биолого-почвенный факультет, Южный
Федеральный университет
344006, Ростов н/Д, Б. Садовая, 105
Тел.: (86З) 264-З8-50
E-mail: dean@bio.rsu.ru
доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии и микробиологии,
биолого-почвенный факультет, Южный Федеральный университет
344006, Ростов н/Д, Б. Садовая, 105
Тел.: (86З) 264-З8-50
E-mail: dean@bio.rsu.ru
37
ОЖИРЕНИЕ И МЕТАБОЛИЗМ 3'2010
