CC BY
15PHARMACEUTICAL SCIENCES
ВЛИЯНИЕ 14-О-БЕНЗОИЛТАЛАТИЗАМИНА НА СОКРАТИТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК АОРТЫ
Мирзаева Ю. Т.,
(PhD) старший научный сотрудник Институт биофизики и биохимии при НУУз
Усманов П.Б., д.б.н., проф.
Институт биофизики и биохимии при НУУз
Ботирова З.М.,
магистр
Национальный Университет Узбекистана Наджимова Х.К., (к.б.н) старший научный сотрудник-исследователь Институт биофизики и биохимии при НУУз
Режаббоева Н.Л., ассистент
Ташкентский государственный стоматологический институт
THE EFFECTS OF 14-0-ВENZ0ILTALATIZAMINE ON CONTRACTIVE ACTIVITY OF RAT
AORTA SMOOTH MUSCLE CELLS
Mirzayeva Yu.
Senior researcher (PhD) Institute of Biophysics and Biochemistry at the National University of Uzbekistan Usmanov P. D.B.S Professor Institute of Biophysics and Biochemistry at the National University of Uzbekistan
Botirova Z. Master
The National University of Uzbekistan Nadjimova H. Senior researcher Institute of Biophysics and Biochemistry at the National University of Uzbekistan Rejabboeva N. assistant
Tashkent State Dental Institute
Аннотация
Изучено влияние 14-О-бензоилталатизамина на сократительную активность гладыкомышечных клеток аорты крыс. Полученные результаты позволяют предположить, что 14-О-БТ эффективно расслабляет препараты аорты крысы предварительно сокращенные агонистом а-адренорецепторов фенлэфрином. Принимая во внимание то, что сокращения индуцируемые этим антагонистом в основном обусловлены активацией высвобождения ионов Са2+ из СР через IP3R можно заключить, что релаксантное действие исследуемого алкалоида обусловлено подавлением транспорта ионов Са2+ на уровне СР.
Abstract
The effect of 14-O-Benzoylthalatizamine on the contractive activity of rat aortic smooth muscle cells was studied. The results obtained suggest that 14-O-BT effectively relaxes the rat aorta preparations previously contracted by the а-adrenergic receptor agonist phenylephrine. Taking into account the fact that the contractions induced by this antagonist are mainly due to the activation of the release of Ca2+ ions from the SR through IP3R, it can be concluded that the relaxant effect of the studied alkaloid is due to the suppression of the transport of Ca2+ ions at the SR level.
Ключевые слова: гладкая мускулатура, cаркоплазматический ретикулум, аорта, фенилэфрин, Са2+ канал, 14-О-бензоилталатизамин, кофеин.
Keywords: smooth muscles, sarcoplazmic reticulum, aorta, phenylephrine, Ca2+ channel, 14-O-benzo-ylthalatizamine, caffeine.
Актуальность. Сердечно-сосудистые заболевания - одна из самых распространенных патологий и сегодня занимает одно из первых мест среди смертности и инвалидности населения развитых стран мира [1]. По современным данным, в развитии заболеваний сердечно-сосудистой системы, наблюдаются нарушения сократительной активности гладкомышечных клеток (ГМК), тонуса сосудов, транспорта ионов Са2 + [2.]. Поэтому одна из важнейших задач современной фармакологии и кардиологии - обеспечить поддержание нормального артериального давления и осветить механизмы регуляции тонуса сосудов.
Цель работы-изучение влияния 14-О-бензои-лталатизамина(14-0-БТ), производного дитерпено-идного алкалоида талатизамина, выделенного из растения Aconitum talassicum, на сократительную активность гладкомышечных клеток (ГМК) аорты крысы. Талатизамин, обладает выраженным антиаритмическим действием, которое определяется наличия в его структуре специфических функционально важных групп [3]. Так, замена ОН-группы у атома углерода С-14 ликоктонинового скелета талатизамина на бензоильную группу (рис.1), приводит к существенному возрастанию антиаритмической активности у 14-О-бензоилталатизамина [4].
+ нась
i;f HjCO
Рис. 1. Химическая структура дитерпеноиднного алкалоида 14-О-бензоилталатизамина
Методы исследования и материалы. В экспериментах использовались изолированные препараты гладкомышечных сегментов аорты белых беспородных крыс (200-250 г). Крысы забивались с помощью цервикальной дислокации, вскрывали грудную клетку, извлекали аорту и помещали ее в физиологический раствор Кребса, следующего состава (мМ): NaCl-120,4; КС1-5; NaHCO3-15,5; NaH2PO4-1,2; MgCI2-1,2; CaCI2-2,5; С6Н12О6-11,5; рН 7,4. Аорту очищали от жировой и соединительной ткани и нарезали на сегменты в виде колец шириной 3-4 мм. Отпрепарированный сегмент аорты помешали в специальную экспериментальную камеру объемом 5 мл, где с помощью серебряной проволоки фиксировали между штоком электромеханического преобразователя (FT.03, Grass, США) и основанием камеры. Экспериментальная камера перфузировалась оксигенированным карбо-геном (95%О2, 5% СО2) раствором Кребса при постоянной температуре 37°C. Перед экспериментом сегменты аорты предварительно растягивали нагрузкой 1г и промывали физиологическим раствором в течение 60 минут для достижения равновесия. Сокращения препаратов аорты вызывали внесением в экспериментальную камеру ФЭ (1 мкМ) или гиперкалиевым раствором (KCl, 50 мМ). В экспериментах также использовались бескальциевые растворы, для чего из раствора Кребса исключали ионы Са2+, а для связывания их следов добавляли ЭГТА (1 мМ). Сократительную активность препаратов аорты регистрировали с помощью усилителя PIIT (Grass, США) и самописца Endim 621,02 (Германия).
Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Origin Pro 7.5 (OriginLab
Corporation; США). При этом амплитуда сокращений выражалась в % от максимального сокращения (принятого за 100%), индуцированного фенил-эфрин (ФЭ) или гиперкалиевым раствором и рассчитывалась как среднее арифметическое значение для 4-5 различных экспериментов. Статистическую значимость различий между контрольными и опытными значениями определяли для ряда данных, используя парный t-тест. Значения р <0.05 указывают на статистически значимые различия.
Результаты и их обсуждение. Ранее нами было обнаружено, что дитерпеноидные алкалоиды талатизамин и 14-О-бензоилталатизамин эффективно расслабляют препараты аорты крысы предсо-кращенные норадреналином и гиперкалиевыми растворами [5]. В связи с этим, целью настоящей работы была дальнейшая характеристика механизма релаксантного действия 14-О-бензоилтала-тизамина.
Для дальнейшей характеристики механизма релаксантного действие 14-О-бензоилталатизамина нами были изучены его эффекты на сокращения препаратов аорты крысы, индуцируемые селективном агонистом а-адренорецепторов фенилэфри-ном, в развитии которых участвует ионы Са2+ поступающие в ГМК не только через потенциал-зависимые, но и через рецептор-управляемые Са2+-каналы, а также высвобождаемыми из саркоплазма-тического ретикулума (СР) [6,7]. В этих исследованиях нами было обнаружено, что 14-О-БТ и в условиях ФЭ-индуцированной контрактуры эффективно расслабляет препараты аорты крысы. При этом, релаксантный эффект 14-О-бензоилталатиза-мина также имел дозо-зависимый характер и при его концентрации 10 мкМ он вызвал расслабление
препарата аорты на 28,5±3,8%, а максимальное расслабление до 93,2 ±3,8 % наблюдалось при его концентрации 160 мкМ. Величина (концентрация воз. 50% максимального эффекта) ЕСЧ, 14-О-бензоилта-латизамина в этих условиях составляла 52,3±3,9% мкМ. Вместе с тем релаксантное действие 14-0-бензоилталатизамина, в условиях ФЭ-индуцированной контрактуры, наблюдалось и в бескальциевых растворах, развитие которой в основном обеспечивают ионы Са2+ высвобождаемые из СР. В этих условиях ФЭ вызывает сокращение препарата аорты крысы, которое на 70,4±4,1% меньше сокращения индуцируемого ФЭ в присутствии ионов Са2+. Добавление в этих условиях 14-О-бензоилталатизамин приводило к дополнительному снижению амплитуды сокращения на 21,1±3,8%. Результаты этих экспериментов свидетельствуют о том, что релаксантное действие 14-0-бензоилталатизамина, в условиях ФЭ-индуцированной контрактуры, в основном обусловлено его влиянием на поступление ионов Са2+ в ГМК через рецептор-управляемые Са2+-каналы плазмалеммы и на высвобождение из СР.
С целью уточнения участия Са2+-каналов L-типа в обеспечении релаксантного действия 14-0-БТ было изучено влияние на их эффекты блокатора этих каналов верапамила (ВП). В этих экспериментах было обнаружено, что в присутствии 0,1 мкМ ВП, концентрации соответствующей его IC50, исследуемый алкалоид сохранял способность пода-лять KCl-индуцируемые сокращения аорты, но в меньшей степени, чем в его отсутствии. При этом 14-О-БТ (250 мкМ) дополнительно подавлял силу сокращений аорты, индуцированных KCl, до 30,1±4,1%от контроля, соответственно. Из этих результатов следует, что в основе релаксантного действие алкалоида 14-О-БТ возможно лежит блокада Са2+-каналов L-типа. Однако, сохранение релаксантного эффекта исследуемого алкалоида в присутствии ВП указывает на то, что в его обеспечении, наряду с блокадой Са2+-каналов L-типа, может быть задействованы и другие механизмы транспорта ионов Са2+ в ГМК. Важную роль в регуляции
100 н
Са2+ гомеостаза в ГМК, наряду с потенциал-зависимыми Са2+-каналами L-типа, также играют рецептор-управляемые Са2+-каналы, которые активируются при стимуляции а-адренорецепторов (8,9). Активность сокращения гладкой мускулатуры связано с Са2+-каналами, которые запас-оперируемый Са2+-канал и рецептор-управляемый
(SOCC/ROCC) Са2+-каналом а также активацией IP3R [10,11]. Обычно в экспериментах при действии фармакологических агентов на изометрическое сокращение препарата гладкой мускулатуры кровеносных сосудов для оценки участия Са2+-транс-портных систем, SOCC/ROCC в качестве активатора используют фенилэфрин (1 мкМ), который является агонистом ai-адренорецептора (ai-AP) [12]. При действии фенилэфрина (1 мкМ) активация ai-AP посредством G-белка активируется фос-фолипаза С (PLC), в результате образуются фосфа-тидилинозитол 4,5-дифосфатдан инозитол 1,4,5-трифосфат (1Р3) и диацилгицерол (DAG) . Образовавшийся 1Р3 активирует рецептор инозитол 1,4,5-трифосфата (IP3R) на мембране СРи наблюдается выход [Са2+]ср в цитозоль. DAG участвует в механизме сокращения посредством активации проте-инкиназы С [13].
В связи с этим для оценки влияния исследуемого алкалоида на рецептор-управляемые Са2+"каналы были изучены их эффекты на сокращения препаратов аорты, индуцируемые агонистом а-ад-ренорецепторов - фенилэфрином (ФЭ). ФЭ индуцирует сокращения аорты, которые в присутствии верапамила в основном, обеспечиваются ионами Са2+, поступающими в ГМК через рецептор-управляе-мые Са2+ каналы (14.15].
В наших экспериментах ФЭ (1мкМ) в присутствии верапамила (0,1 мкМ) индуцировал сокращения аорты, сила которых была на 10,9±2.3% меньше силы сокращений, вызываемых им в отсутствии верапамила. Добавление в этих условиях алкалоида 14-О-БТ приводило к существенному подавлению силы ФЭ-индуцированных сокращений аорты, которая снижалась на 68,7±3,1% от контроля, соответственно (рис.2).
-А- ФЭ (1 мкМ)
**
10 100 14-О-БТ [Log (М)]
Рис.2. Влияние алкалоида 14-О-БТ на сокращения аорты крысы, индуцированные фенилэфрином.
Доза-зависимое действие 14-О-БТ на сокращения аорты крысы, индуцированные 1 мкМ ФЭ в присутствии 0,1 мкМ верапамила. По оси ординат сила сокращения аорты, выраженная в процентах от силы, индуцированной 1 мкМ ФЭ в отсутствии верапамила и принятой за 100%. По оси абсцисс -концентрация алкалоида 14-О-БТ.
Значения 1С50 для 14-О-БТ, полученные при этом составляло 60,1 мкМ, соответственно. Эти ре-
зультаты указывают на то, что наблюдаемый эффект исследуемого алкалоида может быть обусловлен блокадой рецептор-управляемых Са2+-каналов. Подтверждением этого являются эксперименты с блокатором а-адренорецепторов - фентоламином, в присутствии которого эффект алкалоида 14-О-БТ на ФЭ-индуцированные сокращения аорты уменьшалось на 44,7±3,0%, соответственно, от контроля, полученного в отсутствии фентоламина (рис.3.).
Рис.3. Влияние фентоламина (10мкМ) нарелаксантный эффект 14-О-БТ.
По оси ординат сила сокращения аорты, выраженная в процентах от силы, индуцированной 1 мкМ ФЭ принятой за 100%.(*р<0,05, **р<0,01; п=5-7).
Эти результаты свидетельствуют о том, что в обеспечении релаксантного эффекта исследуемого алкалоида 14-О-БТ, также может участвовать блокада рецептор-управляемых Са2+-каналов.
Для дальнейшей характеристики влияние 14-О-БТ на процесс высвобождения ионов Са2+из СР были изучены его эффекты на сокращения аорты индуцируемые кофеином. Кофеин вызывает прехо-
дящее сокращение гладкой мускулатуры, обусловленное увеличением уровня [Са2+^ в ГМК, которое обеспечивается в результате активации RyR при стимуляции Са2+-индуцированного высвобождения Са2+ из СР (16,17). В связи с этим для уточнения механизма действия исследуемого алкалоида на ко-феин-индуцированные сокращения аорты, были изучены его эффекты в условиях отсутствия ионов Са2+ в среде инкубации. В этих условиях кофеин вызывал сокращения аорты, сила которых составляла 33,3±3,4%, от силы, индуцируемой им в присутствии ионов Са2+.
100-,
CS =
X
9i
EJ
«
а
ы о
и «
ч =
U
806040200
Кофеин(10 мМ) [Ca2+]
Кофеин(10 мМ) [Ca2] =0
**_Кофеин(10 мМ)
"I 14-О-БТ (160 мкМ)
Рис.4.
Влияние 14-О-бензоилталатизамина на сокращения препаратов аорты крысы индуцируемые кофеином.
По оси ординат сила сокращения аорты, выраженная в процентах от контроля, полученного при действии 1 мкМ фенилэфрина и принятого за 100%,. (*p<0,05, **p<0,01; n=4-5).
Предварительная инкубация препаратов аорты в присутствии 14-О-БТ (160 мкМ) также сопровождалась существенным подавлением силы сокращений, которая снижалась до 20±3,4% от контроля, соответственно. Значения IC50 для 14-О-БТ, полученные в этих экспериментах, составляло 75,4 мкМ, соответственно.
Результаты этой серии экспериментов показали, что 14-О-БТ эффективно подавляет сокращения аорты, индуцированные фенилэфрином и кофеином в условиях отсутствия ионов Са2+ в среде инкубации. В связи с тем, что регистрируемые в этих условиях сокращения аорты обеспечиваются, в основном, ионами Са2+, высвобождаемыми из СР, эти результаты свидетельствуют о том, что наблюдаемые эффекты 14-О-БТ связаны с ингибированием функции IP3R.
Таким образом, анализ данных полученных в этих экспериментах показывает, что алкалоид 14-О-БТ эффективно расслабляет препараты аорты крысы предварительно сокращенные агонистом а-адренорецепторов фенлэфрином. Принимая во внимание то, что сокращения индуцируемые этим антагонистом в основном обусловлены активацией высвобождения ионов Са2+ из СР через IP3R можно заключить, что релаксантное действие исследуемого алкалоида обусловлено подавлением транспорта ионов Са2+ на уровне СР.
Список литературы
1. Roth G.A., Johnson С., Abajobir A., et al. Global, regional and national burden of cardiovascular diseases for 10 causes, 1990 to 2015. // J. Am. Coll. Cardiol. - 2017. - V.70. - P.1-25.
2. Wright P., Thomas M. Pathophysiology and management of heart failure // Clinical Pharmacist. -2018. - V.10 (12). - P.261-269.
3. Туляганов Н., Джахангиров Ф.Н., Садритди-нов Ф.С., Хамдамов И. "К фармакологии некоторых аконитиновых алкалоидов"; "Фармакология растительных веществ", 1976, с.76-93, Ташкент.
4. Джахангиров Ф.Н., Султанходжаев М.Н., Ташходжаев Б., Салимов Б.Т. Дитерпеноидные алкалоиды как новый класс антиаритмических средств. Химия Природ. Соед. 1997, 2, 257-270
5. Мирзаева Ю.Т., Султанходжаев М.Н*., Усманов П.Б. Характеристика релаксантного действия дитерпеноидных алкалоидов талатизамина и 14-Обензоилталатизамина //Узбекский Биологический Журнал.-2014.-№4.-с.3-8.
6. Karaki H., Ozaki H, Hori M., Nakazawa H., Won R., Sato K. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle // Pharmacol. Rev. - 1997. - V. 49 (2). - P. 157-230.
7. Sanders K.M. Signal Transduction in Smooth Muscle. Invited Review: Mechanisms of calcium handling in smooth muscles. J. Appl. Physiol. 2001., Vol. 91, pp. 1438-1449.
8. McFadzean I., Gibson A. The developing relationship between receptor-operated and store-operated calcium channels in smooth muscle // British Journal of Pharmacology - 2002. - V.135. - P. 1-13.
9. Jackson W.F. Ion channels and vascular tone // Hypertension. - 2000. - V.35(1-2). - P. 173-178.
10. Соловьев А.И. Ионные каналы как фармакологические мишени. Время смены парадигм классической фармакотерапии // Фармаколопя та лшарська токсиколопя. - 2013. - №6(36). - С.101-103.
11. Cherkaoui-Tangi K., Israili Z.H., Lyoussi B. Vasorelaxant effect of essential oil isolated from Nigella sativa L. seeds in rat aorta: Proposed mechanism // Pak. J. Pharm. Sci. - 2016. - V.29(1). -P.1-3.
12. Karaki H. Historical techniques: cytosolic Ca2+ and contraction in smooth muscle // Trends Pharmacol. Sci. - 2004. - V.25. - P.388-390.
13. Berrige M.J. Inositol triphosphate and calcium signaling // Nature. - 1993. - V.361. - P.315-317.
14. Wier W.G., Morgan K.G. Alpha- adrenergic signaling mechanism in contraction of resistance arteries // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. - 2003. -V.150. - P. 91-139.
15. Cribbs L.L. Vascular smooth muscle calcium channels could «Т» be a target? // Circ. Res. - 2001. -V.89. - P.560-562.
16. Watanabe С., Yamamoto I., Hirano K., Koba-yashi S., Kanaide H. Mechanisms of caffeine-induced contraction and relaxation of rat aortic smooth muscle // J Physiol. - 1992. - V.456. - P. 193-213.
17. Tykocki N.R., Thompson J.M., Jackson W.F., Watts S.W. Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava // Cell Calcium. - 2013. -V.53(2). - P. 112-119.
